4 Ergebnisse

↓37

Für die vorliegenden Versuche wurden mit OVCAR-3 und SKOV-3 zwei Zellinien des epithelialen Ovarialkarzinoms ausgewählt, die exemplarisch für COX-2-positive und COX-2-negative Tumoren stehen. Im Rahmen eines vorausgegangenen Projekts der Arbeitsgruppe war bereits gezeigt worden, daß die OVCAR-3-Zellen durch IL-1ß-Stimulation (10ng/ml) ihre COX-2-Expression hochregulieren [8] (vgl. auch 4.1.3:Abb.12). Dagegen konnte bei SKOV-3 keine COX-2-Expression nachgewiesen werden.

4.1 Beeinflussung der Zellproliferation durch Cyclooxygenase-2-Inhibition

↓38

In dieser Arbeit sollen zwei Methoden der COX-2-Inhibition miteinander verglichen werden:

  1. Die Hemmung des aktiven COX-2-Proteins durch den selektiven Inhibitor NS-398.
  2. Die Hemmung der COX-2-mRNA durch die Transfektion mit COX-2-siRNA (vgl. 3.6).

4.1.1 Einfluß von NS-398 auf die Proliferation

In den beiden Zellinien OVCAR-3 und SKOV-3 wurde der Einfluß des selektiven COX-2-Inhibitors NS-398 auf die Proliferation jeweils mit und ohne IL-1ß-Stimulation der COX-2-Expression im XTT-Test untersucht. NS-398 bewirkte stets eine dosisabhängige Proliferationshemmung (Abb.7). Dabei erreichte OVCAR-3 signifikante Unterschiede in der Proliferation im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle ab 50µM NS-398 (=1,28; p=0,011) bzw. 10µM NS-398/IL-1ß (=1,89; p=0,0001). SKOV-3 unterschied sich signifikant von der Kontrolle ab einer Inhibitorkonzentration von 100µM NS-398 (=3,49; p=7,5*10-6) bzw. 50µM NS-398/IL-1ß (=2,84; p=0,003). Bei SKOV-3 sind im Vergleich zu OVCAR-3 leicht höhere Inhibitorkonzentrationen notwendig, um eine signifikante Proliferationshemmung zu erzielen. Unter IL-1ß-Stimulation verringerte sich in beiden Zellinien die zum Erreichen des Signifikanzniveaus notwendige NS-398-Konzentration.

↓39

Abbildung 7 : Zellwachstumskurven, dargestellt in Prozent der Kontrolle für zwei Ovarialkarzinomzellinien nach Behandlung mit verschiedenen Konzentrationen von NS-398 (1µM-500µM) für 72h, unstimuliert oder unter COX-2-Stimulation durch IL-1ß (10ng/ml). Ergebnisse (Mittelwert und Standardfehler des Mittelwertes) aus drei unabhängigen Experimenten mit je Vierfachansätzen.

Um sicherzustellen, daß die Proliferationshemmung allein auf die Wirkung von NS-398 zurückzuführen ist, und nicht durch eventuelle Effekte des Lösungsmittels DMSO verursacht wird, wurde eine DMSO-Konzentrationsreihe aufgestellt.

Das Lösungsmittel DMSO zeigte keine Auswirkung auf die Proliferation (Abb.8). Gleiche Ergebnisse wurden auch ohne IL-1ß-Stimulation erzielt (nicht dargestellt).

↓40

Abbildung 8 : Einfluß des NS-398-Lösungsmittels DMSO auf die Proliferation unter COX-2-Stimulation mit IL-1ß (10ng/ml). Die höchste DMSO-Konzentration (5µM) entspricht der höchsten NS-398-Konzentration in allen gezeigten Experimenten (500µM). Ergebnisse (Mittelwert und Standardfehler des Mittelwertes) aus drei unabhängigen Experimenten mit je Vierfachansätzen.

