Diskussion

4.1 Bisherige Behandlungsansätze des postoperativen Hypoparathyreoidismus

↓65

Der permanente, postoperative Hypoparathyreoidismus - Schätzungen zufolge sind alleine in Deutschland jährlich circa 1500 Menschen davon betroffen - stellt eine wesentliche Komplikation von Schilddrüsenoperationen dar.

↓66

Bei gegebener vitaler Gefährdung des Patienten durch tetanische Krampfanfälle ist eine lebenslange Kalzium- und Vitamin D-Substitution notwendig. Diese vermag jedoch in vielen Fällen nicht die vielfältigen Stoffwechselwirkungen des PTH zu ersetzen.

Zahlreiche Autoren16 , 17 ,berichteten über die erfolgreiche Allotransplantation von humanem Nebenschilddrüsengewebe unter Immunsuppression.

Da eine lebenslange Immunsuppression bei der Transplantation von parathyreoidalem Gewebe unverhältnismäßig erscheint, wurde nach gangbaren Alternativen ohne Immunsuppression gesucht: Yao et al. berichteten über die erfolgreiche Allotransplantation in den zerebralen Seitenventrikel von Ratten ohne Immunsuppression und zeigten so den offensichtlich privilegierten Immunstatus dieser Lokalisation20.

↓67

Verschiedene Konzepte zielten darauf ab, die Immunantwort des Transplantatempfängers durch Reduktion sogenannter passenger cells – spezialisierter Zellpopulationen, wie Lymphozyten, Makrophagen sowie dentritische Zellen, die sowohl MHC I- als auch MHC II- Antigene exprimieren - zu modulieren. Mehreren Arbeitsgruppen gelang dies durch die in vitro-Kultivierung des Spendergewebes. Es konnte so ein zeitweiliges Überleben der Allotransplantate ohne Immunsuppression erreicht werden21 , 23 , 24 , 25. Feind et al. konnten auf diese Weise im Tierversuch eine Überlebenszeit des allogenen Spenderorgans von mehreren Monaten ohne Immunsuppression und ohne Substitution von Kalzium oder Vitamin D erreichen26.

Eine andere Forschergruppe transplantierte humanes Parathyreozytengewebe unter die Nierenkapsel von Nacktmäusen, die dabei als Zwischenwirt dienen. Im nichtimmunsupprimierten, HLA-A sowie B inkompatiblen Empfängertier konnte so eine längere Überlebenszeit des Transplantates erreicht werden22.

Die Mikroverkapselung von humanem Nebenschilddrüsengewebe zeigt einen vielversprechenden therapeutischen Ansatz in der Behandlung des parathyreopriven, postoperativen Hypoparathyreoidismus auf.

↓68

Erfolgreiche in vivo und in vitro Experimente mit verkapselten Parathyreozyten wurden bereits in den neunziger Jahren von Hasse et al. beschrieben: 1994 gelang dieser Arbeitsgruppe im Langzeitversuch die Allotransplantation von enkapsuliertem Nebenschilddrüsengewebe im Tiermodell ohne Immunsuppression. Gewebepartikel der Nebenschilddrüsen wurden, nach Isolation und Gewebekultur, mit Bariumalginat verkapselt und hypokalzämischen Ratten verpflanzt. Diese zeigten auch nach einem Beobachtungszeitraum von 90 Tagen noch normale Serumkalziumkonzentrationen38 , 39 , 40.

Wenig später gelang ebenfalls Hasse et al. die erste experimentelle parathyreoidale Xenotransplantation ohne Immunsuppression36.

Eine italienische Forschungsgruppe beschrieb Versuche mit alginatverkapselten Parathreozyten aus primären Monolayerkulturen. In einer in vitro Studie zeigten die mikroverkapselten gegenüber den unverkapselten Zellen der Vergleichsgruppe eine bessere PTH-Sensitivität sowie eine höhere Hormonsekretion68.

↓69

Erste klinische Erfolge mit alginatverkapselten Nebenschilddrüsenpartikeln gelang 1997 ebenfalls der Marburger Arbeitsgruppe um Hasse et al. Zwei weiblichen Patientinnen, die nach subtotaler, bilateraler Schilddrüsenresektion an einer postoperativen Hypokalzämie litten, wurden mikroverkapselte Parathyreozyten in die Unterarmmuskulatur eingepflanzt. Bei beiden konnte eine vorübergehende Besserung der klinischen Symptomatik bei halbierter Substitutionsmedikation erreicht werden41.

