Ergebnisse

Viabilität und Morphologie humaner Parathyreozyten in Zellkultur

Die Viabilität der Parathyreozytenkulturen wurde direkt nach Aufarbeitung (Tag 1) sowie am Tag der Verkapselung (Tag 3) bestimmt.

Am Tag 1 betrug die Viabilität durchschnittlich 72 11,7 %. Die Zellkulturen enthielten aufgrund der Kryokonservierung und der Präparation einen hohen Anteil an Zelltrümmern und avitalen Zellen.

Der Erythrozytenanteil nach Aufarbeitung war sehr hoch und übertraf den Anteil der Parathyreozyten um annäherungsweise den Faktor Hundert. Durch Autolyse reduzierte sich ihre Zahl sehr schnell, so dass nach 48 h praktisch keine Erythrozyten mehr nachweisbar waren.

Abbildung 8:Einzelzellkultur humaner Parathyreozyten (Phasenkontrastmikroskop, 100-fache Vergrößerung)

Da innerhalb der ersten 2 Tage in Kultur ein Großteil der avitalen Zellen lysierte, konnte an Tag 3 eine Viabilität von 95 ± 4,3 % bestimmt werden (Tab.9). Phasenkontrastmikroskopisch konnten einheitliche Parathyreozytenkulturen mit einem geringen Anteil an Zelltrümmern beobachtet werden. Einige Kulturen enthielten in den ersten Tagen nach Aufarbeitung einen geringen Anteil spindelförmiger Zellen, vermutlich Fibroblasten.

Nach circa sieben Tagen war der Boden der Zellkulturflaschen stets mit einem dichten Zellrasen konfluierender Parathyreozyten bedeckt.

Abbildung 9:Viabilität unverkapselter Parathyreozytenkulturen nach Aufarbeitung

Abbildung 10:Einzelzellkultur humaner Parathyreozyten (Phasenkontrastmikroskop, 200-fache Vergrößerung)

Eigenschaften der hergestellten Mikrokapseln Bestimmung der mechanischen Eigenschaften

Bei definierten Geräteeinstellungen konnte ein mittlerer Anfangsdurchmesser (D(A)) der Kapseln von 0,33 ± 0,02 mm ermittelt werden. Der Berstdurchmesser am ersten lokalen Maximum betrug 0,04 ± 0,00 mm. Der Berstdruck (P(B)) wurde mit 3801,66 ± 708,50 kPa bestimmt. Die zum Zerplatzen pro Kapsel aufgewendete Kraft F konnte mit 2,84 ± 0,25 N berechnet werden (Tab.4).

Abbildung 11:Mikrokapseln enkapsulierter Parathyreozyten in Zellkulturmedium

Versuch

D(A)[mm]

D(B)[mm]

P(B)[kPa]

F[N]

1

0,40

0,06

1696,28

2,65

2

0,50

0,06

846,40

2,67

3

0,40

0,07

867,69

1,13

4

0,50

0,05

790,62

3,06

5

0,40

0,04

721,63

1,79

6

0,50

0,02

478,14

4,84

7

0,30

0,03

1517,98

2,11

8

0,40

0,06

1696,28

2,65

9

0,50

0,06

846,40

2,67

10

0,40

0,07

867,69

1,13

11

0,50

0,05

790,62

3,06

12

0,40

0,04

721,63

1,79

13

0,50

0,02

478,14

4,84

14

0,30

0,03

1517,98

2,11

15

0,43

0,05

988,39

2,53

16

0,20

0,04

5718,10

1,57

17

0,20

0,03

15210,00

5,95

18

0,30

0,05

4753,17

3,69

19

0,20

0,03

5993,29

2,34

20

0,20

0,05

6567,29

1,34

21

0,20

0,03

6680,99

2,61

22

0,20

0,03

5577,18

2,18

23

0,30

0,04

4839,45

4,88

24

0,30

0,06

2060,02

1,27

25

0,20

0,06

8196,79

1,27

26

0,20

0,04

13798,39

3,79

27

0,40

0,04

1783,67

4,41

28

0,20

0,02

6517,65

4,03

29

0,30

0,07

3072,42

1,55

30

0,20

0,02

8455,64

5,23

Mittelwert

0,33

0,04

3801,66

2,84

SEM

0,02

0,00

708,50

0,25

Tabelle 4: Mechanische Eigenschaften der untersuchten Mikrokapseln

Legende:

D(A) [mm] :

Anfangsdurchmesser

D(B) [mm] :

Berstdurchmesser am ersten lokalen Maximum

P(B) [kPa] :

Berstdruck am ersten lokalen Maximum

F [N] :

aufgewendete Kraft, die zum Bersten der Kapsel führt

Porengrößenbestimmung

Mittels chromatographischer Messung der Verteilung eines Dextrangemisches zwischen Kapselinnenraum und der Umgebung wurde die Porengröße von vier Chargen der hergestellten Mikrokapseln bestimmt.

Die untere Trenngrenze betrug im Mittelwert 1,25 ± 0,04 nm, die mittlere Trenngrenze, als Maß für die Porengröße, betrug 1,39 ± 0,04 nm und die obere Trenngrenze wurde mit 1,55 ± 0,04 nm bestimmt (Tab.5).

