1 Einleitung

• 1.1 Das klassische Target der NSAIDs: Die Cyclooxygenase

  • 1.1.1 Die physiologische Rolle der Cyclooxygenase

  • 1.1.2 Die Prostaglandine

  • 1.1.3 Die Isoformen der Cyclooxygenase

  • 1.1.4 Inhibitoren der COX-1 und COX-2 - selektive COX-Hemmer

  • 1.1.5 COX-2-Expression und Malignität

  • 1.1.6 Erklärungsmodelle zu den tumorigenen Eigenschaften der COX-2

    • 1.1.6.1 Inhibition der Apoptose – Steigerung der Proliferation

    • 1.1.6.2 Steigerung der Angiogenese

    • 1.1.6.3 Steigerung der Invasivität

    • 1.1.6.4 Modulation von Inflammation und Immunosuppression

    • 1.1.6.5 Konversion von Prokarzinogenen zu Karzinogenen

  • 1.1.7 Chemotherapie mit COX-2-Inhibitoren

    • 1.1.7.1 Apoptoseinduktion

    • 1.1.7.2 Beeinflussung der Invasivität und Metastasierung

    • 1.1.7.3 Hemmung der Zellproliferation

• 1.2 Die non-COX-Targets

  • 1.2.1 Targets in Signaltransduktionswegen der Apoptose

  • 1.2.2 Targets mit Einfluß auf die Zellproliferation

• 1.3 Ovarialkarzinome, COX-2 und NSAIDs

2 Zielstellung

3 Material und Methoden

• 3.1 Antikörper, Chemikalien und Kits

• 3.2 Instrumente, Software und Verbrauchsmaterial

• 3.3 Gele, Puffer und Lösungen

• 3.4 Zellinien und Zellkultur

• 3.5 XTT-Proliferationsassay

• 3.6 siRNA-Transfektion

• 3.7 PGE2-ELISA

• 3.8 Durchflußzytometrie

  • 3.8.1 Annexin V/PI

    • 3.8.1.1 Der Zellzyklus in der Durchflußzytometrie

  • 3.8.2 DNA-Färbung nach Nicoletti

  • 3.8.3 BrdU/PI-Labeling

• 3.9 Western Blot

• 3.10 Signifikanztestung

4 Ergebnisse

• 4.1 Beeinflussung der Zellproliferation durch Cyclooxygenase-2-Inhibition

  • 4.1.1 Einfluß von NS-398 auf die Proliferation

    • 4.1.1.1 Inhibition der PGE2-Produktion durch NS-398

    • 4.1.1.2 PGE2-Einfluß auf die Proliferationshemmung durch NS-398

  • 4.1.2 Einfluß von Indomethacin auf die Proliferation

  • 4.1.3 Proliferationseinfluß von COX-1- und COX-2-siRNA

    • 4.1.3.1 PGE2-Synthese bei der COX-2-Auschaltung durch siRNA

• 4.2 Beeinflussung der Apoptose durch Cyclooxygenase-2-Inhibition

  • 4.2.1 Einfluß von NS-398 auf die Apoptose

    • 4.2.1.1 Apoptosemessung mit der Nicoletti-Färbung

    • 4.2.1.2 Apoptosemessung mit der Annexin V/PI-Färbung

  • 4.2.2 Einfluß auf die Apoptose durch COX-1-, COX-2-siRNA

• 4.3 COX-2-Inhibition - Einfluß auf den Zellzyklus

  • 4.3.1 Einfluß von NS-398 auf den Zellzyklus

  • 4.3.2 Beeinflussung des Zellzyklus durch COX-1- und COX-2-siRNA

  • 4.3.3 Einfluß von NS-398 auf die S-Phase des Zellzyklus

5 Diskussion

• 5.1 Einfluß von NS-398 auf Proliferation und Apoptose von Ovarialkarzinomzellinien

  • 5.1.1 NS-398 führt in den untersuchten Zellinien OVCAR-3 und SKOV-3 zu Proliferations-hemmung durch Akkumulation der Zellen in der G0/G1-Phase

  • 5.1.2 Die Transfektion von OVCAR-3 mit COX-1- bzw. COX-2-siRNA bewirkt keine Proliferationshemmung

  • 5.1.3 NS-398 bewirkt keine Apoptose in den Zellinien OVCAR-3 und SKOV-3

  • 5.1.4 Die Transfektion von OVCAR-3 mit COX-1- bzw. COX-2-siRNA bewirkt keine Apoptose

  • 5.1.5 Die durch NS-398 induzierte Proliferationshemmung ist vermutlich COX-1- und COX-2-unabhängig

• 5.2 Mögliche Zellzyklus-Targets der NSAIDs

• 5.3 Apoptosepriming durch NSAIDs – klinische Perspektiven

6 Zusammenfassung und Ausblick

Literaturverzeichnis

Eidesstattliche Erklärung

Danksagung

Tabelle 1 : Auswahl von Funktionen und Rezeptoren der Prostaglandine [6,12]