4.2 
Substanzen zur Mikroenkapsulierung

Grundlage einer funktionsfähigen Mikrokapsel ist ein optimales Verhältnis zwischen ausreichender nutritiver Permeabilität, die eine möglichst dünne Membran erfordert, und eine ausreichende mechanische Stabilität, die eine eher dickere Membran verlangt. Alginat ist das bisher am häufigsten eingesetzte Material für die Bildung von Mikrokapseln. Es kann sowohl alleine als auch in Kombination mit positiv geladenem Polylysin eingesetzt werden. Gebräuchlich sind auch durch divalente Kationen (v.a. Kalzium und Barium) quervernetzte und somit stabilere Alginate. In diesem Verfahren werden die Zellen mit einer 1-3 % Alginatlösung vermischt und die Tropfen während ca. 5 min. in einem 1 %igen Bad aus beispielsweise CaCl2 quervernetzt. Optional können die Tropfen anschließend in einem 0,05 - 0,1 % Bad aus Poly-l-Lysin präzipitiert werden, um eine zusätzliche äußere Membran zu schaffen69.

Agarose ist ein weiteres, aus Seealgen hergestelltes Enkapsulierungsmedium. Es handelt sich hierbei um ein sich thermisch verfestigendes Material. Bei höheren Temperaturen liegt es flüssig vor und verfestigt sich beim Abkühlen. Entscheidender Nachteil ist die im Langzeitverhalten mangelhafte immunisolatorische Eigenschaft dieses Stoffes70.

↓70

Bessere Eigenschaften diesbezüglich scheint eine weiterentwickelte Multilayer-Agarose-kapsel zu besitzen: Diese modifizierte Mikrokapsel besteht aus einem Gemisch aus Agarose und Polystyrensulfonsäure (PSSa) mit einer äußeren Schicht aus Carboxymethylcellulose (CMC). Der Zusatz von PSSa scheint die Fähigkeit zu besitzen, Komplementaktivität durch eine Interaktion mit Komplementproteinen unterdrücken zu können. Im in vivo-Modell konnte eine längere Funktionsfähigkeit des Transplantates im Vergleich zur konventionellen Agarosekapsel gezeigt werden71.

Sefton et al. entwickelten Mikrokapseln aus einem synthetischen, wasserunlöslichen Polymer (Polyacrylate einschließlich Polyacrylmethylmethacrylat (PMMA), Hydroxyethylmethacrylat-Methylmethacrylat (HEMA-MMA) und Eudragit). Diese scheinen gegenüber den wasserlöslichen Acrylaten Vorteile in bezug auf Biokompatibilität und Festigkeit zu besitzen. Polyacrylate wurden bisher für die Enkapsulierung von Inselzellen sowie PC-12 Zellen sowohl in vitro als auch in vivo eingesetzt72 , 73.

Dautzenberg entwickelte Anfang der achziger Jahre ein Enkapsulierungssystem auf Basis der gegensätzlich geladenen Polyelektrolyte Natriumcellulosesulfat und Polydiallyldimethylammoniumchlorid, NaCS / Poly-DADMAC.

↓71

Die Verkapselung erfolgt hierbei über ein einfaches Ein-Schritt-System. Toxizitätsstudien konnten bisher keinerlei mitogene oder toxische Eigenschaften nachweisen55.

Die Mikroverkapselung mit NaCS und Poly-DADMAC wird seit den neunziger Jahren auf verschiedenen Gebieten der Medizin und Biotechnologie erfolgreich experimentell eingesetzt37 , 48 , 74.

In dieser Arbeit wird erstmalig die Eignung von NaCS und Poly-DADMAC für die Mikroverkapselung von kryokonservierten, humanen Nebenschilddrüsenzellen geprüft.

4.3 Biokompatibilität und Immunkompatibilität

↓72

Voraussetzung für die Verkapselung lebender Zellen ist die Bio-und Immunkompatibilität des Verkapselungsmaterials. Eine fibrotische Gewebsreaktion, eine Makrophagenaktivierung sowie die Freisetzung von Zytokinen und zytotoxischen Stoffen sollte idealerweise nicht vorhanden oder nur sehr gering ausgeprägt sein. Direkte Konsequenz eines nicht-biokompatiblen Verfahrens ist die Fibrosierung mit nachfolgendem Funktionsverlust des Transplantates. Kapselgröße, äußere Beschaffenheit der Membran, enkapsuliertes Gewebe und das zur Verkapselung verwendete Material gelten als die Hauptparameter, die eine mögliche Reaktion des Empfängers beeinflussen können75.

Die Empfängerimmunantwort beginnt üblicherweise mit der Absorption von Zelladhäsionsproteinen, Immunglobulinen, Komplementkomponenten, Wachstumsfaktoren und anderen Serumproteinen an der Oberfläche der transplantierten Mikrokapsel. Die Spezifität und Menge der absorbierten Proteine ist abhängig vom verwendeten Enkapsulierungsmaterial76 , 77 , 78.