4.1.1.1 Inhibition der PGE2-Produktion durch NS-398

Es sollte untersucht werden, bei welcher NS-398-Konzentration die Cyclooxygenase-2 in den OVCAR-3-Zellen inhibiert ist. Da PGE2 in den OVCAR-3 hauptsächlich von der COX-2 hergestellt wird (vgl. 4.1.3:Abb.14), gilt es als guter Indikator für die vorhandene Menge an aktiver COX-2. Somit wurde zur Überprüfung der COX-2-Funktion die Menge an PGE2 im Medium-Überstand der Zellen mittels eines PGE2-ELISA bestimmt.

Bei unbehandelten OVCAR-3-Zellen läßt sich eine PGE2-Produktion kaum nachweisen (Abb.9), die Meßwerte liegen unterhalb der Nachweisgrenze. Daher wurden die Messungen sowohl von der Kontrolle als auch von den mit NS-398 behandelten Zellen unter IL-1ß-Stimulation (24h) und somit im gut meßbaren PGE2-Level-Bereich durchgeführt.

↓41

Unter IL-1ß-Stimulation kam es zu einem deutlichen Anstieg der PGE2-Menge im Vergleich zur Kontrolle ohne IL-1ß. Dies ist auf die auch im Western Blot (4.1.3:Abb.12) beobachtete Induktion der COX-2 durch IL-1ß zurückzuführen. Es konnte weiterhin gezeigt werden, daß bereits bei einer Konzentration von 1µM NS-398 die PGE2-Produktion und somit die COX-2 in den OVCAR-3-Zellen vollständig gehemmt ist (Abb.9).

Abbildung 9: Produktion von PGE2 in OVCAR-3. Die Zellen wurden 48h mit verschiedenen Konzentrationen NS-398 (1µM-50µM) inkubiert und 24h vor Abnahme der Überstände mit
IL-1ß (10ng/ml) stimuliert. Ergebnisse (Mittelwert und Standardabweichung) von drei unabhängigen Experimenten.

4.1.1.2 PGE2-Einfluß auf die Proliferationshemmung durch NS-398

Weiterhin wurde der Einfluß von PGE2 auf den proliferationshemmenden Effekt von NS-398 und dessen Reversibilität untersucht. Als PGE2-Konzentration wurden 10µM in Anlehnung an Ming Li et al. [60] gewählt, da mit dieser Konzentration die Apoptoseinduktion durch NS-398 in Ösophaguskarzinomzellen antagonisiert werden konnte.

↓42

In der vorliegenden Untersuchung war die durch NS-398 bewirkte Proliferationshemmung weder in OVCAR-3 noch in SKOV-3 durch PGE2-Gabe reversibel (Abb.10).

Allerdings konnte durch PGE2 in den Kontrollen eine Proliferationssteigerung bewirkt werden. Insbesondere bei SKOV-3 zeigten die mit PGE2 behandelten Zellen eine 30%ige Zunahme der Proliferation gegenüber den unbehandelten Zellen (=1,41; p=0,002). Auch bei OVCAR-3 fand sich ein geringer, nur im t-Test signifikanter proliferationsfördernder Effekt (p=0,006).

Abbildung 10 : Zellwachstumskurven, dargestellt in Prozent der Kontrolle für zwei Ovarialkarzinomzellinien, nach Behandlung mit verschiedenen Konzentrationen von NS-398 (100-500µM) für 72h, mit und ohne PGE2-Zugabe (10µM). Ergebnisse (Mittelwert und Standardfehler des Mittelwertes) aus drei unabhängigen Experimenten mit je Vierfachansätzen.

4.1.2 Einfluß von Indomethacin auf die Proliferation

↓43

Viele Autoren konnten mit dem Einsatz unselektiver Cyclooxygenase-Inhibitoren gleiche Ergebnisse erzielen wie mit COX-2-spezifischer Hemmung. Daher wurde auch in dieser Arbeit der Proliferationseinfluß von Indomethacin, einem unspezifischer Inhibitor von COX-1 (IC50 0,013µM) und COX-2 (IC50 1,0µM) [15] untersucht. Die Proliferation von OVCAR-3 und SKOV-3 konnte ebenfalls dosisabhängig gehemmt werden (Abb.11).

Abbildung 11 : Zellwachstumskurven, dargestellt in Prozent der Kontrolle für zwei Ovarialkarzinomzellinien, nach Behandlung mit verschiedenen Konzentrationen von Indomethacin (50-500µM) für 72h. Ergebnisse (Mittelwert und Standardfehler des Mittelwertes) aus mindestens drei unabhängigen Experimenten.

