Dissertation

Die Wirkung von systemisch appliziertem rekombinantem speziesspezifischem
Wachstumshormon auf den Knochenumbau am Achsenskelett.
Histologische und histomorphometrische Untersuchungen bei der
Distraktionsosteogenese am Yucatan-Minischwein.

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae
(Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät der Charité -
Universitätsmedizin Berlin

von
Julia Funk
aus Berlin

Dekan: Prof. Dr. med. M. Paul

Gutachter:
1. PD Dr. med. C. Perka
2. Prof. Dr. med. M. J. Raschke
3. Prof. Dr. med. R. Gradinger

Datum der Promotion:11. Oktober 2004

Abstrakt

Die Auswirkung der systemischen Applikation von 100µg/kg/KG rekombinantem speziesspezifischem Wachstumshormon (GH) über 26 Tage auf den Knochenumbau des Yucatan-Minischweins wurde an Wirbelkörpern, Beckenkämmen und Rippen histomorphometrisch untersucht. Der Einfluss der Distraktionsosteogenese auf die Mineralappositionsrate wurde ermittelt.

24 Tiere wurden an der linken Tibia osteotomiert, ein Fixateur externe wurde zur Distraktionsosteogenese von 2mm/d angelegt. 12 Tiere erhielten Wachstumshormon, 12 Placebo. Eine polychrome Fluoreszenzmarkierung wurde i.v. appliziert. Post mortem wurden Schnitte und Dünnschliffe der genannten Knochen angefertigt. Mittels Bildanalysesystem erfolgte die histomorphometrische Auswertung anhand der Parameter Knochendichte, Porosität, Trabekeldicke, Trabekelumbauparameter und Mineralappositionsrate (MAR).

Signifikante Veränderungen durch Wachstumshormongabe konnten gezeigt werden. Unterschiede zwischen den Lokalisationen traten auf. So war die Knochendichte der GH-Tiere an Wirbelkörpern und Rippen signifikant geringer als in der Placebogruppe, kein signifikanter Unterschied zeigte sich am Beckenkamm. An allen 3 Lokalisationen war in der Wachstumshormongruppe eine signifikant erhöhte kortikale Porosität zu finden. Nur am Wirbelkörper waren die trabekuläre Knochendichte und die Trabekeldicke bei den GH-Tieren signifikant geringer als bei den Kontrolltieren. Die Knochenresorption war in der GH-Gruppe am Beckenkamm signifikant erhöht. Die Formation war bei den GH-Tieren sowohl iliakal als auch vertebral signifikant erhöht. Insgesamt ergab sich damit ein signifikant verminderter Anteil an ruhender Oberfläche bei den GH-Tieren. In ihrer Ausprägung waren diese Parameter zwischen Wirbel und Beckenkamm signifikant verschieden. Die MAR war in der GH-Gruppe signifikant höher als in der Placebogruppe, außerdem war sie während der Distraktionsphase signifikant höher als während der Konsolidierungsphase.

Vergleicht man die Parameter mit Angaben aus der Literatur, kann bestätigt werden, dass die hier verwendeten Messmethoden geeignet sind, und dass das Yucatan-Minischwein ein geeignetes Modell zur Klärung von Fragestellungen der Knochenbiologie auch im Hinblick auf den Vergleich zum Menschen darstellt.

Eigene Schlagworte: Wachstumshormon, Knochenumbau, Distraktionsosteogenese, Histomorphometrie

Abstract

The effect of systemic application of 100 µg/kg recombinant species specific growth hormone (GH) on the bone remodelling of 24 Yucatan mini pigs for a duration of 26 days was evaluated on vertebral body, iliac crest, and rib. The influence of distraction osteogenesis on the mineral apposition rate (MAR) was examined.

24 animals were osteotomized at the left tibia and treated with an external fixator for distraction osteogenesis of 2 mm/d. 12 of them received GH, the others placebo. A sequential polychrome fluorescent labelling was applied. After sacrifice thin and ground sections were manufactured. Using an image analysis system, a histomorphometrical evaluation was performed by means of bone density, porosity, trabecular thickness, trabecular remodelling parameters, and mineral apposition rate (MAR).

Significant changes after GH application were visible. Differences between the locations were found. The bone density of vertebrae and ribs of the treatment group was significantly lower than that of the placebo group, whereas no difference was seen in the iliac crest biopsies. All 3 locations showed a significantly higher cortical porosity in the GH group. The trabecular bone density and the trabecular thickness were significantly decreased only in the vertebral bodies of the treatment group. The bone resorption was significantly elevated in the iliac crests of the GH group. The bone formation was increased in the iliac crest as well as in the vertebrae of the GH treated animals. Therefore, the resting surface was significantly decreased in the GH group. The extent of these effects was significantly different between iliac crest and vertebral body. The MAR was significantly higher in the GH group and during distraction osteogenesis.