Bei der akuten Entzündungsreaktion sind vor allem eosinophile und polymorphkernige Granulozyten anwesend, während die chronische Entzündungsreaktion durch Makrophagen, Fibroblasten und Fremdkörperriesenzellen gekennzeichnet ist.

↓73

Die Implantation von Biomaterialien kann zu einer ausgeprägten Entzündungsreaktion führen, die sich hauptsächlich in einem Überwuchs des Materials mit fibroblastenähnlichen und makrophagenähnlichen Zellen manifestiert79. Eine wichtige Rolle bei der Adhäsion von Entzündungs- und Immunzellen an die Oberfläche von Mikrokapseln spielt die Interaktion ihrer Oberflächenrezeptoren mit absorbierten Proteinen an der Kapseloberfläche80.

Siebers et al. wiesen nach, dass der Grad der Fibrosierung transplantierter Alginatkapseln zunimmt, je differenter Spender- und Empfängergewebe sind81.

Offensichtlich wird die Adhäsion von Zellen nicht nur durch das verwendete Kapselmaterial, sondern auch durch das verkapselte Gewebe verursacht: Es konnte gezeigt werden, dass implantierte leere Mikrokapseln frei von adhärierten Zellen blieben, während Kapseln, die xenogene Zellen enthielten, eine Makrophagenaktivierung in vitro und eine fibrotische Reaktion in vivo auslösten82. Die Zerstörung des xenogenen Materials innerhalb der Kapsel wird möglicherweise durch von untergegangenen verkapselten Zellen freigesetzte und nach außen diffundierte Antigene ausgelöst. Diese Antigene werden u.a. von Makrophagen phagozytiert und CD4+ T-Zellen präsentiert, wodurch schließlich die Entzündungsreaktion ausgelöst wird, die in der Zerstörung der verkapselten Zellen mündet.

↓74

Iwata et al. konnten die Menge der freiwerdenden xenogenen Antigene durch in vitro Kultivierung der Agarosekapseln vermindern. Hierdurch konnte offensichtlich eine Erholung der enkapsulierten Zellen erreicht und die Freisetzung von Antigenen reduziert werden83.

Die Kapselmembran dient als physikalische Barriere, um einen Kontakt zwischen transplantiertem Gewebe und Immunsystem zu verhindern. Faktoren, wie molekularer Aufbau, dreidimensionale Struktur, elektrostatische Ladung sowie intra- und extrakapsuläre Konzentrationen sind wichtige Faktoren, die die Diffusionsrate von Molekülen an der Kapselmembran beeinflussen können. Gelingt es Immunglobulinen, die Membran zu penetrieren, wird die Komplementkaskade aktiviert, was im Untergang der transplantierten Zellen mündet83.

Die Effektorphase sowohl des unspezifischen als auch des spezifischen Immunsystems wird zu einem großen Teil durch Gewebshormone, so genannte Zytokine, ausgelöst.

↓75

Folgende Zytokine sind an einer Entzündungsreaktion gegen enkapsulierte Zellen beteiligt: Interferon (INF ), Interferon (INF ), Interleukin-15 (IL-15), Interleukin-12 (IL-12), Tumornekrosefaktor (TNF ), Interleukin-1 (IL-1), Interleukin-6 (Il-6) und Interleukin-10 (IL-10) .

Der Effekt von Zytokinen und Wachstumsfaktoren wird in zwei Phasen unterteilt: In der Akutphase verstärken TNF und Interleukin-1 die T-Zell-initiierte Entzündungsreaktion.

In der chronischen Phase stimulieren die selben Zytokine Fibroblasten zur Proliferation und Kollagenproduktion. Folge der von den aktivierten Makrophagen freigesetzten Zytokinen ist die Bildung von fibrotischem Gewebe um die transplantierte Mikrokapsel.

↓76

Die fibrotische Gewebsreaktion ist das Ergebnis einer Überempfindlichkeitsreaktion vom verzögerten Typ, wenn die Elimination des Fremdantigens erfolglos geblieben ist. Aufgrund ihres niedrigen Molekulargewichtes können Zytokine leicht die semipermeable Kapselmembran durchdringen und zu einer Beschädigung der enkapsulierten Zellen führen84.

Die Verwendung eines Alginat/Polylysin-Komplexes für die Enkapsulierung von Langerhans-Inseln ist die häufigste und somit am besten erforschte bisherige Anwendung eines Zellverkapselungssystems. Entsprechend groß ist die Zahl der vorhandenen Publikationen verschiedener unabhängiger Forschungsgruppen hierzu.

Seit der erstmaligen Anwendung durch Lim und Sun34 wurde das ALG/PLL–System mehrfach modifiziert108, um eine Reduzierung der Empfängerimmunantwort auf die transplantierten Alginatkapseln zu erreichen.

