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Ergebnisse

Die Viabilität der Parathyreozytenkulturen wurde direkt nach Aufarbeitung (Tag 1) sowie am Tag der Verkapselung (Tag 3) bestimmt.

Am Tag 1 betrug die Viabilität durchschnittlich 72 11,7 %. Die Zellkulturen enthielten aufgrund der Kryokonservierung und der Präparation einen hohen Anteil an Zelltrümmern und avitalen Zellen.

Der Erythrozytenanteil nach Aufarbeitung war sehr hoch und übertraf den Anteil der Parathyreozyten um annäherungsweise den Faktor Hundert. Durch Autolyse reduzierte sich ihre Zahl sehr schnell, so dass nach 48 h praktisch keine Erythrozyten mehr nachweisbar waren.

	Abbildung 8:Einzelzellkultur humaner Parathyreozyten (Phasenkontrastmikroskop, 100-fache Vergrößerung)

Da innerhalb der ersten 2 Tage in Kultur ein Großteil der avitalen Zellen lysierte, konnte an Tag 3 eine Viabilität von 95 ± 4,3 % bestimmt werden (Tab.9). Phasenkontrastmikroskopisch konnten einheitliche Parathyreozytenkulturen mit einem geringen Anteil an Zelltrümmern beobachtet werden. Einige Kulturen enthielten in den ersten Tagen nach Aufarbeitung einen geringen Anteil spindelförmiger Zellen, vermutlich Fibroblasten.

Nach circa sieben Tagen war der Boden der Zellkulturflaschen stets mit einem dichten Zellrasen konfluierender Parathyreozyten bedeckt.

	Abbildung 9:Viabilität unverkapselter Parathyreozytenkulturen nach Aufarbeitung

	Abbildung 10:Einzelzellkultur humaner Parathyreozyten (Phasenkontrastmikroskop, 200-fache Vergrößerung)

Bei definierten Geräteeinstellungen konnte ein mittlerer Anfangsdurchmesser (D(A)) der Kapseln von 0,33 ± 0,02 mm ermittelt werden. Der Berstdurchmesser am ersten lokalen Maximum betrug 0,04 ± 0,00 mm. Der Berstdruck (P(B)) wurde mit 3801,66 ± 708,50 kPa bestimmt. Die zum Zerplatzen pro Kapsel aufgewendete Kraft F konnte mit 2,84 ± 0,25 N berechnet werden (Tab.4).

	Abbildung 11:Mikrokapseln enkapsulierter Parathyreozyten in Zellkulturmedium

Tabelle 4: Mechanische Eigenschaften der untersuchten Mikrokapseln

Mittels chromatographischer Messung der Verteilung eines Dextrangemisches zwischen Kapselinnenraum und der Umgebung wurde die Porengröße von vier Chargen der hergestellten Mikrokapseln bestimmt.

Die untere Trenngrenze betrug im Mittelwert 1,25 ± 0,04 nm, die mittlere Trenngrenze, als Maß für die Porengröße, betrug 1,39 ± 0,04 nm und die obere Trenngrenze wurde mit 1,55 ± 0,04 nm bestimmt (Tab.5).

Tabelle 5: Porengrößenbestimmung

	Abbildung 12:Mikrokapseln mit deutlich fokussierten Zellen in der Kapselperipherie (Phasenkontrastmikroskop, 100-fache Vergrößerung)

	Abbildung 13:Elektronenmikroskopische Aufnahme einer Mikrokapsel

(Quelle: Dr. Brigitte Thiersch, Universität Potsdam)

	Abbildung 14:Elektronenmikroskopische Aufnahme der Kapselmembran

(Quelle: Dr. Brigitte Thiersch, Universität Potsdam)

Um die in vitro-Sensitivität der Parathyreozyten zu überprüfen, wurden n=10 Kulturen am Tag 6 des Versuchszyklus in unterschiedlichen Kalziumkonzentrationen inkubiert.

Die Zellkulturen wurden so in einer aufsteigenden Kalziumreihe mit Konzentrationen von 0,5 mmol/l, 1,5 mmol/l, 2,0 mmol/l, 2,5 mmol/l sowie 3,5 mmol/l inkubiert und die jeweilige Parathormonsekretion am Tag 8 des Versuchszyklus bestimmt (Abb.15).

Die Kalziumsensitivität der Parathyreozyten wurde als Differenz zwischen den an Tag 8 bestimmten Hormonwerten und den Ausgangswerten von Tag 6 definiert (Tab.6).

	Abbildung 15: Kalziumsensitivität unverkapselter Parathyreozyten [n=10]

In den Kulturen, in denen dem Medium Kalzium entzogen wurde, konnte mit Werten von 31,3 10,2 % bei 0,5 mmol/l Ca²⁺bzw. 30,80 9,80 % bei 1,5 mmol/l Ca²⁺ein Ansteigen der PTH-Sekretion festgestellt werden.

Unter Zugabe von Kalzium wurde hingegen ein deutliches Abfallen der PTH-Sekretion mit –38,20,97 7,9 % bei 2,5 mmol/l Kalzium bzw. 66,60 10,30 % bei 3,5 mmol/l festgestellt (Tab.6).

Tabelle 6: Veränderung der PTH-Sekretion unverkapselter Parathyreozyten [%] (Differenz der Werte vor und nach Inkubation in unterschiedlichen Kalziumkonzentrationen) [n=10]

Als Parameter für den Funktionszustand der Zellen wurde die PTH-Sekretion gemessen.

Die Parathormonkonzentration wurde im Kulturmedium in n=10 Versuchen jeweils an den Tagen 2, 4, 6, 8, 10 und 12 bestimmt. Die Zellzahl in den Kulturen war unterschiedlich und reichte von 1 x 10⁶ Zellen bis annähernd 100 x 10⁶Zellen.