Compared to results of other study groups these parameters validate the methods of measurement and show that the Yucatan mini pig is a suitable model for research concerning bone biology, especially concerning the comparison with human parameters.

Keywords: growth hormone, bone remodelling, distraction osteogenesis, histomorphometry

Inhaltsverzeichnis

• 1 Stand des Wissens
  • 1.1 Anatomie, Physiologie und Biologie des Knochens
    • 1.1.1 Funktion des Knochens
    • 1.1.2 Biologie des Knochens
      • 1.1.2.1 Zellen
      • 1.1.2.2 Matrix
    • 1.1.3 Umbau des Knochens
      • 1.1.3.1  Origination und Aktivierung
      • 1.1.3.2 Resorption
      • 1.1.3.3 Formation und Mineralisation
      • 1.1.3.4 Kopplung
    • 1.1.4 Anatomie des Knochens
      • 1.1.4.1 Kortikaler Knochen
      • 1.1.4.2 Spongiöser Knochen
    • 1.1.5 Vergleich des Knochens von Mensch und Schwein
    • 1.1.6 Systemische Auswirkungen von Skelettverletzungen
    • 1.1.7 Distraktionsosteogenese
  • 1.2 Wachstumshormon
    • 1.2.1 Struktur und Bildung
      • 1.2.1.1 Ort der Bildung
      • 1.2.1.2 Aufbau
    • 1.2.2 Hypothalamus-Hypophysen-Achse
      • 1.2.2.1 Steuerung der Sekretion
      • 1.2.2.2 Freisetzung und Ausscheidung
    • 1.2.3 Wirkmechanismen
      • 1.2.3.1 Somatomedin- und duale Effektortheorie
      • 1.2.3.2 Direkte Wirkung von Wachstumshormon
      • 1.2.3.3 IGF-vermittelte Wirkung von Wachstumshormon
      • 1.2.3.4 Rückkopplungsmechanismus
    • 1.2.4 Interaktion mit Stoffwechselmechanismen
      • 1.2.4.1 Zuckerstoffwechsel
      • 1.2.4.2 Fettstoffwechsel
      • 1.2.4.3 Eiweißstoffwechsel
      • 1.2.4.4 Calciumstoffwechsel
    • 1.2.5 Herstellung und Verfügbarkeit
    • 1.2.6 Anwendung in der Medizin
      • 1.2.6.1 Klinische Anwendung
      • 1.2.6.2 Experimentelle Anwendung
      • 1.2.6.3 Wund- und Frakturheilung
      • 1.2.6.4 Missbrauch und unerwünschte Wirkung
  • 1.3 Interaktion von Wachstumshormon und Knochen
    • 1.3.1 Wirkung auf die verschiedenen Zellen
      • 1.3.1.1 Osteoblasten
      • 1.3.1.2 Osteoklasten
    • 1.3.2 Wirkung auf den Umbau
    • 1.3.3 Unterschiedliche Einflüsse von GH und IGF
    • 1.3.4 Hypophysärer Gigantismus und Akromegalie
    • 1.3.5 Bisherige Studien
  • 1.4 Polychrome Sequenzmarkierung
  • 1.5 Herleitung der Fragestellung
• 2 Untersuchungsgut und Methoden
  • 2.1 Versuchstiere
    • 2.1.1 Haltung und Nahrung
    • 2.1.2 Gruppeneinteilung
    • 2.1.3 Operation
      • 2.1.3.1 Portimplantation
      • 2.1.3.2 Fixateuroperation
    • 2.1.4 Postoperative Behandlung und Untersuchung
      • 2.1.4.1 Applikation von Wachstumshormon/Placebo
      • 2.1.4.2 Distraktion
      • 2.1.4.3 Schmerzprophylaxe
      • 2.1.4.4 Temperatur, Gewicht
      • 2.1.4.5 Blutentnahme
      • 2.1.4.6 Röntgen, Ultraschall, Steifigkeitsmessung
      • 2.1.4.7 Polychrome Fluoreszenzmarkierung
    • 2.1.5 Tötung und Sektion
  • 2.2 Histologische Untersuchungen
    • 2.2.1 Fixierung und Lagerung
    • 2.2.2 Sägen
      • 2.2.2.1 Rippen
      • 2.2.2.2 Wirbel
      • 2.2.2.3 Beckenkamm
    • 2.2.3 Entwässerung und Infiltration
    • 2.2.4 Polymerisation
    • 2.2.5 Herstellung von Schliffen
    • 2.2.6 Herstellung von Schnitten
    • 2.2.7 Färbungen
      • 2.2.7.1 Versilberung nach Von-Kossa
      • 2.2.7.2 Übersichtsfärbung nach Masson-Goldner
  • 2.3 Auswertung
    • 2.3.1 Bildanalysesystem
    • 2.3.2 Histologische Beobachtungen
    • 2.3.3 Statische Histomorphometrie
      • 2.3.3.1 Mikrostruktur des kortikalen und spongiösen Knochens
      • 2.3.3.2 Umfangsparameter für Knochenresorption und -formation
    • 2.3.4 Dynamische Histomorphometrie
      • 2.3.4.1 Mineralappositionsrate am kortikalen Knochen
      • 2.3.4.2 Mineralappositionsrate am spongiösen Knochen
    • 2.3.5 Statistische Analysen
• 3 Ergebnisse
  • 3.1 Histologische Beobachtungen
  • 3.2 Statische Parameter
    • 3.2.1 Knochenmikrostruktur
    • 3.2.2 Remodellierungsparameter
  • 3.3 Dynamische Parameter
• 4 Diskussion
  • 4.1 Diskussion der Methoden
    • 4.1.1 Studiendesign
    • 4.1.2 Histologische Verfahren
    • 4.1.3 Histomorphometrie und Bildanalyse
  • 4.2 Diskussion der Ergebnisse
    • 4.2.1 Knochenmikrostruktur
    • 4.2.2 Remodellierungsparameter
    • 4.2.3 Mineralappositionsrate
  • 4.3 Vergleich mit anderen Studien
    • 4.3.1 Tierexperimentelle Studien
    • 4.3.2 Untersuchungen an humanen Präparaten
    • 4.3.3 Wirkung von GH auf Knochen
    • 4.3.4 Wirkung von Distraktion auf Knochen
  • 4.4 Schlussfolgerung
• 5 Zusammenfassung
• Abkürzungsverzeichnis
• Literatur
• Anhang
• Danksagung
• Lebenslauf
• Erklärung an Eides Statt

