Aus der Klinik für Chirurgie
der Medizinischen Fakultät der Charité -
Universitätsmedizin Berlin

D I S S E R T A T I O N

Mikroverkapselung von humanen Parathyreozyten mit Natrium-cellulosesulfat und Poly-DADMAC in der Behandlung des postoperativen Hypoparathyreoidismus

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät der Charité -
Universitätsmedizin Berlin

Von Markus Gärtner

aus Stuttgart

Dekan: Prof. Dr. Joachim W. Dudenhausen

Dekan: Prof. Dr. med. Martin Paul

Gutachter:
1. Prof. Dr. Peter E. Goretzki
2. Priv. Doz. Dr. Jochen Klupp
3. Prof. Dr. Joachim Steinmüller

Datum der Einreichung:28. Oktober 2003

Datum der Promotion:24. September 2004

Hoc se quisque modo semper fugit

Inhaltsverzeichnis

• 1   Einleitung
  • 1.1 Postoperativer Hypoparathyreoidismus
  • 1.2   Physiologische Grundlagen
    • 1.2.1 Kalzium
    • 1.2.2 Parathyrin
    • 1.2.3 1,25-Dihydroxycholecalciferol (Calcitriol)
    • 1.2.4 Calcitonin
  • 1.3 Klinisches Bild des Hypoparathyreoidismus
  • 1.4 Medikamentöse Therapie des Hypoparathyreoidismus
  • 1.5 Transplantation von humanem Nebenschilddrüsengewebe
    • 1.5.1 Autotransplantation
    • 1.5.2 Allotransplantation
  • 1.6 Mikroverkapselung
    • 1.6.1 Mikroverkapselung mit Alginat / Polylysin (ALG / PLL)
    • 1.6.2 Mikroverkapselung mit Natriumcellulosesulfat und Poly-DADMAC
  • 1.7   Zielsetzung der Arbeit
• 2   Material und Methoden
  • 2.1 Präparation und Kultivierung humaner Parathyreozyten
    • 2.1.1 Kryokonservierung
    • 2.1.2 Anlegen der Zellkulturen
  • 2.2   Mikroenkapsulierung
    • 2.2.1 Natriumcellulosesulfat und Polydiallyldimethylammoniumchlorid
    • 2.2.2   Encapsulator AP ^™
  • 2.3   Bestimmung der mechanischen Eigenschaften (LUMiTester)
  • 2.4 Porengrößenbestimmung
  • 2.5   Bestimmung von Zellzahl, Viabilität und Steuerbarkeit humaner Parathyreozyten
    • 2.5.1 Hämozytometer
    • 2.5.2 Viabilitätsprüfung mit Trypanblau
    • 2.5.3 Kalziumsuppressionstest
  • 2.6 PTH-Bestimmung
    • 2.6.1 Elektrochemilumineszenzimmunoassay (ECLIA)
  • 2.7 Versuchsaufbau
  • 2.8   Statistische Methoden
• 3   Ergebnisse
  • 3.1 Viabilität und Morphologie humaner Parathyreozyten in Zellkultur
  • 3.2   Eigenschaften der hergestellten Mikrokapseln
    • 3.2.1 Bestimmung der mechanischen Eigenschaften
    • 3.2.2 Porengrößenbestimmung
  • 3.3   In vitro-Sensitivität unverkapselter Parathyreozytenkulturen
  • 3.4   PTH-Sekretion unverkapselter Parathyreozyten
  • 3.5   In vitro-Sensitivität enkapsulierter Parathyreozyten
  • 3.6   PTH-Sekretion enkapsulierter Parathyreozyten
    • 3.6.1 PTH-Sekretion enkapsulierter Parathyreozyten - Kurzzeitversuche
    • 3.6.2 PTH-Sekretion enkapsulierter Parathyreozyten - Langzeitversuche
• 4   Diskussion
  • 4.1 Bisherige Behandlungsansätze des postoperativen Hypoparathyreoidismus
  • 4.2   Substanzen zur Mikroenkapsulierung
  • 4.3 Biokompatibilität und Immunkompatibilität
  • 4.4   Mikroenkapsulierung – Auswahl bisheriger Anwendungen
  • 4.5   Bewertung der eigenen Ergebnisse
    • 4.5.1 Unverkapselte Parathyreozytenkulturen
    • 4.5.2 Bewertung des Verkapselungsverfahrens
    • 4.5.3 Bewertung der Kalziumsensitivität enkapsulierter Parathyreozyten
    • 4.5.4 Bewertung der PTH-Sekretion enkapsulierter Parathyreozyten im zeitlichen Verlauf
• 5   Zusammenfassung
•  6. Literatur
•  7. Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen
•   8. Danksagung
•  9. Erklärung an Eides Statt

