Material und Methoden

2.1 Präparation und Kultivierung humaner Parathyreozyten

2.1.1 Kryokonservierung

↓28

Die Methodik der Kryokonservierung entsprach der von Wagner und Mitarbeitern44 , 45 , 46und geht zurück auf Wells, der erstmalig kryokonserviertes Nebenschilddrüsengewebe autolog transplantierte.

↓29

Die entnommenen Epithelkörperchen wurden von Fett und Bindegewebe befreit und bis zum Ende des Eingriffs bei einer Temperatur von 4 °C in physiologischer Kochsalzlösung aufbewahrt. Anschließend erfolgte die Zerkleinerung in Gewebepartikel mit einer Kantenlänge von ca. 1 mm. Diese wurden, je nach Menge der Präparate, auf bis zu zehn verschraubbare Kryoröhrchen (Nalgene Cryogenic Vial, 5000-0020, Nalge Europe, England) verteilt. Als Konservierungsmedium diente jeweils 1 ml einer Lösung aus 80 % RPMI 1640 (PAA Laboratories Austria, E15-039), 10 % fötalen bovinen Serums, FBS (Gibco BRL,10440022, Invitrogen, Deutschland) und 10 % Dimethylsulfoxyd, DMSO (Sigma Chemical Co, D2650, Australien) bei einer Temperatur von 4 °C.

Die Kryoröhrchen wurden anschließend mittels eines programmierbaren Einfriergerätes (Kryo 10 Series III; Planer, England) mit einer Geschwindigkeit von zuerst 1 °C/min auf 80 °C, dann mit 10 °C/min auf 120 °C und schließlich mit 39 °C/min auf –195 °C schrittweise abgekühlt47. Danach erfolgte die Überführung und Lagerung in einem separaten Stickstofftank (Chronos 80 Biosafe®, Messer Griesheim, Deutschland) bei –196 °C.

2.1.2 Anlegen der Zellkulturen

Die Kryoröhrchen wurden dem Stickstofftank entnommen und in einem Wasserbad bei 37 °C (entspricht etwa einer Auftaugeschwindigkeit von 50 °C/min) zügig aufgetaut, bis das Medium gerade den Gefrierpunkt überschritten hatte. Die Gewebepartikel wurden anschließend sofort in 40 ml Dulbecco’s Modified Eagle Medium, D-MEM (Gibco BRL, 11965, Invitrogen, Deutschland) bei 4 °C überführt und dreimalig gespült, um das zytotoxische Dimethylsulfoxid möglichst stark zu verdünnen.

↓30

Das Gewebe wurde danach in einer Petrischale mit Skalpellen zerkleinert, anschließend durch ein Nylonsieb (Porengröße 200 µm) gedrückt und erneut gewaschen. Es resultierten hieraus Einzelzellkulturen bzw. kleinere Zellaggregate von bis zu 20 Zellen. Diese wurden nach Zellzahlbestimmung und Viabilitätskontrolle in das endgültige Kulturmedium 87 % D-MEM, (Gibco BRL, 11965, Invitrogen, Deutschland), 10 Vol.% fötales bovines Serum, FBS (Gibco BRL, 10440022, Invitrogen, Deutschland), 2 Vol.% l-Glutamin (Gibco BRL, 25030081, Invitrogen, Deutschland) und 1 Vol.% Penicillin-Streptomycin (Gibco BRL,15070, Invitrogen, Deutschland) überführt und in Gewebekulturflaschen (50 ml 353108 bzw. 250 ml, 353111, BD Falcon, USA) kultiviert. Die Zellkulturen wurden in einem Brutschrank (Heraeus BB6060CU, Heraeus Instruments, Deutschland) bei 37 °C, einer relativen Luftfeuchtigkeit von 100 % und einer Begasung mit 21 % O2 und 5 % CO2 inkubiert48 , 44.

2.2 
Mikroenkapsulierung

2.2.1 Natriumcellulosesulfat und Polydiallyldimethylammoniumchlorid

Als Grundlage der Mikroenkapsulierung diente das von Dautzenberg entwickelte Verfahren: Natriumcellulosesulfat (2,4 %ige Lösung mit 0,63 % NaCl) als Polyanion wird in ein aus dem Polykation Polydiallyldimethylammoniumchlorid (4 %ige Lösung mit 0,63 % NaCl) bestehendes Fällbad getropft. Hierbei entstehen Mikrokapseln mit einer festen, semipermeablen Polysalzmembran als Kapselwand und einem flüssigen Kern49 , 50.