Tabellen

• Tabelle 2.11:Zuordnung der Tiere zu den Gruppen (n = 12 je Gruppe)
• Tabelle 2.12:Alter und Gewicht der Tiere (Median und Spannbreiten)
• Tabelle 3.21:Deskriptive Statistik, Knochenmikrostruktur von Wirbelkörper und Beckenkamm, Gesamtschnittmessung, absolute Werte, Abkürzungen siehe Abkürzungsverzeichnis
• Tabelle 3.22:Deskriptive Statistik, Knochenmikrostruktur von Rippen, einzeln, Gesamtschnittmessung, absolute Werte, Abkürzungen siehe Abkürzungsverzeichnis
• Tabelle 3.23:Deskriptive Statistik, Knochenmikrostruktur von Rippen, zusammengefasst, Gesamtschnittmessung, absolute Werte, Abkürzungen siehe Abkürzungsverzeichnis
• Tabelle 3.24:Deskriptive Statistik, Knochenmikrostruktur von Wirbelkörper und Beckenkamm, Gesamtschnittmessung, prozentuale Werte, Abkürzungen siehe Abkürzungsverzeichnis
• Tabelle 3.25:Deskriptive Statistik, Knochenmikrostruktur von Rippen, einzeln, Gesamtschnittmessung, prozentuale Werte, Abkürzungen siehe Abkürzungsverzeichnis
• Tabelle 3.26:Deskriptive Statistik, Knochenmikrostruktur von Rippen, einzeln, Gesamtschnittmessung, prozentuale Werte, Abkürzungen siehe Abkürzungsverzeichnis
• Tabelle 3.27:Deskriptive Statistik, Knochenmikrostruktur von Wirbelkörper und Beckenkamm, Gesichtsfeldmessung, Abkürzungen siehe Abkürzungsverzeichnis
• Tabelle 3.28:Deskriptive Statistik, Gesichtsfeldmessung an Wirbelkörpern und Beckenkämmen, Abkürzungen siehe Abkürzungsverzeichnis
• Tabelle 3.31:Deskriptive Statistik, Mineralapposition an Rippendünnschliffen, Abkürzungen siehe Abkürzungsverzeichnis