Dabei zeigt SKOV-3 (signifikant bei 500µM Indomethacin, =2,03; p=8,7*10-6) im Vergleich zu OVCAR-3 (signifikant bei 50µM Indomethacin, =16,02; p=9,3*10-12) erst bei wesentlich höheren Konzentrationen ein vermindertes Wachstum. Eine geringere Empfindlichkeit der SKOV-3 war auch bereits bei der Gabe von NS-398 (vgl. 4.1.1) beobachtet worden.

4.1.3 Proliferationseinfluß von COX-1- und COX-2-siRNA

↓44

Die OVCAR-3-Zellen wurden mit COX-1-siRNA, COX-2-siRNA und mit Lamin A/C-siRNA als Kontrolle transfiziert.

Die COX-1 wurde aus folgendem Grund mituntersucht: In vorausgegangenen Untersuchungen zur Apoptoseinduktion durch COX-2-Inhibitoren in Tumorzellinien konnte die Apoptose meist nur durch vielfach höhere Konzentrationen als die zur Inhibition der COX-2 benötigten (vgl. 1.1.7:Tab.4) induziert werden. Da bei hohen Konzentrationen von COX-2-Inhibitoren auch die COX-1 unselektiv gehemmt wird (vgl. 1.1.4), wurde die COX-1 als potentielles Target ebenfalls in Betracht gezogen.

Die Funktionsfähigkeit der COX-2-siRNA konnte im Western Blot gezeigt werden: Es war nach Transfektion und 72-stündiger Inkubation keine COX-2-Bande mehr nachweisbar (Abb.12). Da die Funktionsfähigkeit der COX-2-siRNA auch im PGE2-ELISA nachgewiesen werden konnte (vgl. Abb.14) und in der Arbeitsgruppe bereits ausgiebig in mehreren Western Blots getestet worden war [95], wurde hier auf weitere Western Blots verzichtet.

↓45

Abbildung 12 : Western Blot: COX-2-Expression in OVCAR-3 nach COX-2-siRNA-Transfektion. Als Transfektionskontrolle diente Lamin A/C-siRNA. Inkubation für 72h und Stimulation mit IL-1ß (10ng/ml) 24h vor der Zellernte. Der ß-Aktin-Antikörper wurde als Western Blot Kontrolle benutzt zum Vergleich der jeweils aufgetragenen Proteinmengen.

Nach 72h Inkubation mit der jeweiligen siRNA wurde die Proliferation der Zellen im XTT-Test bestimmt. Um den durch den Vorgang der Transfektion ausgelösten Streß zu berücksichtigen, wurde Lamin A/C-siRNA in der höchsten siRNA-Konzentration von 60pM als Kontrolle eingesetzt. Dabei ergaben sich keine signifikanten Unterschiede in der Proliferation zwischen COX-1- und COX-2-siRNA zur Lamin A/C-siRNA-Transfektionskontrolle, während die Proliferation der mit NS-398 behandelten Zellen analog zu den Ergebnissen von 4.1.1. abnahm (Abb.13).

Abbildung 13 : Zellwachstum, dargestellt in Prozent der Kontrolle für OVCAR-3 nach Transfektion mit COX-1-, COX-2- und Lamin A/C-siRNA (jeweils 60pM) und Inkubation mit NS-398 (200µM) für 72h, mit IL-1ß-Stimulation (10ng/ml) Ergebnisse (Mittelwert und Standardabweichung) aus drei unabhängigen Experimenten.

↓46

Es wurde weiterhin untersucht, ob die Wachstumshemmung von NS-398 ebenfalls auftritt, wenn durch die siRNA die COX-1 bzw. COX-2 bereits ausgeschaltet sind, also die potentiellen Targets des Medikamentes nicht vorhanden bzw. stark reduziert vorhanden sind. Dabei konnten im XTT-Test gleichermaßen verstärkte Abnahmen der Zellzahl durch NS-398-Gabe sowohl bei siRNA-transfizierten als auch bei nicht transfizierten Zellen beobachtet werden (Ergebnisse nicht dargestellt).