NaCS (2,4 %ige Lösung mit 0,63 % NaCl) (Abb.2) wurde bezogen von der Forschungsinitiative Bioaktive Polymersysteme e.V., Teltow. Die kationische Komponente Poly-DADMAC (4 %ige Lösung mit 0,63 % NaCl) (Abb.3) wurde von KatPol GmbH, Bitterfeld geliefert.

↓31

Die Herstellung des NaCS erfolgte nach der ebenfalls von Dautzenberg beschriebenen Methode der heterogenen Sulfatierung51 , 52 , 53. Aufgrund einer weniger aufwendigen Prozessführung und der Verwendung nichttoxischer Reagenzien konnte sich diese Methode gegenüber der homogenen Sulfatierung durchsetzen.

Als Celluloseausgangsmaterial dienten lufttrockene Baumwoll-Linters (DPCuoxam ~1400), als Sulfatierungsmedium 94-96 %ige Schwefelsäure sowie n- bzw. Isopropanol (Wassergehalt <0,2 %). Hieraus resultierte ein hochviskoses, vollständig wasserlösliches Polyanion mit einem Substitutionsgrad DS von ~ 0,36.

Abbildung 2:Natriumcellulosesulfat, MW = 157700, DS = 0,36

↓32

Die Herstellung der polykationischen Komponente Poly-DADMAC erfolgte durch radikalische Polymerisation aus dem entsprechenden Monomer nach der von Wandrey et al. beschriebenen Methode54.

Abbildung 3:Polydiallyldimethylammoniumchlorid (Poly-DADMAC) MW= 35500

Die Formation der Mikrokapseln erfolgt über mehrere Teilschritte: Nach dem Eintauchen des polyanionischen NaCS-Tropfens in das polykationische Fällbad entsteht durch die Grenzflächenreaktion der gegensätzlich geladenen Reagenzien ein Präzipitat an der Tropfenoberfläche und bildet eine semipermeable Membran. Der weitere Membrananbau erfolgt an der Innenseite der Primärmembran und ist somit diffusionsabhängig, d.h. er setzt sich nur so lange fort, wie Reaktionssubstrate durch die Membran permeieren können. Die Penetration des Poly-DADMAC wird durch die Gegenwart von NaCl erleichtert und führt bei den hier verwendeten Lösungen zu einer vollständigen Aushärtezeit zwischen drei und sechs Minuten.

↓33

Entsprechend des Reaktionsprozesses bei der Membranentstehung ergibt sich ein heterogener Aufbau der Kapselwand: Eine dichte Außenschicht wird gefolgt von einer Lockerzone und einer dann folgenden porösen Wand, deren Struktur sich zum Kapselinneren zunehmend auflockert. Im Inneren befindet sich schließlich der flüssige Kern aus Natriumcellulosesulfat, das als Trägermedium für die Parathyreozyten dient49 , 55 , 56 , 57 , 58 , 59.

Aufgrund des niedrigen Molekulargewichtes ist das Poly-DADMAC der Sterilfiltration zugänglich60. Natriumcellulosesulfat kann bei 121 °C dampfsterilisiert werden61.

2.2.2 
Encapsulator AP

Verwendet wurde der Encapsulator AP (Inotech Biosystems, Schweiz) mit zusätzlichem High Voltage System (Abb.4).

↓34

Abbildung 4:Encapsulator AP

Das Natriumcellulosesulfat wurde mit dem Zellpellet vermischt (Abb.6) und in eine 50 ml- Perfusor® Spritze (B. Braun Melsungen, Deutschland) gefüllt (1b). Ein Perfusor®-Antrieb drückt das Gemisch mit definierter Geschwindigkeit V durch eine Düse (300 µm, gebördelt) (2) und erzeugt so einen Flüssigkeitsstrom. Die Düse und somit der Flüssigkeitsstrom wird durch eine von einem Frequenzgenerator (14) getriggerte Vibrationseinheit (3) in Schwingung versetzt.