↓77

Biokompatible Alginat/PLL-Kapseln zeichnen sich durch hohe mechanische Stabilität und eine glatte Oberfläche aus. Diese Eigenschaften werden durch die Verwendung eines höher viskosen anstelle eines niedrig viskosen Alginates erzielt.

Zunehmende Hydrophilie im Kapselinneren und ein daraus resultierendes Anschwellen der Kapseln durch freiwerdendes Kalzium nach dem Enkapsulierungsprozess konnte verhindert werden, indem durch die Verwendung von Na2SO4 divalentes Kalzium gegen monovalentes Natrium ausgetauscht wurde85.

Eine Forschungsgruppe um Schneider et al. konnte durch eine Modifikation der Membraneigenschaften eine verbesserte Diffusionskapazität und Insulinantwort erreichen86.

↓78

In in vivo Versuchen wurde ein Zusammenhang zwischen Kapseldurchmesser und Empfängerimmunantwort bei der Transplantation von verkapselten Langerhans-Inseln entdeckt: Die Reduzierung des Kapseldurchmessers von 800 µm auf 500 µm war mit einer Erhöhung des Anteils unzureichend enkapsulierter Zellen assoziiert. Hieraus wurde eine stärkere Empfängerimmunantwort und somit eine verminderte Transplantatfunktion abgeleitet87.

Als Hauptursache für eine unzureichende Transplantatfunktion zeigten sich die Fibrosierung sowie mitogene Eigenschaften der transplantierten Alginat-Mikrokapseln:

Kommerziell eingesetzte Alginate sind aufgebaut aus variablen homopolymerischen Regionen aus -D-Mannuronsäure (sog. M-blocks) und -L-Guluronsäure (sog. G-blocks) sowie alternierenden Regionen (sog. MG-blocks).

↓79

Alginate mit einem hohen Anteil an Mannuronsäure stimulieren offensichtlich Monozyten zur Produktion von proinflammatorischen Substanzen wie TNF, Interleukin-1 und Interleukin-6 und rufen somit eine Entzündungsreaktion sowie eine humorale Immunantwort hervor.

Zimmermann et al. konnten in der Elektrophorese nachweisen, dass Alginate mindestens zehn bis zwanzig Fraktionen unterschiedlicher elektrophoretischer Mobilität enthielten, die mitogene Eigenschaften besaßen.

Diese mitogenen Anteile konnten elektrophoretisch separiert werden. Die somit aufgereinigten Alginate zeigten in in vitro und in vivo-Versuchen keine mitogenen Eigenschaften mehr37 , 88. Der unerwünschte Effekt der Fibrosierung konnte um 90 % reduziert werden. Weiterhin zeigte sich, dass durch eine Erhöhung des Anteils an Glukoronsäure die mechanische Stabilität und somit ein Anschwellen der Kapseln mit der Folge einer fibrotischen Überwucherung verhindert werden konnte89 , 90.

↓80

Die Überlebenszeit der Mikrokapseln blieb jedoch weiterhin auf eine Zeitspanne von sechs bis zehn Wochen beschränkt. Es wurde postuliert, dass unzureichende Nutrition aufgrund mangelnder Blutversorgung der verkapselten Zellen hierfür verantwortlich ist91 , 92. Unterstützt wurde diese Annahme durch die Beobachtung, dass der größte Anteil nekrotischer Zellen im Kapselinneren zu finden war.

Bei der Transplantation von Mikrokapseln aus Natriumcellulosesulfat in die Bauchhöhle konnte während eines zehnmonatigen Beobachtungszeitraumes weder eine Entzündungsreaktion noch eine aseptische Peritonitis beobachtet werden74.

Zusammenfassend sind drei Aspekte der Bio- und Immunokompatibilität zu berücksichtigen93 , 94.

↓81

  1. Die Reaktion des enkapsulierten Gewebes auf die Verkapselung
  2. Fremdkörperreaktion des Empfängers gegen die Mikrokapseln
  3. Immunologische Reaktion des Empfängers gegen das verkapselte Spendergewebe.

4.4 
Mikroenkapsulierung – Auswahl bisheriger Anwendungen

Die Verwendung von semipermeablen Mikrokapseln zur Immobilisierung von Zellen repräsentiert eine wirkungsvolle Methode, einerseits eine nutritive Versorgung des verkapselten Gewebes und die freie Passage von Zellprodukten sicherzustellen und andererseits dessen immunologische Rejektion zu verhindern.

Die therapeutischen Anwendungsmöglichkeiten der Mikroenkapsulierungstechnologie sind vielfältig:

↓82

Der erstmalige erfolgreiche Einsatz der Mikroenkapsulierungstechnologie gelang Lim et al. 1980 mit der Verkapselung von Langerhans-Inseln des Pankreas zur Therapie des insulinabhängigen Diabetes mellitus Typ I34.