Die Bestimmung der PTH-Sekretion ergab folgende Werte (jeweils in pg/ml): Tag 2: 371829 240460; Tag 4: 101074 58232; Tag 6: 169680 127819; Tag 8: 156663 122438; Tag 10: 140603 110543; Tag 12: 37745 19612 (Tab.7).

Die einzelnen Zellkulturen waren aufgrund des Gewebes (Adenom oder Hyperplasie) und der Zellzahl sehr heterogen. Um dennoch eine bessere Vergleichbarkeit der Versuche zu erreichen, wurden die Absolutwerte in prozentuale Veränderungen umgerechnet und grafisch dargestellt. Hierbei wurde der PTH-Wert an Tag 2 gleich Hundert gesetzt und die Werte der nachfolgenden Tage als prozentuale Veränderungen zu diesem angegeben (Abb.16).

Abbildung 16:PTH-Verlauf unverkapselter Parathyreozyten [%]

Tabelle 7: PTH-Verlauf unverkapselter Parathyreozyten [n=10] – Absolutwerte [pg/ml]

Um die in vitro-Sensitivität verkapselter, humaner Parathyreozyten zu überprüfen, wurden n =30 verkapselte Zellkulturen am Tag 6 des Versuchszyklus in Kalziumkonzentrationen von 0,5 mmol/l, 1,5 mmol/l, 2,0 mmol/l, 2,5 mmol/l sowie 3,5 mmol/l Kalzium inkubiert und nach 48 h die jeweilige Parathormonsekretion bestimmt. Die Kalziumsensitivität der Parathyreozyten wurde als Differenz zwischen den an Tag 8 bestimmten Hormonwerten und den Ausgangswerten von Tag 6 definiert. Um auch hier eine bessere Vergleichbarkeit der Zellkulturen zu gewährleisten, wurde der Leerwert (2,0 mmol/l Kalzium) gleich Null gesetzt (Abb.17).

Unter Kalziumentzug konnte ein deutlicher Anstieg der PTH-Sekretion beobachtet werden. So wird bei 0,5 mmol/l Kalzium eine Zunahme der PTH-Sekretion von 14 11,00 %, bzw. bei 1,5 mmol/l Kalzium von 10 9,00 % bestimmt (Tab.8).

Wurde dem Medium Kalzium hinzugegeben, konnte die PTH-Sekretion supprimiert werden. Bei 2,5 mmol/l Kalzium wurde ein Abfall von –26 12,00 % bzw. bei 3,5 mmol/l Kalzium von –29 10,00 % bestimmt.

	Abbildung 17:In vitro-Sensitivität enkapsulierter Parathyreozyten

Tabelle 8: Veränderung der PTH-Sekretion enkapsulierter Parathyreozyten [%] (Differenz zwischen den Werten vor und nach Inkubation in unterschiedlichen Kalziumkonzentrationen) [n=10]

	Abbildung 18:Enkapsulierte Parathyreozyten (Phasenkontrastmikroskop, 40-fache Vergrößerung)

Als Parameter für den Funktionszustand der enkapsulierten Parathyreozyten wurde deren PTH-Sekretion in n=30 Versuchen an den Tagen 4 (= erster Tag nach Enkapsulierung), 6, 8, 10 und 12 bestimmt. Die PTH-Probe wurde jeweils aus dem Kulturmedium abgenommen.

über den gesamten Beobachtungszeitraum hinweg konnte ein nahezu linearer Anstieg der PTH-Sekretion der einzelnen Zellkulturen verzeichnet werden. Dies konnte, trotz der sehr heterogenen Zellreihen, in allen Versuchen übereinstimmend beobachtet werden.

Es ergaben sich folgende Werte (Tab.9) (jeweils in pg/ml): Tag 4: 1238 205; Tag 6: 2157 295; Tag 8: 3215 510; Tag 10: 3987 582; Tag 12: 5193 835.

Um die Vergleichbarkeit sowie die Anschaulichkeit der sehr heterogenen Zellkulturen zu verbessern, wurden die Absolutwerte in Relativwerte umgerechnet (Abb.19).

	Abbildung 19:PTH-Verlauf enkapsulierter Parathyreozyten - Relativwerte [%]

Tabelle 9: PTH-Verlauf enkapsulierter Parathyreozyten [pg/ml] [n=30]

Da während des 12-tägigen Versuchszyklus unerwarteterweise ein kontinuierlicher Anstieg der PTH-Sekretion sämtlicher enkapsulierter Zellkulturen zu verzeichnen war, wurde beschlossen, die letzten zehn Versuche über einen längeren Zeitraum zu beobachten.

In diesen Versuchen wurden an den Tagen 40 und 85 zusätzliche PTH-Proben entnommen, um das Langzeitsekretionsverhalten zu überprüfen.

In allen zehn Versuchen wurde übereinstimmend eine weitere, nahezu lineare Zunahme der PTH-Sekretion festgestellt (Tab.10) (Werte jeweils in pg/ml): Tag 4: 1238 287; Tag 6: 2157 354; Tag 8: 3215 656; Tag 10: 3987 1191; Tag 12: 5193 1663; Tag 40: 30484 8686; Tag 85: 54892 287.

Zur Verbesserung der Anschaulichkeit erfolgte die Darstellung in Prozentualwerten (Abb.20).

	Abbildung 20:PTH-Verlauf enkapsulierter Parathyreozyten - Relativwerte [%] (Langzeitversuche) [n=10]

Tabelle 10: PTH-Verlauf enkapsulierter Parathyreozyten - Absolutwerte [pg/ml]
(Langzeitversuche)