Die mechanische Disturbation bricht den Laminarstrom in einzelne, gleichgroße Tropfen auf. Der Flüssigkeits- bzw. Tropfenstrahl (Abb.5) fällt vor einem Stroboskop (13), das ebenfalls durch den Frequenzgenerator getriggert wird, in das Fällbad aus Poly-DADMAC. Ein stehender Tropfenstrahl im Stroboskop zeigt ein optimales Ergebnis an.

↓35

Abbildung 5:Tropfenstrahl bei der Herstellung von Mikrokapseln mit dem Encapsulator AP

Um die Monodispersität der Tropfen zu verbessern und gleichzeitig deren Koaleszenz zu verringern, verfügt der Encapsulator über ein zusätzliches High Voltage System. Die elektrostatische Aufladung (positiv oder negativ) führt zu einer Abstoßung der einzelnen Tropfen. Im Reaktionsbehälter befindet sich ein Magnetrührer (9), der für eine gleichmäßige Verteilung der Kapseln bis zur völligen Aushärtung sorgt.

Eine Bypasseinheit (8), die unter den Tropfenstrahl geschaltet werden kann, entfernte zu Beginn und am Ende des Enkapsulierungsprozesses entstehendes Abfallmaterial.

↓36

Das Poly-DADMAC wurde nach definierter Aushärtezeit über eine integrierte Pumpe (7b) entfernt. Mittels einer weiteren Peristaltikpumpe folgte eine zweimalige Spülung mit isotoner Kochsalzlösung (NaCl 0,9 % Braun, B. Braun Melsungen, Deutschland) über den Zufluss (7a).

Optional konnte zusätzlich ein Sterilfilter (6a) zwischengeschaltet werden. Die fertigen Kapseln wurden im angeschlossenen Sammelbehälter (12) aufgefangen. Anschließend wurden die Kapseln unter sterilen Bedingungen in einer Laminarflusskammer in D-MEM Zellkulturmedium (Gibco BRL, 11965, Invitrogen, Deutschland) überführt und in Gewebekulturflaschen (BD Falcon Deutschland, 353108) bei 37 °C und einem Gasgemisch aus 21 % O2 und 5 % CO2 im Brutschrank inkubiert62.

Abbildung 6:Schematische Darstellung des ENCAPSULATOR AP

2.3 
Bestimmung der mechanischen Eigenschaften (LUMiTester)

↓37

Die mechanischen Eigenschaften der Mikrokapseln wurden mit dem LUMI-Tester (L.U.M. GmbH Berlin, Deutschland) getestet. Die Stempelvortriebsgeschwindigkeit betrug hierbei 0,05 mm/s.

Für die Herstellung der Mikrokapseln wurde Natriumcellulosesulfat (2,4 %; CSB/99 mit 0,63 % NaCl) und Poly-DADMAC (PQ 39/97 mit 0,63 % NaCl) verwendet.

Die Mikrokapseln wurden mit dem Encapsulator AP (Inotech Biosystems, Schweiz) (gebördelte Düse, Durchmesser 300 µm) unter folgenden Geräteeinstellungen hergestellt (Tab.1):

↓38

Tabelle 1: Geräteeinstellungen der untersuchten Mikrokapseln

Anzahl [n]

Geschwindigkeit V

Frequenz [Hz]

Amplitude

Aushärte-
zeit t [min]

Spannung U [V]

18

7,5

800

50

3

1000

Mit Hilfe eines Linearvortriebes mit kombinierter Steuer- und Messkarte und einer elektronischen Waage, welche eine bidirektionale Datenschnittstelle besitzt, wurden die mechanischen Eigenschaften der Mikrokapseln bestimmt.

Die Steuerelektronik sorgte dafür, dass die Kapseln einer stetigen, kontinuierlich zunehmenden Belastung ausgesetzt wurden.

↓39

Das Messprinzip der Waage beruht auf der Detektion der relativen Veränderungen der Position der Waagschale bei unterschiedlich wirkenden äußeren Kräften.

Sowohl die Position des Linearvortriebs, seine Geschwindigkeit als auch die Gewichtsanzeige der Waage wurden durch eine spezielle Software permanent registriert und dargestellt. Die gewonnenen Messwerte mussten bezüglich der Eigenschaften der verwendeten Waage und der Parameter des Linearvortriebes durch Aufnahme einer Normkurve korrigiert werden.