Zahlreiche Forschungsgruppen arbeiteten seither an der Verkapselung von Langerhans-Inseln. Trotz vielversprechender Ergebnisse bei der Transplantation von mikroverkapselten Insulin-produzierenden Zellen in in vivo Versuchen95 blieb der klinische Einsatz bisher auf eine geringe Anzahl von Fällen beschränkt96 , 97 , 98.

Probleme der Biokompatibilität standen hierbei anfangs im Vordergrund: Die Insulinsekretion wurde durch in situ-Fibrosierung der transplantierten Alginat-Kapseln stark eingeschränkt. Durch Verwendung eines hochaufgereinigten Alginates konnte dieses Problem reduziert werden. Die Funktionsdauer der Transplantate blieb jedoch weiterhin beschränkt99 , 100.

↓83

Im Tiermodell konnte mit der Verkapselung von genetisch veränderten, Erythropoetin-produzierenden Myoblasten ein vielversprechender Ansatz in der Behandlung von Anämien unterschiedlichster Genese aufgezeigt werden101.

Eine andere Anwendung verfolgt eine Forschungsgruppe der Abteilung für HNO an der Charité in Berlin102: Die autologe Verpflanzung von Knorpelgeweben ist eine allgemein akzeptierte Methode in der Wiederherstellungschirurgie. Die Empfängerimmunantwort bei allogener Transplantation führt jedoch in vielen Fällen zur Instabilität des Transplantates oder induziert eine chronische Entzündungsreaktion. Im Mausmodell konnte durch die Makroverkapselung von Knorpelgewebe eine signifikante Reduzierung der Entzündungsreaktion im Vergleich zur Kontrollgruppe erreicht werden. Die verkapselten Gewebe zeigten keinerlei Degenerationszeichen102.

Tobias et al. erprobten die Allotransplantation von mikroverkapselten BDNF-produzierenden Fibroblasten ohne den Einsatz von Cyclosporin A im Tiermodell103. Die BDNF-produzierenden Kapseln wurden in das geschädigte Rückenmark von adulten Ratten transplantiert. Die Vitalität der Zellen konnte noch nach einem Beobachtungszeitraum von vier Wochen nachgewiesen werden. Im Vergleich zur zellfreie Kapseln enthaltenden Kontrollgruppe zeigte sich in der Umgebung von Kapseln, die BDNF-produzierende Zellen enthalten, ein erhöhtes Wachstum von Axonen und Dendriten103.

↓84

Die Blut-Hirn-Schranke stellt eine Schutzfunktion zwischen Gefäßsystem und Hirnparenchym dar. Sie bereitet jedoch häufig Probleme in der Versorgung des Gehirns mit pharmakologisch wirksamen Substanzen oder Metaboliten104.

Eine Möglichkeit zur Überwindung der Blut-Hirn-Schranke stellt die Mikroverkapselung und intrazerebrale Transplantation von Zellen dar, die stoffwechselaktive Metabolite produzieren105.

Date et al. gelang es, enkapsulierte dopaminproduzierende Zellen in das Striatum von hemiparkinsonoiden Primatenaffen zu verpflanzen. Die Dopaminproduktion konnte noch nach 12 Monaten nachgewiesen werden. Es gab keinerlei Anzeichen einer Immunantwort und die histologische Reaktion des Umgebungsgewebes war gering. Klinisch konnte eine Verminderung des Tremors an den Händen der Versuchsaffen beobachtet werden106.

↓85

Zu ähnlich positiven Ergebnissen kamen Xue et al. Die Verpflanzung von mikroverkapselten, dopaminproduzierenden, chromaffinen Zellen in das Striatum von hemiparkinsonoiden Versuchsratten führte ebenfalls zu einer Verbesserung der klinischen Symptomatik107.

(modifiziert nach: Li, Materials for immunoisolated cell transplantation)108

Polymer

Zell- / Gewebetyp

Modell /
Empfänger

HEMA-MMA1 und

Versch. Polyacrylate

PC-12

humane Fibroblasten

Inselzellen (Ratten)

HepG 2

in vitro

in vitro

in vitro

in vitro

ALG/PLL – PEI2

Inselzellen

Ratte

ALG/PLL – ALG3

mGH-C2C12 Myoblasten

Inselzellen

Humane Inselzellen

Hepatozyten (Ratte)

Hepatozyten (Ratte)

Adrenerge chromaffine Zellen (Kalb)

PC12

Inselzellen (Ratte)

Maus

Ratte

humanes Peritoneum

Gunn –Rattenmodell

Peritoneum (Ratte)

Nagetier

Primatenaffen

Ratte

NaCS / Poly-DADMAC4

humane Parathyreozyten

Knorpelzellen

antikörperproduzierende Zellen

humane Hepatozyten

in vitro

Maus

in vivo

in vitro

ALG-Komplex

Guinea-Schwein

in vitro

HEMA – co – MMA

Erythrozyten

Ba – ALG

Inselzellen (Ratte)