Tabelle 2 : Die Isoenzyme der Cyclooxygenase [7,13]

Tabelle 3 : Experimentelle Untersuchungen zum Zusammenhang von Tumormalignität und COX-2-Expression

Tabelle 4 : Experimentelle Hinweise für Apoptoseinduktion durch COX-2-Hemmer im Zellinien-modell

Tabelle 5 : Effekt von NS-398 und IL-1ß auf den Zellzyklus in zwei Zellinien OVCAR-3 und SKOV-3. Die Zellen wurden 24h mit NS-398 (200µM) bzw. NS-398 und IL-1ß (10ng/ml) inkubiert. Als Kontrolle diente das Lösungsmittel DMSO. Die Zellen wurden mit der Nicoletti-Methode aufbereitet und durchflußzytometrisch bestimmt. Ergebnisse (Mittelwert und Standardabweichung) von mindestens drei unabhängigen Experimenten. t-Test: zweiseitig, gepaart, * NS-398 vs. Kontrolle; ⁺NS-398/IL-1ß vs. Kontrolle/IL-1ß

Tabelle 6 : Effekt der siRNA-Transfektion auf den Zellzyklus bei OVCAR-3. Die Zellen wurden nach 24h Inkubation mit siRNA (je 60pM) mit und ohne IL-1ß-Stimulation (10ng/ml) geerntet, mit der Nicoletti-Methode aufbereitet und durchflußzytometrisch bestimmt. Ergebnisse (Mittelwert und Standardabweichung) von mindestens drei unabhängigen Experimenten

  Tabelle 7 : Proliferationshemmung durch selektive COX-2-Inhibitoren und Expressions-steigerung (↑) oder Expressionsminderung (↓) von Zellzyklusproteinen als mögliche Targets der NSAIDs

Abbildung 1 : Die Phospholipase A₂ spaltet aus Membranphospholipiden die Arachidonsäure ab. Durch die Cyclooxygenase wird zunächst die Säure durch Oxidation zum instabilen Prostaglandin G₂ zyklisiert und anschließend durch die Peroxidaseaktivität der COX zum Prostaglandin H₂ (PGH₂) oxidiert. Ausgehend davon werden je nach enzymatischer Ausstattung der Zelle weitere Prostaglandine hergestellt.

Abbildung 2 : Selektivitäten der NSAIDs nach Warner [15]

Abbildung 3: Darstellung der Inhalte der Quadranten bei der Annexin V-FITC/PI-Messung

Abbildung 4: Phasen des Zellzyklus im DNA-Histogramm

Abbildung 5 : SubG1-Peak als Ausdruck von apoptotischer DNA-Fragmentierung

Abbildung 6 : Darstellung der S-Phase des Zellzyklus mittels BrdU-Färbung

Abbildung 7 : Zellwachstumskurven, dargestellt in Prozent der Kontrolle für zwei Ovarialkarzinomzellinien nach Behandlung mit verschiedenen Konzentrationen von NS-398 (1µM-500µM) für 72h, unstimuliert oder unter COX-2-Stimulation durch IL-1ß (10ng/ml). Ergebnisse (Mittelwert und Standardfehler des Mittelwertes) aus drei unabhängigen Experimenten mit je Vierfachansätzen.

Abbildung 8 : Einfluß des NS-398-Lösungsmittels DMSO auf die Proliferation unter COX-2-Stimulation mit IL-1ß (10ng/ml). Die höchste DMSO-Konzentration (5µM) entspricht der höchsten NS-398-Konzentration in allen gezeigten Experimenten (500µM). Ergebnisse (Mittelwert und Standardfehler des Mittelwertes) aus drei unabhängigen Experimenten mit je Vierfachansätzen.

Abbildung 9: Produktion von PGE2 in OVCAR-3. Die Zellen wurden 48h mit verschiedenen Konzentrationen NS-398 (1µM-50µM) inkubiert und 24h vor Abnahme der Überstände mit  IL-1ß (10ng/ml) stimuliert. Ergebnisse (Mittelwert und Standardabweichung) von drei unabhängigen Experimenten.

Abbildung 10 : Zellwachstumskurven, dargestellt in Prozent der Kontrolle für zwei Ovarialkarzinomzellinien, nach Behandlung mit verschiedenen Konzentrationen von NS-398 (100-500µM) für 72h, mit und ohne PGE2-Zugabe (10µM). Ergebnisse (Mittelwert und Standardfehler des Mittelwertes) aus drei unabhängigen Experimenten mit je Vierfachansätzen.

Abbildung 11 : Zellwachstumskurven, dargestellt in Prozent der Kontrolle für zwei Ovarialkarzinomzellinien, nach Behandlung mit verschiedenen Konzentrationen von Indomethacin (50-500µM) für 72h. Ergebnisse (Mittelwert und Standardfehler des Mittelwertes) aus mindestens drei unabhängigen Experimenten.