Zwischen den ermittelten Daten, wie Anfangsdurchmesser R [mm], Berstdurchmesser am ersten lokalen Maximum r [mm], Berstdruck am ersten lokalen Maximum P(r) [kPa] sowie der Kraft F [N], die zum Bersten der Kapsel aufgebracht werden muss, besteht folgender Zusammenhang63:

↓40

2.4 Porengrößenbestimmung

Die Porengrößenbestimmung der Mikrokapseln erfolgte am Institut für Biologie der Humboldt Universität zu Berlin mittels Größenausschlusschromatografie für Dextrangemische nach Ehwald, Woehlecke64 , 65.

Diese Methode basiert auf der Äquilibrierung eines definierten Kapselvolumens mit einer polydispersen Dextran-Mischung mit Molmassen von 500 bis 2000000 Dalton.

↓41

Die Anteile der in die Kapseln eindiffundierenden bzw. ausgeschlossenen Dextranmoleküle wurden durch Größenausschlusschromatografie der Ausgangs- und der abgereicherten Lösung und anschließende Quotientenbildung ermittelt. Aus der grafischen Darstellung der Quotienten in Form einer Trennstufe ließ sich die mittlere Trenngrenze der Membran als Halbstufenwert sowie die allgemein als Ausschlussgrenze bezeichnete obere Trenngrenze ermitteln. Größere Moleküle wurden durch die Membran ausgeschlossen. Die Angabe der Ausschlussgrenze erfolgt in Stokeschen Radien, die sich für die verwendeten Dextranmoleküle aus einer Kalibrierfunktion ergaben.

2.5 
Bestimmung von Zellzahl, Viabilität und Steuerbarkeit humaner Parathyreozyten

2.5.1 Hämozytometer

Die Zellzahlbestimmung erfolgte in der Neubauer-Zählkammer (Neubauer improved, Marienfeld, Deutschland). Die Kammer besteht aus neun Großquadraten mit einer Fläche von jeweils 1 mm2, einer Tiefe von 0,1 mm und einem Volumen von 0,1 µl. Es wurden jeweils 4 Großquadrate bei 100-facher Vergrößerung mäanderförmig im Lichtmikroskop ausgezählt und daraus der Mittelwert gebildet. Multipliziert mit 104 ergab sich die Zellzahl pro Milliliter66.

2.5.2 Viabilitätsprüfung mit Trypanblau

Trypanblau (Seromed® Biochrom KG Deutschland, L 6313) ist ein saurer, anionischer Farbstoff, der in das Zellinnere von avitalen Zellen eindringt und diese anfärbt. Für die Anwendung wurde 0,1 ml Zellsuspension (aufgrund der hohen Proteinbindungsfähigkeit des Farbstoffes ohne Serum) mit 3,6 ml PBS (ohne Ca2+und Mg2+) und mit 2,7 ml einer vorgewärmten 0,5 % Trypanblaulösung vermischt und 2-5 Minuten bei einer Temperatur von 37 °C inkubiert. Längere Inkubationszeiten führten aufgrund der Zytotoxizität des Farbstoffes zu einem höheren Anteil an avitalen Zellen. Der Testansatz wurde im Hämozytometer ausgezählt. Lebende Zellen erschienen ungefärbt, avitale Zellen hingegen völlig oder teilweise blau angefärbt66.

2.5.3 Kalziumsuppressionstest

↓42

Um die in vitro Sensitivität der Parathyreozyten, d.h. die physiologische PTH-Antwort der Zellen auf unterschiedliche Kalziumwerte zu überprüfen, wurden die Einzelzellkulturen bzw. die enkapsulierten Zellen in verschiedenen Kalziumkonzentrationen inkubiert.

Durch Zugabe von EGTA (äthylenglykol-glykol-bis-(2-aminoäthyl)-N,N,N’,N’-tetra-essigsäure) (Fluka Chemie, Schweiz) wurde dem durch HEPES (HEPES Buffer, Solution 1M, Gibco BRL, 15630-056, Invitrogen, Deutschland) gepufferten Medium Kalzium durch Komplexierung entzogen bzw. durch 10 % Kalziumlösung (Calcium 10 % Braun®, B. Braun, Deutschland) zugeführt.

Auf diese Weise wurde eine aufsteigende Kalziumreihe mit den Konzentrationen 0,5 mmol/l, 1,5 mmol/l, 2,0 mmol/l, 2,5 mmol/l sowie 3,5 mmol/l titriert109.