Bilder

• Abbildung 1.21:Wachstumshormon (human) in seiner Struktur (368)
• Abbildung 1.22:Hypothalamus-Hypophysenachse, Steuerung der Wachstumshormon-freisetzung über Releasing- und Inhibiting-Hormone aus dem Hypothalamus, welche über den Pfortaderkreislauf zur Adenohypophyse gelangen (368)
• Abbildung 2.11:Yucatan-Minischweine im Stall [111,112,340]
• Abbildung 2.21:Knochenbiopsien nach Explantation (von links nach rechts und oben nach unten: Wirbelkörper, Beckenkamm, Rippe)
• Abbildung 2.22:Sägen des Rippenknochens (Position R 3)
• Abbildung 2.23:Sägeebenen am Rippenpräparat
• Abbildung 2.24:Sägen des Wirbelknochens
• Abbildung 2.25:Sägeebenen am Wirbelkörper, Ansicht von vorn
• Abbildung 2.26:Sägen der Iliakalbiopsie
• Abbildung 2.27:Sägeebenen am Beckenkamm, Ansicht von dorsal
• Abbildung 2.28:Trabekeloberflächenstrukturen (A: Osteoklasten, B: Howship Lakune, C: Osteoid mit Osteoblasten, D: Osteoid mit Knochenbelegzellen –lining cells)
• Abbildung 2.31:Knochenanbau ventral (links) und dorsal an Rippendünnschliffen (rechts)
• Abbildung 2.32:Makro-Ablauf zur Bestimmung der Knochenmikrostrukturparameter an den Beckenkammgesamtpräparaten (A: Originalpräparat kontrastverstärkt, B: Maske für Gesamtfläche, C: binärisierte Gesamtknochenfläche, D: Maske für Kortikalisfläche, E: binärisierte kortikale Knochenfläche, F: Maske für Trabekelfläche, G: binärisierte trabekuläre Knochenfläche)
• Abbildung 2.33:Makro-Ablauf zur Bestimmung der Knochenmikrostrukturparameter an den Rippengesamtpräparaten (A: Originalpräparat, B: Originalpräparat kontrastverstärkt, C: Strahlenkranzstrecken für Kortikalisdickenmessung, D: Maske für Gesamtfläche, E: binärisierte Gesamtknochenfläche, F: Maske für Kortikalisfläche, G: binärisierte kortikale Knochenfläche, H: Maske für Trabekelfläche, I: binärisierte trabekuläre Knochenfläche)
• Abbildung 2.34:Makro-Ablauf zur Bestimmung der Knochenmikrostrukturparameter an den Wirbelkörpergesamtpräparaten (A: Maske für Gesamtfläche, B: binärisierte Gesamtknochenfläche, C: Maske für Gesamtfläche ohne Epiphysenfugen, D: Epiphysenfugen, E: Maske für Kortikalisfläche, F: binärisierte kortikale Knochenfläche, G: Maske für Trabekelfläche, H: binärisierte trabekuläre Knochenfläche)
• Abbildung 2.35:Raster für die Einteilung in Gesichtsfelder an Wirbelkörpern (links) und Beckenkämmen (rechts)
• Abbildung 2.36:Bestimmung der trabekulären Knochenfläche (links) und der Trabekeldicke (rechts) am Gesichtsfeld
• Abbildung 2.37:Makro-Ablauf zur Bestimmung der Umfangsparameter (A: Originalpräparat, B: binärisierte Trabekelfläche, C: Trabekelumfang, D: Umfangsanteile – rot: Osteoklasten, rosa: Howship Lakunen, türkis: aktives Osteoid, E: Kombination aus C und D zur prozentualen Berechnung)
• Abbildung 2.38:Osteon: Calceinmarkierung (links), Tetrazyklinmarkierung (Mitte), Xylenolmarkierung (rechts); oben: Originalaufnahmen, unten: nach Kontrastverstärkung
• Abbildung 2.39:Kombinationsbild aus den 3 Einzelbildern
• Abbildung 2.310:oben: segmentierte geschlossene Ringe der polychromen Sequenzmarkierungen, unten: gefüllte Flächen (links: Calcein, Mitte: Tetrazyklin, rechts: Xylenol)