Abbildung 12 : Western Blot: COX-2-Expression in OVCAR-3 nach COX-2-siRNA-Transfektion. Als Transfektionskontrolle diente Lamin A/C-siRNA. Inkubation für 72h und Stimulation mit IL-1ß (10ng/ml) 24h vor der Zellernte. Der ß-Aktin-Antikörper wurde als Western Blot Kontrolle benutzt zum Vergleich der jeweils aufgetragenen Proteinmengen.

Abbildung 13 : Zellwachstum, dargestellt in Prozent der Kontrolle für OVCAR-3 nach Transfektion mit COX-1-, COX-2- und Lamin A/C-siRNA (jeweils 60pM) und Inkubation mit NS-398 (200µM) für 72h, mit IL-1ß-Stimulation (10ng/ml) Ergebnisse (Mittelwert und Standardabweichung) aus drei unabhängigen Experimenten.

Abbildung 14 : Produktion von PGE2 bei OVCAR-3. Die Zellen wurden 72h mit der jeweiligen siRNA (60pM) bzw. als Kontrolle Oligofectamin inkubiert und 24h vor Abnahme der Überstände mit IL-1ß (10ng/ml) stimuliert. Ergebnisse (Mittelwerte und Standardabweichungen) von drei unabhängigen Experimenten.

Abbildung 15 : Nicoletti-Färbung und durchflußzytometrische Bestimmung von OVCAR-3 und SKOV-3 nach 72h Behandlung mit NS-398 (200µM) bzw. NS-398 und IL-1ß (10ng/ml). Der Zelltod wird angegeben in Prozent (unter dem Balken) aller gemessenen Zellen. Darstellung eines repräsentativen Experiments von drei Experimenten.

Abbildung 16 : Zelltod in % bei OVCAR-3 und SKOV-3 nach Behandlung mit NS-398 (50µM und 200µM) und NS-398 mit IL-1ß-Stimulation (10ng/ml) für 72h. Der Zelltod wurde mit der Annexin V/PI-Färbung bestimmt. Als Kontrolle diente das NS-398-Lösungsmittel DMSO in der höchsten Inhibitor-Konzentration. Die dargestellten Ergebnisse sind Mittelwerte und Standardabweichungen aus drei unabhängigen Experimenten.

Abbildung 17 : Auswirkung der siRNA-Transfektion auf die Apoptose. OVCAR-3 wurden für 48h mit der Transfektionskontrolle Lamin A/C-siRNA, COX-1-siRNA, COX-2-siRNA (je 60pM) bzw. COX-1/COX-2-siRNA (je 30pM) inkubiert, mit der Nicoletti-Methode aufbereitet und durchflußzytometrisch bestimmt. Die Apoptoserate ist unterhalb des Markers in Prozent dargestellt. Gezeigt ist ein repräsentatives Experiment von drei unabhängigen Experimenten.

Abbildung 18 : Auswirkung der siRNA-Transfektion auf die Apoptose. OVCAR-3 wurden für 48h mit der Transfektionskontrolle Lamin A/C-siRNA, COX-1-siRNA, COX-2-siRNA (je 60pM) bzw. COX-1/COX-2-siRNA (je 30pM) inkubiert, mit Annexin V-FITC/PI gefärbt und durchflußzytometrisch bestimmt. Die Apoptoserate ist innerhalb bzw. neben den Quadranten in Prozent dargestellt. Ein repräsentatives Experiment von drei unabhängigen Experimenten mit  48-72h-Inkubation.

Abbildung 19 : Effekt von NS-398 und IL-1ß auf den Zellzyklus in zwei Zellinien OVCAR-3 und SKOV-3. Die Zellen wurden 24h mit NS-398 (200µM) bzw. NS-398 und IL-1ß (10ng/ml) inkubiert. Als Kontrolle diente das Lösungsmittel DMSO. Die Zellen wurden mit der Nicoletti-Methode aufbereitet und durchflußzytometrisch bestimmt. Ergebnis eines repräsentativen Experiments von mindestens drei unabhängigen Experimenten.

Abbildung 20 : Effekt der Transfektion mit COX-2-siRNA (60pM) auf den Zellzyklus bei OVCAR-3. Die Zellen wurden nach 24h Inkubation mit siRNA geerntet, mit der Nicoletti-Methode aufbereitet und durchflußzytometrisch bestimmt. Ergebnis eines repräsentativen Experiments von mindestens drei unabhängigen Experimenten.

Abbildung 21 : Effekt von NS-398 auf die S-Phase der Zellinien OVCAR-3 und SKOV-3. Die Zellen wurden 24h mit NS-398 (200µM) inkubiert. Als Kontrolle diente das Lösungsmittel DMSO. Die Zellen wurden mit der BrdU-Methode aufbereitet und durchflußzytometrisch bestimmt. Die S-Phase wurde mit der Software CellQuest analysiert. Ergebnis (Mittelwert und Standardabweichung) von drei (OVCAR-3) bzw. zwei (SKOV-3) unabhängigen Experimenten.