↓43

Der jeweilige Leerwert, bei dem keine Zugabe von EGTA oder Kalzium erfolgte (2,0 mmol/l), wurde jeweils gleich Null gesetzt, um die Vergleichbarkeit der heterogenen Zellkulturen zu gewährleisten.

2.6 PTH-Bestimmung

2.6.1 Elektrochemilumineszenzimmunoassay (ECLIA)

Die Probenentnahme des Parathormons erfolgte aus dem Kulturmedium. Die Proben wurden sofort nach der Abnahme bei –70 °C tiefgefroren. Die PTH-Bestimmung wurde im Zentrallabor der Charité, Campus Virchow Klinikum mittels eines Elektrochemilumineszenzimmunoassay (ECLIA) an dem Roche Immunoassay Analysenautomaten Elecsys® 2010 (Roche Diagnostics, Deutschland) durchgeführt.

Der Test basiert auf einem sogenannten Sandwichprinzip. Hierbei erfolgt zuerst eine Inkubation der zu bestimmenden Probe mit einem biotinylierten monoklonalen Antikörper (Abb.7), der gegen das N-terminale Fragment 1-37 gerichtet ist. Danach erfolgt eine zweite Inkubation mit einem gegen das C-terminale Fragment 38-84 gerichteten und durch einen Ruthenium-Komplex markierten Antikörper.

↓44

Im nächsten Schritt wird die Probe in Streptavidin-beschichteten Mikropartikeln inkubiert.

Abbildung 7:Biotin-Streptavidin Wechselwirkung bei der PTH-Bestimmung mit dem Elektro-chemilumineszenzimmunoassay (ECLIA)

Aufgrund der Biotin-Streptavidin-Wechselwirkung kommt es zur Bindung des biotinylierten PTH-Antikörpers an die Festphase. Im folgenden wird das Reaktionsgemisch zusammen mit einer Tripropylamin (TPA) enthaltenden Pufferlösung in die Elektrochemilumineszenz-Messzelle überführt. Durch magnetische Wirkung werden die Mikropartikel als dünner, gleichmäßiger Film auf der Oberfläche einer Elektrode fixiert. Alle ungebundenen Substanzen werden durch einen Flüssigkeitsstrom weggespült.

↓45

Durch das Anlegen von Spannung an die Elektrode kommt es sowohl zur Oxidation des Ruthenium-Komplexes als auch des in der Lösung befindlichen Tripropylamins. Aus der Reaktion dieser beiden Komponenten resultiert die Überführung des Rutheniums in einen angeregten Zustand. Der Zerfall führt schließlich zur Emission von Photonen bei einer Wellenlänge von 620 nm. Durch den Prozess wird der Rutheniumkomplex regeneriert, was zu einer Amplifikation des Signales führt. Die Photonenstrahlung wird dann mittels einer sog. Photomultiplier Tube (PMT) gemessen und der resultierende Wert abschließend mit einer Kalibrationskurve verglichen. Dies ergibt den gesuchten PTH-Wert67.

2.7 Versuchsaufbau

Für die Versuche wurde kryokonserviertes, humanes Nebenschilddrüsengewebe aus der Chirurgischen Klinik der Charité, Campus Virchow-Klinikum verwendet. Im Zuge von Resektionseingriffen bei sekundärem Hyperparathyreoidismus und der regelhaften Kryokonservierung entstand eine Organbank mit Geweben von über 200 Patienten. Für die vorliegenden Versuche wurde nur Gewebe von Patienten verwendet, bei denen auch längerfristig ein Therapiebedarf ausgeschlossen werden konnte.

Die durchschnittliche Konservierungsdauer betrug zwei Jahre. Die Auswahl der Präparate erfolgte zufällig.

↓46

Es wurden zwei Gruppen gebildet: In der ersten Gruppe [n=10] wurden unverkapselte Parathyreozyten über einen Zeitraum von 12 Tagen beobachtet (Tab.2). Diese Versuchsreihe diente vor allem zur Validierung des Versuchsablaufes. Die Parathyreozyten sollten hierbei in Bezug auf ihr Kulturverhalten, die PTH-Sekretion sowie die in vitro-Kalziumsensitivität überprüft werden.