Porcine Inselzellen

Maus

Maus

Agarose

B6 Inselzellen (Maus)

Inselzellen (Hamster)

Maus

Maus

Agarose/PSS/PB/CMC5

PC-12

Inselzellen (Ratte)

Guinea-Schwein

Maus

Photo – quervernetzte PVA

Inselzellen (Maus)

Peritoneum (Maus)

4.5 
Bewertung der eigenen Ergebnisse

4.5.1 Unverkapselte Parathyreozytenkulturen

↓86

Für diese Arbeit wurden in zehn Versuchen unverkapselte Parathyreozyten untersucht. Die Bestimmung des zeitlichen PTH-Verlaufes sowie der PTH-Sekretionsantwort auf unterschiedliche extrazelluläre Kalziumkonzentrationen sollten Aufschluss über das in vitro Verhalten der Parathyreozyten geben und für die späteren Verkapselungsversuche als Vergleichsgrösse dienen.

Die Viabilität der Nebenschilddrüsenzellen nach Anlegen der Zellkultur am Tag 1 betrug durchschnittlich 72 11,7 % und erhöhte sich bis zu Tag 3 des Versuchszyklus aufgrund der Lyse avitaler Zellen auf durchschnittlich 95 4,3 %.

Die nekrotische Zellfraktion sowie der hohe Anteil an Zelltrümmern nach Aufarbeitung war sowohl bedingt durch die Prozessierung der kryokonservierten Zellen zur Zellsuspension als auch durch die Kryokonservierung selbst.

↓87

Wagner führte in seiner Habilitationsschrift die Nekroserate kryokonservierter Parathyreozyten größtenteils auf Zellschäden zurück, die beim Einfrieren und Auftauen der Präparate entstehen44. In seinen Untersuchungen konnte er keinen nennenswerten Einfluss der Dauer der Kryokonservierung auf die Viabilität der Zellen feststellen. Dies deckt sich mit den Erfahrungen, die in der vorliegenden Arbeit gemacht wurden: Die durchschnittliche Konservierungsdauer betrug zwei Jahre. Es wurden jedoch auch Epithelkörperchen mit einer Lagerungsdauer von bis zu zehn Jahren aufgearbeitet, ohne dass nennenswerte Unterschiede bezüglich der Viabilität festgestellt wurden.

Das in vitro Sekretionsverhalten der Parathyreozyten wurde durch Inkubation der Zellen in einer aufsteigenden Kalziumreihe mit Konzentrationen von 0,5, 1,5, 2,0, 2,5 sowie 3,5 mmol/l Kalzium überprüft.

Da es sich hierbei um sehr heterogene Zellkulturen handelte, wurde der jeweilige Leerwert (2,0 mmol/l) in der Testreihe gleich Null gesetzt, um eine bessere Vergleichbarkeit der einzelnen Werte zu erreichen. In den Kulturen, in denen dem Medium Kalzium entzogen wurde, kann ein Ansteigen der PTH-Sekretion festgestellt werden. Durch Kalziumzugabe wurde die PTH-Sekretion supprimiert. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen anderer Autoren konnte so eine adäquate PTH-Antwort der Nebenschilddrüsenzellen auf unterschiedliche Kalziumkonzentrationen nachgewiesen werden48 , 109.

↓88

Der PTH-Verlauf der Zellkulturen wurde über 12 Tage hinweg beobachtet. An Tag 2 konnte ein maximaler PTH-Wert von annähernd 2,5 Mio pg/ml beobachtet werden. Die Zellkulturen bildeten innerhalb des Beobachtungszeitraumes dichte Kulturen aus. Eine wesentliche Reduzierung der Zellzahlen konnte phasenkontrastmikroskopisch nicht festgestellt werden. Bei hohem standard error of the means konnte ein zeitliches Absinken der PTH-Sekretion der Zellen beobachtet werden. Die im zeitlichen Verlauf abnehmende in vitro Sekretionsleistung der Parathyreozyten konnte bei allen Kulturen, trotz teilweise erheblichen Unterschieden in den einzelnen Werten, festgestellt werden und deckte sich im wesentlichen mit den Erfahrungen anderer Autoren bei der Kultivierung kryokonservierter Parathyreozyten48 , 44.

Mögliche Einflüsse der Kryokonservierung auf die Sekretionsleistung oder Steuerbarkeit von Nebenschilddrüsenzellen konnte Wagner in einer Vergleichsstudie ausschließen44.