4.1.3.1 PGE2-Synthese bei der COX-2-Auschaltung durch siRNA

Dazu wurde nach siRNA-Transfektion mit COX-1-siRNA und COX-2-siRNA die PGE2-Produktion unter IL-1ß-Stimulation gemessen. Als Kontrolle dienten Zellen, die nur mit dem Transfektionsreagenz Oligofectamin behandelt wurden.

Es zeigte sich eine 60prozentige Reduktion der PGE2-Produktion bei den COX-2-siRNA-transfizierten Zellen (Abb.14). Die COX-1-siRNA-Transfektion hat keinen Einfluß auf die PGE2-Produktion.

↓47

Abbildung 14 : Produktion von PGE2 bei OVCAR-3. Die Zellen wurden 72h mit der jeweiligen siRNA (60pM) bzw. als Kontrolle Oligofectamin inkubiert und 24h vor Abnahme der Überstände mit IL-1ß (10ng/ml) stimuliert. Ergebnisse (Mittelwerte und Standardabweichungen) von drei unabhängigen Experimenten.

4.2 Beeinflussung der Apoptose durch Cyclooxygenase-2-Inhibition

4.2.1 Einfluß von NS-398 auf die Apoptose

Die Frage, ob durch NS-398 in den untersuchten Zellinien Apoptose induziert wird, soll im folgenden untersucht werden: Dazu wurde durchflußzytometrisch sowohl mit der Nicoletti-Färbung als auch mit der Annexin V/PI–Färbung bei OVCAR-3- und SKOV-3-Zellen nach 72stündiger Inkubation mit NS-398 jeweils mit und ohne IL-1ß-Stimulation der prozentuale Zelltod gemessen. Bei dieser Bestimmung werden sowohl die im Medium-Überstand schwimmenden als auch die adhärenten Zellen erfaßt. Dies ist wichtig, weil die apoptotischen bzw. nekrotischen Zellen den Kontakt zu den vitalen Zellen verlieren und dann im Medium-Überstand frei flottieren.

Als Konzentration von NS-398 wurden 200µM eingesetzt, da bei dieser Konzentration im XTT-Test (vgl. 4.1.1) in beiden Zellinien eine deutliche Reduktion der Zellproliferation auftrat.

4.2.1.1 Apoptosemessung mit der Nicoletti-Färbung

↓48

Mit der Nicoletti-Methode war in beiden Zellinien bei Gabe von bis zu 200µM NS-398 ohne

IL-1ß-Stimulation keine Apoptose meßbar. Es gab keinen SubG1-Peak als Ausdruck von apoptotischer DNA-Fragmentierung (vgl. 3.8.2). Allerdings war der Prozentsatz toter Zellen bei gleichzeitiger Gabe von NS-398 (200µM) und IL-1ß in beiden Zellinien etwas erhöht (Abb.15).

Abbildung 15 : Nicoletti-Färbung und durchflußzytometrische Bestimmung von OVCAR-3 und SKOV-3 nach 72h Behandlung mit NS-398 (200µM) bzw. NS-398 und IL-1ß (10ng/ml). Der Zelltod wird angegeben in Prozent (unter dem Balken) aller gemessenen Zellen. Darstellung eines repräsentativen Experiments von drei Experimenten.

4.2.1.2 Apoptosemessung mit der Annexin V/PI-Färbung

↓49

Die Bestimmung der Apoptose mit der Annexin/PI-Färbung ist auch unter einem anderen Aspekt wichtig: Mit der Färbung läßt sich zwischen apoptotischem und nekrotischem Zelltod unterscheiden (vgl. 3.8.1).

Es konnte weder bei OVCAR-3 noch bei SKOV-3 vermehrte Apoptose bei Gabe von NS-398 mit und ohne IL-1ß-Stimulation nachgewiesen werden (Abb.16).

Es wurde durch NS-398 (bis 200µM) ohne IL-1ß in beiden Zellinien auch keine vermehrte Nekrose beobachtet.