In der zweiten Versuchsgruppe [n =30] wurden die Zellen am dritten Tag nach Aufarbeitung mikroverkapselt und weitere neun Tage in ihrem Sekretionsverhalten beobachtet (Tab.3). Ein Versuchszyklus dauerte zwölf Tage. Da sich im Verlauf der Versuche ein unerwartetes Ansteigen der Hormonwerte enkapsulierter Parathyreozyten ergab, wurde ein Teil der verkapselten Zellen [n=10] im Langzeitversuch über insgesamt 85 Tage beobachtet.

Tabelle 2: Versuchsablauf – Unverkapselte Parathyreozyten [n=10]

Tag

Versuchsprogramm

1

Auftauen der kryokonservierten Zellen

Anlegen der Zellkulturen

Zellzahlbestimmung

Viabilitätsbestimmung

Phasenkontrastmikroskopie

2

PTH-Bestimmung

Phasenkontrastmikroskopie

3

PTH-Bestimmung

Phasenkontrastmikroskopie

Viabilitätsbestimmung

4

PTH-Bestimmung

Phasenkontrastmikroskopie

6

PTH-Bestimmung

Phasenkontrastmikroskopie

Anlegen der Kalziumsuppressionsreihe

8

PTH-Bestimmung aus der Kalziumsuppressionsreihe

Phasenkontrastmikroskopie

10

PTH-Bestimmung

Phasenkontrastmikroskopie

12

PTH-Bestimmung

Phasenkontrastmikroskopie

↓47

Tabelle 3: Versuchsablauf – Enkapsulierte Parathyreozyten [n=30]

Tag

Versuchsprogramm

1

Auftauen der kryokonservierten Zellen

Anlegen der Zellkulturen

Zellzahlbestimmung

Viabilitätstestung

Phasenkontrastmikroskopie

2

PTH-Bestimmung der unverkapselten Zellen

Phasenkontrastmikroskopie

3

PTH-Bestimmung der unverkapselten Zellen

Phasenkontrastmikroskopie

Viabilitätstestung

Zellzahlbestimmung

Mikroverkapselung

Kultivierung der verkapselten Zellen

PTH-Bestimmung

Phasenkontrastmikroskopie

4

PTH-Bestimmung

Phasenkontrastmikroskopie

6

PTH-Bestimmung

Phasenkontrastmikroskopie

Anlegen der Kalziumsuppressionsreihe

8

PTH-Bestimmung aus der Kalziumsuppressionsreihe

Phasenkontrastmikroskopie

10

PTH-Bestimmung

Phasenkontrastmikroskopie

12

PTH-Bestimmung

Phasenkontrastmikroskopie

40

PTH-Bestimmung

Phasenkontrastmikroskopie

85

PTH-Bestimmung

Phasenkontrastmikroskopie

2.8 
Statistische Methoden

Die Darstellung der Ergebnisse erfolgte mittels deskriptiver Statistik. Bei den Ergebnissen von PTH-Sekretionsleistung und Kalziumsensitivität der Parathyreozyten sowie der mechanischen Kapseleigenschaften wurde der arithmetische Mittelwert unter Angabe der SEM, standard error of the means , verwendet.

Die PTH-Sekretionsleistung der verkapselten Zellen war aufgrund der unterschiedlichen Histologie sowie der von Kapsel zu Kapsel differierenden Zellbeladung nicht direkt vergleichbar. Um dennoch die Kalziumsekretionsleistung über den Versuchszeitraum hinweg darstellen zu können, wurden die absoluten Werte der PTH-Sekretion in Prozentualwerte umgerechnet. Hierbei wurde der erste Tag nach Enkapsulierung (Tag 4) gleich hundert Prozent gesetzt und diente als Bezugswert.

↓48

Bei den Versuchen zur Darstellung der Kalziumsensitivität wurden die Parathyreozyten in Medien mit jeweils 0,5 mmol/l, 1,5 mmol/l, 2,0 mmol/l, 2,5 mmol/l sowie 3,5 mmol/l Kalzium inkubiert. Um auch hier die Streubreite der heterogenen Zellkulturen zu reduzieren, wurde der Leerwert (2,0 mmol/l), bei dem keine Kalzium- oder EGTA-Zugabe erfolgte, gleich Null gesetzt. Dieser Wert wurde gewählt, da er in etwa dem normalen Kalziumgehalt des Kulturmediums entsprach.


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28.01.2005