4.5.2 Bewertung des Verkapselungsverfahrens

Zu Beginn der Versuche war es notwendig, die Verkapselungsmedien NaCS und Poly-DADMAC in ihren Eigenschaften zu überprüfen und den Encapsulator AP auf die spezifische Anwendung mit Natriumcellulosesulfat zu optimieren.

↓89

Hierzu galt es, die Variablen NaCS-Temperatur, Aushärtezeit der Kapseln sowie Geschwindigkeit, Frequenz und Amplitude des Tropfenstrahls aufeinander abzustimmen.

Als ein Hauptproblem in den Vorversuchen erwies sich zunächst die teilweise ungenügende Aushärtung sowie die daraus resultierende Verklebung der Mikrokapseln. Durch eine Verlängerung der Aushärtezeit im Fällbad konnte dieses Problem reduziert werden. Eine prolongierte Verweildauer der Mikrokapseln im Präzipitationsbad führte jedoch zu einer Verschiebung des osmotischen Gradienten zwischen Kapselinneren und seiner Umgebung, was Einziehungen an der Kapselmembran und die Entstehung der sogenannten Rosinenform zur Folge hatte. Die Aushärtezeit wurde im Laufe der Versuche so optimiert, dass einerseits ein Verkleben der Kapseln minimiert wurde, andererseits eine runde Kapselmembran für einen optimalen Substrataustausch geschaffen wurde.

Nach Einhaltung weitgehend konstant gehaltener Versuchsparameter und Geräteeinstellungen erwies sich die Verkapselung mit NaCS / Poly-DADMAC als relativ unkompliziert und die Eignung als schnelles, reproduzierbare Ergebnisse erzielendes Ein-Schritt-Verfahren konnte bestätigt werden. Hieraus ergeben sich deutliche Vorteile im Vergleich zu dem aus mehreren Arbeitsschritten und somit größere Fehlerquellen beinhaltendem Verkapselungssystem aus Alginat / Polylysin55.

↓90

Die Größe der in diesen Versuchen hergestellten Mikrokapseln mit einem Mittelwert von 0,33 ± 0,02 mm war relativ einheitlich, was sowohl als Zeichen der guten Reproduzierbarkeit gewertet werden kann als auch Voraussetzung für den klinischen Einsatz der Kapseln ist.

Uludag et al. bewerteten Mikrokapseln (hierzu rechneten sie Kapseln mit Durchmessern von 0,3 - 1,5 mm) als vorteilhafter in Bezug auf die Immunkompatibilität sowie die Diffusionskapazität von Substraten75.

Die Porengrößenbestimmung der Kapselmembran ergab als Maß für die Porengröße eine mittlere Trenngrenze von 1,39 ± 0,04 nm. Eine Porengröße von 2 nm entspricht in etwa der Größe eines Moleküls mit einer Molmasse von 20000 Dalton108. Das IgG als kleinstes Immunglobulin besitzt ein Molekulargewicht von 150000 Dalton, ist also wesentlich größer und kann so die vorhandene Kapselbarriere nicht durchdringen.

↓91

Parathyrin hingegen liegt mit einem Molekulargewicht von 9500 Dalton deutlich unter der mittleren Trenngrenze und kann die semipermeable Membran frei passieren.

Die mechanische Stabilität der Mikrokapseln ist eine wichtige Vorraussetzung für den klinischen Einsatz. Bei zahlreichen Versuchen mit Alginatkapseln kam es aufgrund mangelnder Festigkeit zu einem Aufbrechen der Kapseln mit nachfolgender Fibrosierung des Transplantates108 , 94. Dautzenberg et al. bestimmten experimentell ein Minimum von 0,5 N (Kraft, die zum Bersten der Kapsel führt) für eine sichere Handhabung von Mikrokapseln. In den vorliegenden Versuchen konnten mittlere Werte für die Kraft F / Kapsel von 2,84 ± 0,25 N bestimmt werden55.

Die Kapseln wiesen eine wechselnde, jedoch stets dichte Auskleidung mit Zellen auf. Phasenkontrastmikroskopisch konnte eine Migration der Zellen vom Zentrum in Richtung Kapselperipherie nachgewiesen werden. Dies wird auf die dort offensichtlich besseren nutritiven Bedingungen zurückgeführt.

↓92

Übereinstimmend mit den Ergebnissen anderer Autoren110 , 111 konnte keine sichtbare Zerstörung der Zellen durch den Verkapselungsprozess festgestellt werden.

Die metabolische Leistungsfähigkeit kann durch den Nachweis der PTH-Produktion und die vorhandene Steuerbarkeit durch Kalziumsuppression als bewiesen gewertet werden.