↓50

IL-1ß jedoch führte in OVCAR-3 zu meßbarer Nekrose: Es zeigte sich bei OVCAR-3 unter

IL-1ß-Stimulation bereits in der Kontrolle eine signifikante Zunahme der Nekrose (=6,29; p=0,009) auf 22% gegenüber unbehandelten Zellen (5%).

Im Unterschied zu der alleinigen NS-398-Behandlung der Zellen, die keine Veränderungen der Zellvitalität zur Folge hatte, gab es in der Kombination von 200µM NS-398 mit IL-1ß in beiden Zellinien eine deutliche Zunahme vor allem des nekrotischen Zelltods: In den OVCAR-3-Zellen steigt die Rate an nekrotischem Zelltod auf 57% gegenüber der IL-1ß-Kontrolle (22%) bei zusätzlicher Gabe von 200µM NS-398 (=2,78; p=0,039). Auch in SKOV-3 steigt der Anteil nekrotischer Zellen bei Gabe von 200µM NS-398 in Kombination mit IL-1ß auf 35% gegenüber 14% in den nur mit IL-1ß behandelten Zellen, wobei das Signifikanzniveau deutlich erreicht wird (=1,62; p=0,0008). Bei 50µM NS-398/IL-1ß treten dagegen in beiden Zellinien noch keine signifikanten Veränderungen gegenüber den nur mit IL-1ß behandelten Zellen auf.

↓51

Auf die bereits von anderen Autoren beschriebenen zytotoxischen Effekte von IL-1ß soll im Rahmen der Diskussion dieser Arbeit (5.1.3) näher eingegangen werden.

Abbildung 16 : Zelltod in % bei OVCAR-3 und SKOV-3 nach Behandlung mit NS-398 (50µM und 200µM) und NS-398 mit IL-1ß-Stimulation (10ng/ml) für 72h. Der Zelltod wurde mit der Annexin V/PI-Färbung bestimmt. Als Kontrolle diente das NS-398-Lösungsmittel DMSO in der höchsten Inhibitor-Konzentration. Die dargestellten Ergebnisse sind Mittelwerte und Standardabweichungen aus drei unabhängigen Experimenten.

4.2.2 Einfluß auf die Apoptose durch COX-1-, COX-2-siRNA

Analog zu den Apoptosebestimmungen bei der COX-2-Inhibition durch NS-398 wurde der Einfluß von der COX-2-Ausschaltung durch RNA-Interferenz auf die Apoptose bei OVCAR-3 mittels Nicoletti- und Annexin V/PI-Färbung bestimmt. Die SKOV-3-Zellen wurden nicht untersucht, da diese Zellen COX-2-negativ sind.

↓52

In beiden Verfahren zur Apoptosemessung konnte bei den mit COX-1- bzw. COX-2-siRNA transfizierten OVCAR-3-Zellen im Vergleich zur Transfektionskontrolle mit Lamin A/C-siRNA keine vermehrte Apoptose festgestellt werden (Abb.17;18). Auch die Co-Transfektion mit COX-1- und COX-2-siRNA führte nicht zu vermehrter Apoptose oder Nekrose.

Die Grundapoptoserate in der Kontrolle (gemessen mit der Nicoletti-Färbung) liegt jedoch im Vergleich zu unbehandelten Zellen (vgl. 4.2.1) bereits bei 10% vermutlich aufgrund der Toxizität des Transfektionsreagenzes (Abb.17). Im Annexin V/PI-Assay ist die Zahl PI-positiver Zellen im oberen linken Quadranten bereits bei der Transfektionskontrolle 15%, was ebenfalls für eine nekrotisch-toxische Schädigung durch den Vorgang der Transfektion spricht (Abb.18).

Abbildung 17 : Auswirkung der siRNA-Transfektion auf die Apoptose. OVCAR-3 wurden für 48h mit der Transfektionskontrolle Lamin A/C-siRNA, COX-1-siRNA, COX-2-siRNA (je 60pM) bzw. COX-1/COX-2-siRNA (je 30pM) inkubiert, mit der Nicoletti-Methode aufbereitet und durchflußzytometrisch bestimmt. Die Apoptoserate ist unterhalb des Markers in Prozent dargestellt. Gezeigt ist ein repräsentatives Experiment von drei unabhängigen Experimenten.