Tabellen

• Tabelle 1: Geräteeinstellungen der untersuchten Mikrokapseln
• Tabelle 2: Versuchsablauf – Unverkapselte Parathyreozyten [n=10]
• Tabelle 3: Versuchsablauf – Enkapsulierte Parathyreozyten [n=30]
• Tabelle 4: Mechanische Eigenschaften der untersuchten Mikrokapseln
• Tabelle 5: Porengrößenbestimmung
• Tabelle 6: Veränderung der PTH-Sekretion unverkapselter Parathyreozyten [%] (Differenz der Werte vor und nach Inkubation in unterschiedlichen Kalziumkonzentrationen) [n=10]
• Tabelle 7: PTH-Verlauf unverkapselter Parathyreozyten [n=10] – Absolutwerte [pg/ml]
• Tabelle 8: Veränderung der PTH-Sekretion enkapsulierter Parathyreozyten [%] (Differenz zwischen den Werten vor und nach Inkubation in unterschiedlichen Kalziumkonzentrationen) [n=10]
• Tabelle 9: PTH-Verlauf enkapsulierter Parathyreozyten [pg/ml] [n=30]
• Tabelle 10: PTH-Verlauf enkapsulierter Parathyreozyten - Absolutwerte [pg/ml]  (Langzeitversuche)

Bilder

• Abbildung 1:Kalziumstoffwechsel
• Abbildung 2:Natriumcellulosesulfat, M_W = 157700, DS = 0,36
• Abbildung 3:Polydiallyldimethylammoniumchlorid (Poly-DADMAC) M_W= 35500
• Abbildung 4:Encapsulator AP^™
• Abbildung 5:Tropfenstrahl bei der Herstellung von Mikrokapseln mit dem Encapsulator AP
• Abbildung 6:Schematische Darstellung des ENCAPSULATOR AP^™
• Abbildung 7:Biotin-Streptavidin Wechselwirkung bei der PTH-Bestimmung mit dem Elektro-chemilumineszenzimmunoassay (ECLIA)
• Abbildung 8:Einzelzellkultur humaner Parathyreozyten (Phasenkontrastmikroskop, 100-fache Vergrößerung)
• Abbildung 9:Viabilität unverkapselter Parathyreozytenkulturen nach Aufarbeitung
• Abbildung 10:Einzelzellkultur humaner Parathyreozyten (Phasenkontrastmikroskop, 200-fache Vergrößerung)
• Abbildung 11:Mikrokapseln enkapsulierter Parathyreozyten in Zellkulturmedium
• Abbildung 12:Mikrokapseln mit deutlich fokussierten Zellen in der Kapselperipherie  (Phasenkontrastmikroskop, 100-fache Vergrößerung)
• Abbildung 13:Elektronenmikroskopische Aufnahme einer Mikrokapsel
• Abbildung 14:Elektronenmikroskopische Aufnahme der Kapselmembran
• Abbildung 15: Kalziumsensitivität unverkapselter Parathyreozyten [n=10]
• Abbildung 17:In vitro-Sensitivität enkapsulierter Parathyreozyten
• Abbildung 18:Enkapsulierte Parathyreozyten (Phasenkontrastmikroskop, 40-fache Vergrößerung)
• Abbildung 19:PTH-Verlauf enkapsulierter Parathyreozyten - Relativwerte [%]
• Abbildung 20:PTH-Verlauf enkapsulierter Parathyreozyten - Relativwerte [%] (Langzeitversuche) [n=10]