• Abbildung 2.311:Flächensegmente zur Bestimmung der Mineralapposition (links: Distraktionsphase, Mitte: Konsolidierungsphase, rechts: gesamter Fluorochromierungszeitraum)
• Abbildung 2.312:Strahlenkranzteilstrecken zur Bestimmung der Mineralapposition (links: Distraktionsphase, Mitte: Konsolidierungsphase, rechts: gesamter Fluorochromierungszeitraum)
• Abbildung 3.21:Gesamtknochenfläche (T.Ar) in mm², p¹ = 0,024
• Abbildung 3.22:Gesamtknochenfläche (T.Ar) in mm², p² < 0,001
• Abbildung 3.23:Anteil mineralisierter Knochenfläche an der Gesamtknochenfläche (B.Ar/T.Ar), p³ = 0,012
• Abbildung 3.24:Anteil mineralisierter Knochenfläche an der Gesamtknochenfläche (B.Ar/T.Ar), p⁴ = 0,022, p⁵ < 0,001
• Abbildung 3.25:Anteil der Kortikalisfläche an der Gesamtfläche (Ct.Ar/T.Ar), p⁶ < 0,001
• Abbildung 3.26: Anteil der Kortikalisfläche an der Gesamtfläche (Ct.Ar/T.Ar), p⁷ = 0,005
• Abbildung 3.27:Anteil der Trabekelfläche an der Gesamtfläche (Tb.Ar/T.Ar), p⁸ < 0,001
• Abbildung 3.28:Anteil der Trabekelfläche an der Gesamtfläche (Tb.Ar/T.Ar), p⁹ = 0,005
• Abbildung 3.29:Anteil des kortikalen Knochens an der Kortikalisfläche (Ct.B.Ar/Ct.Ar),  p¹⁰ < 0,001, p¹¹ = 0,012
• Abbildung 3.210:Anteil des kortikalen Knochens an der Kortikalisfläche (Ct.B.Ar/Ct.Ar), p¹² = 0,007, p¹³ < 0,001
• Abbildung 3.211:Anteil des trabekulären Knochens an der Trabekelfläche (Tb.B.Ar/Tb.Ar), p¹⁴ = 0,017, p^I < 0,001;  GS – Gesamtschnittmessung, GF - Gesichtsfeldmessung
• Abbildung 3.212: Anteil des trabekulären Knochens an der Trabekelfläche (Tb.B.Ar/Tb.Ar), p¹⁵ < 0,001
• Abbildung 3.213:Trabekeldicke (Tb.Wi) in µm, beide Methoden, p¹⁶ = 0,014, p¹⁷ = 0,024, p^II < 0,001
• Abbildung 3.214:Kortikalisdicke (Ct.Wi) in mm, p¹⁸ < 0,001
• Abbildung 3.215:Knochenresorption als prozentualer Anteil des Knochenumfangs, welcher mit Howship’schen Lakunen bedeckt ist, die entweder leer oder mit Osteoklasten gefüllt sind, p¹ < 0,001
• Abbildung 3.216:Aktive Knochenresorption als prozentualer Anteil des Knochenumfangs, welcher mit von Osteoklasten gefüllten Howship’schen Lakunen bedeckt ist, p² = 0,001, p³ < 0,001, p^I = 0,039
• Abbildung 3.217:Passive Knochenresorption als prozentualer Anteil des Knochenumfangs, welcher mit leeren Howship’schen Lakunen bedeckt ist, p⁴ = 0,025
• Abbildung 3.218:Knochenformation als prozentualer Anteil des Knochenumfangs, welcher mit Osteoid bedeckt ist, auf welchem entweder Osteoblasten oder Knochenbelegzellen bzw. keine Zellen liegen, p⁵ = 0,028, p⁶ = 0,043, p^II = 0,001
• Abbildung 3.219:Aktive Knochenformation als prozentualer Anteil des Knochenumfangs, welcher mit von Osteoblasten bedecktem Osteoid bedeckt ist, p⁷ = 0,002, p^III < 0,001
• Abbildung 3.220:Passive Knochenformation als prozentualer Anteil des Knochenumfangs, welcher mit Osteoid ohne Osteoblasten bedeckt ist, n.s.
• Abbildung 3.221:Ruhender Umfang als prozentualer Anteil des Knochenumfangs, welcher Knochenresorptionsanteile noch Knochenformationsanteile zeigt, p⁸ = 0,002, p⁹ = 0,003, p^IV = 0,001
• Abbildung 3.222:Prozentualer Anteil der einzelnen Umfangsparameter
• Abbildung 3.31:Mineralapposition in µm/d, gemessen an Rippendünnschliffen, p¹ = 0,033, p² = 0,039, p³ < 0,001, p^I < 0,001
• Abbildung 3.32:Mineralapposition in µm²/d, gemessen an Rippendünnschliffen, p^I < 0,001