↓53

Abbildung 18 : Auswirkung der siRNA-Transfektion auf die Apoptose. OVCAR-3 wurden für 48h mit der Transfektionskontrolle Lamin A/C-siRNA, COX-1-siRNA, COX-2-siRNA (je 60pM) bzw. COX-1/COX-2-siRNA (je 30pM) inkubiert, mit Annexin V-FITC/PI gefärbt und durchflußzytometrisch bestimmt. Die Apoptoserate ist innerhalb bzw. neben den Quadranten in Prozent dargestellt. Ein repräsentatives Experiment von drei unabhängigen Experimenten mit
48-72h-Inkubation.

4.3 COX-2-Inhibition - Einfluß auf den Zellzyklus

4.3.1 Einfluß von NS-398 auf den Zellzyklus

Die in den XTT-Tests (vgl. 4.1.1) gezeigte Abnahme der Zellproliferation unter NS-398-Gabe läßt eine Arretierung des Zellzyklus vermuten, da sich keine Hinweise auf apoptotische oder nekrotische Zellschädigungen durch NS-398 (ohne IL-1ß) als Ursache für die verminderte Zellzahl finden ließen (vgl. 4.2.1).

Mit der Nicoletti-Methode konnte in beiden untersuchten Zellinien durchflußzytometrisch ein Anwachsen des G1-Peaks mit steigender Konzentration von NS-398 festgestellt werden (Abb.19). Dies deutete auf einen G0/G1-Arrest des Zellzyklus hin. Dazu wurden die Peaks mit der Software ModFit analysiert, und die Vermutung des G0/G1-Arrestes konnte sowohl in OVCAR-3 als auch in SKOV-3 bestätigt werden (Tab.5).

↓54

Diese 10-15prozentige Zunahme der in der G0/G1-Phase befindlichen Zellen nach NS-398-Gabe trat sowohl unter IL-1ß-Stimulation als auch ohne Zytokingabe auf. Insgesamt war das Niveau des G1-Arrestes unter NS-398 ohne IL-1ß-Stimulation in den OVCAR-3-Zellen höher als bei SKOV-3. OVCAR-3 lag aber auch in den Kontrollen bereits auf einem höheren G1-Niveau. In der NS-398/IL-1ß-Kombination dagegen zeigte SKOV-3 einen stärkeren G1-Arrest als OVCAR-3. In 4.2.1 war bereits gezeigt worden, daß die OVCAR-3 auf diese Stimulation mit einer starken Zunahme an nekrotischem Zelltod reagieren. Bei den SKOV-3 fiel diese Wirkung schwächer aus.

Abbildung 19 : Effekt von NS-398 und IL-1ß auf den Zellzyklus in zwei Zellinien OVCAR-3 und SKOV-3. Die Zellen wurden 24h mit NS-398 (200µM) bzw. NS-398 und IL-1ß (10ng/ml) inkubiert. Als Kontrolle diente das Lösungsmittel DMSO. Die Zellen wurden mit der Nicoletti-Methode aufbereitet und durchflußzytometrisch bestimmt. Ergebnis eines repräsentativen Experiments von mindestens drei unabhängigen Experimenten.

Tabelle 5 : Effekt von NS-398 und IL-1ß auf den Zellzyklus in zwei Zellinien OVCAR-3 und SKOV-3. Die Zellen wurden 24h mit NS-398 (200µM) bzw. NS-398 und IL-1ß (10ng/ml) inkubiert. Als Kontrolle diente das Lösungsmittel DMSO. Die Zellen wurden mit der Nicoletti-Methode aufbereitet und durchflußzytometrisch bestimmt. Ergebnisse (Mittelwert und Standardabweichung) von mindestens drei unabhängigen Experimenten. t-Test: zweiseitig, gepaart, * NS-398 vs. Kontrolle; +NS-398/IL-1ß vs. Kontrolle/IL-1ß

 

Zellzyklus-

phase

Kontrolle

NS-398 200µM

Kontrolle

IL-1ß

NS-398 200µM

IL-1ß

OVCAR-3

G0/G1

40,2 2,5

53,0 6,7

*p=0,0002

30,62,4

41,95,0

+p=0,0175

 