4.5.3 Bewertung der Kalziumsensitivität enkapsulierter Parathyreozyten

Ziel dieser Arbeit war es, in einer in vitro Studie die Eignung von Natriumcellulosesulfat und Poly-DADMAC zur Verkapselung von kryokonserviertem, humanem Nebenschilddrüsengewebe zu überprüfen. In diesem Zusammenhang sollten die Verträglichkeit von enkapsulierten Zellen und den zur Verkapselung verwendeten Komponenten evaluiert sowie eventuelle negative Auswirkungen auf das Sekretionsverhalten ausgeschlossen werden.

↓93

Für den klinischen Einsatz ist die physiologische Reaktionsfähigkeit der verkapselten Zellen im Rahmen der Kalziumhomöostase unabdingbar.

Die in vitro Sensitivität der enkapsulierten Parathyreozyten im Kalziumsuppressionstest stellt in diesem Zusammenhang einen entscheidenden Parameter für die Beurteilung des Zustandes des verkapselten Zellmaterials dar109.

Hierbei wird die Kalziumsensitivität der Parathyreozyten als Differenz zwischen den vor und nach Anlegen der aufsteigenden Kalziumreihe bestimmten Hormonwerten definiert.

↓94

Die durch eine semipermeable Membran immobilisierten Parathyreozyten zeigten eine Erhöhung der PTH-Sekretion unter Kalziumentzug von 14 11 % (0,5 mmol/l Kalzium) bzw. 10 9 % (1,5 mmol/l Kalzium) sowie eine Supprimierbarkeit der PTH-Sekretion unter Kalziumzugabe von –26 12 % (2,5 mmol/l Kalzium) bzw. –29 10 % (3,5 mmol/l Kalzium).

Im Vergleich zur Gruppe unverkapselter Parathyreozyten konnte eine bessere Sensitivität der Zellen bei deutlich niedriger Standardabweichung bestimmt werden.

Aufgrund der vorliegenden Ergebnisse kann eine erhaltene Steuerbarkeit von durch Parathyreozyten nach Enkapsulierung mit NaCS / Poly-DADMAC als bewiesen gewertet werden.

4.5.4 Bewertung der PTH-Sekretion enkapsulierter Parathyreozyten im zeitlichen Verlauf

↓95

Die PTH-Sekretion der enkapsulierten Parathyreozyten wurde über einen Zeitraum von 12 Tagen [n=30] bzw. 85 Tagen [n=10] bestimmt.

In dem 12-tägigen Beobachtungszeitraum konnte ein kontinuierlicher Anstieg der PTH-Sekretion im Medium gemessen werden. Noch deutlicher konnte dies in den Langzeitversuchen gezeigt werden: Hier wurde ein nahezu linearer Zuwachs der gemessenen PTH-Werte auf der Zeitachse verzeichnet.

Diese Zunahme des PTH-Verlaufes war sehr gut reproduzierbar und findet sich in fast allen Versuchen. Im Vergleich zur Kontrollgruppe unverkapselter Zellen, bei denen tendenziell ein Absinken der PTH-Sekretion während des Beobachtungszeitraumes beobachtet wurde, konnte also durch die Mikroverkapselung eine Zunahme der gemessenen Hormonwerte erreicht werden.

↓96

Ähnliche Ergebnisse, wenngleich mit weniger deutlichem Anstieg der PTH-Sekretion, erzielten Picariello et al. bei der Mikroverkapselung humaner Parathyreozyten mit ALG/PLL68. Im Vergleich zwischen unverkapselten Monolayerkulturen und alginatverkapselten Parathyreozyten zeigte die enkapsulierte Gruppe eine höhere Hormonfreisetzung in einem zehntägigen Versuchszyklus.

Mögliche Erklärung für die bessere hormonelle Sekretionsleistung enkapsulierter Zellen ist die dreidimensionale Struktur der Mikrokapseln. Die Einbettung in eine flüssige, extrazelluläre Matrix aus Natriumcellulosesulfat bietet offensichtlich nutritive und metabolische Vorteile im Vergleich zur Kultivierung in Einzelzellsuspension und kommt dem natürlichen Aufbau einer Nebenschilddrüse näher. Die extrazelluläre Matrix bietet den Zellen die Möglichkeit, ihre differenzierten Funktionen auszuüben und unterstützen sie insgesamt in ihrer Formation zueinander, um eine optimale Funktion und Viabilität zu erreichen112 , 113.

Die Mikroverkapselung von Nebenschilddrüsenzellen mit NaCS / Poly-DADMAC scheint also neben den immunisolatorischen Eigenschaften zusätzlich einen positiven Einfluss auf die Funktion der verkapselten Zellen zu haben.

↓97

Neben der erhaltenen guten Kalziumsensitivität wird das in diesen in vitro Versuchen ermittelte PTH-Sekretionsverhalten der verkapselten Parathyreozyten als Zeichen einer guten Kompatibilität des Systems Natriumcellulosesulfat / Poly-DADMAC und dem verkapselten Zellmaterial bewertet.


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28.01.2005