S

32,83,2

26,04,0

*p=0,0004

33,73,0

30,31,5

+p=0,0562

 

G2/M

27,01,8

21,03,6

*p=0,0066

35,63,3

27,83,9

+p=0,0320

SKOV-3

G0/G1

34,5 3,7

43,5 5,2

*p=0,0004

31,73,9

46,41,5

+p=7,3*10-5

 

S

36,33,0

31,31,9

*p=0,001

40,23,3

31,31,6

+p=5,2*10-5

 

G2/M

29,23,0

25,25,6

*p=0,002

28,11,6

22,32,2

+p=0,002

4.3.2 Beeinflussung des Zellzyklus durch COX-1- und COX-2-siRNA

↓55

Bei der Transfektion mit COX-1-siRNA und COX-2-siRNA konnte in keinem Fall eine signifikante Zunahme der in der G0/G1-Phase befindlichen Zellen im Vergleich zur Transfektionskontrolle festgestellt werden (Abb.20;Tab.6). Auch in den anderen Phasen des Zellzyklus traten keine signifikanten Veränderungen gegenüber der Kontrolle auf.

Abbildung 20 : Effekt der Transfektion mit COX-2-siRNA (60pM) auf den Zellzyklus bei OVCAR-3. Die Zellen wurden nach 24h Inkubation mit siRNA geerntet, mit der Nicoletti-Methode aufbereitet und durchflußzytometrisch bestimmt. Ergebnis eines repräsentativen Experiments von mindestens drei unabhängigen Experimenten.

Tabelle 6 : Effekt der siRNA-Transfektion auf den Zellzyklus bei OVCAR-3. Die Zellen wurden nach 24h Inkubation mit siRNA (je 60pM) mit und ohne IL-1ß-Stimulation (10ng/ml) geerntet, mit der Nicoletti-Methode aufbereitet und durchflußzytometrisch bestimmt. Ergebnisse (Mittelwert und Standardabweichung) von mindestens drei unabhängigen Experimenten

Zellzyklusphase

Transfektionskontrolle

COX-1-siRNA

COX-2-siRNA

G0/G1

36,33,5

37,91,0

36,52,0

S

35,52,8

35,31,0

34,41,4

G2/M

28,22,5

26,82,0

29,12,0

    

Zellzyklusphase

Transfektionskontrolle

IL-1ß

COX-1-siRNA

IL-1ß

COX-2-siRNA

IL-1ß

G0/G1

24,50,8

29,52,2

28,31,9

S

36,72,9

33,71,6

35,12,4

G2/M

38,83,7

36,83,7

36,60,5

4.3.3 Einfluß von NS-398 auf die S-Phase des Zellzyklus

↓56

Aus den Ergebnissen der Zellzyklusanalyse von 4.3.1 konnte eine Zunahme der in der G0/G1-Phase befindlichen Zellen registriert werden. Daraufhin wurde mit der BrdU-Färbung (vgl. 3.8.2) untersucht, inwieweit die S-Phase durch die Akkumulation der Zellen in der G1-Phase vermindert wird.

In beiden Zellinien konnte bei Gabe von NS-398 (200µM) eine Abnahme der S-Phase um ca. 10% gemessen werden (Abb.21): signifikant in den OVCAR-3 (=1,72), nicht signifikant bei SKOV-3. Bei dieser Untersuchungsmethode wurde in beiden Zellinien eine etwas stärkere Reduzierung der S-Phase gemessen als dies anhand der Zellzyklusanalyse (4.3.1) deutlich war.


Abbildung 21 : Effekt von NS-398 auf die S-Phase der Zellinien OVCAR-3 und SKOV-3. Die Zellen wurden 24h mit NS-398 (200µM) inkubiert. Als Kontrolle diente das Lösungsmittel DMSO. Die Zellen wurden mit der BrdU-Methode aufbereitet und durchflußzytometrisch bestimmt. Die S-Phase wurde mit der Software CellQuest analysiert. Ergebnis (Mittelwert und Standardabweichung) von drei (OVCAR-3) bzw. zwei (SKOV-3) unabhängigen Experimenten.


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17.01.2005