Trenngrenze
[nm]

untere

mittlere

obere

Charge

1

1,12

1,27

1,45

2

1,32

1,47

1,62

3

1,28

1,41

1,57

4

1,28

1,41

1,57

Mittelwert

1,25

1,39

1,55

SEM

0,04

0,04

0,04

Tabelle 5: Porengrößenbestimmung

Abbildung 12:Mikrokapseln mit deutlich fokussierten Zellen in der Kapselperipherie
(Phasenkontrastmikroskop, 100-fache Vergrößerung)

Abbildung 13:Elektronenmikroskopische Aufnahme einer Mikrokapsel

(Quelle: Dr. Brigitte Thiersch, Universität Potsdam)

Abbildung 14:Elektronenmikroskopische Aufnahme der Kapselmembran

(Quelle: Dr. Brigitte Thiersch, Universität Potsdam)

In vitro-Sensitivität unverkapselter Parathyreozytenkulturen

Um die in vitro-Sensitivität der Parathyreozyten zu überprüfen, wurden n=10 Kulturen am Tag 6 des Versuchszyklus in unterschiedlichen Kalziumkonzentrationen inkubiert.

Die Zellkulturen wurden so in einer aufsteigenden Kalziumreihe mit Konzentrationen von 0,5 mmol/l, 1,5 mmol/l, 2,0 mmol/l, 2,5 mmol/l sowie 3,5 mmol/l inkubiert und die jeweilige Parathormonsekretion am Tag 8 des Versuchszyklus bestimmt (Abb.15).

Die Kalziumsensitivität der Parathyreozyten wurde als Differenz zwischen den an Tag 8 bestimmten Hormonwerten und den Ausgangswerten von Tag 6 definiert (Tab.6).

Abbildung 15: Kalziumsensitivität unverkapselter Parathyreozyten [n=10]

In den Kulturen, in denen dem Medium Kalzium entzogen wurde, konnte mit Werten von 31,3 10,2 % bei 0,5 mmol/l Ca²⁺bzw. 30,80 9,80 % bei 1,5 mmol/l Ca²⁺ein Ansteigen der PTH-Sekretion festgestellt werden.

Unter Zugabe von Kalzium wurde hingegen ein deutliches Abfallen der PTH-Sekretion mit –38,20,97 7,9 % bei 2,5 mmol/l Kalzium bzw. 66,60 10,30 % bei 3,5 mmol/l festgestellt (Tab.6).

mmol/l

0,5

1,5

2,0

2,5

3,5

Versuch

V 1

6,00

-3,00

0,00

20,00

8,00

V 2

6,00

-10,00

0,00

-41,00

-47,00

V 3

79,00

63,00

0,00

11,00

2,00

V 4

10,00

22,00

0,00

-1,00

-6,00

V 5

81,00

87,00

0,00

-13,00

-22,00

V 6

4,00

42,00

0,00

-28,00

-69,00

V 7

71,00

54,00

0,00

-65,00

-96,00

V 8

27,00

30,00

0,00

-29,00

-29,00

V 9

16,00

3,00

0,00

-26,00

-47,00

V 10

13,00

20,00

0,00

-19,00

-27,00

Mittelwert

31,30

30,80

0,00

-38,20

-66,60

SEM

10,20

9,80

0,00

7,90

10,30

Tabelle 6: Veränderung der PTH-Sekretion unverkapselter Parathyreozyten [%] (Differenz der Werte vor und nach Inkubation in unterschiedlichen Kalziumkonzentrationen) [n=10]

PTH-Sekretion unverkapselter Parathyreozyten

Als Parameter für den Funktionszustand der Zellen wurde die PTH-Sekretion gemessen.

Die Parathormonkonzentration wurde im Kulturmedium in n=10 Versuchen jeweils an den Tagen 2, 4, 6, 8, 10 und 12 bestimmt. Die Zellzahl in den Kulturen war unterschiedlich und reichte von 1 x 10⁶ Zellen bis annähernd 100 x 10⁶Zellen.

Die Bestimmung der PTH-Sekretion ergab folgende Werte (jeweils in pg/ml): Tag 2: 371829 240460; Tag 4: 101074 58232; Tag 6: 169680 127819; Tag 8: 156663 122438; Tag 10: 140603 110543; Tag 12: 37745 19612 (Tab.7).

Die einzelnen Zellkulturen waren aufgrund des Gewebes (Adenom oder Hyperplasie) und der Zellzahl sehr heterogen. Um dennoch eine bessere Vergleichbarkeit der Versuche zu erreichen, wurden die Absolutwerte in prozentuale Veränderungen umgerechnet und grafisch dargestellt. Hierbei wurde der PTH-Wert an Tag 2 gleich Hundert gesetzt und die Werte der nachfolgenden Tage als prozentuale Veränderungen zu diesem angegeben (Abb.16).

Abbildung 16:PTH-Verlauf unverkapselter Parathyreozyten [%]

Tag

2

4

6

8

10

12

Versuch

1

2515000

59500

15550

4988

4233

2366

2

96726

95382

59913

19864

11221

12092

3

147735

10330

1836

619

597

254

4

96474

41811

87738

81060

81444

90334

5

352225

98952

178552

160022

143698

36592

6

46956

9891

10771

22512

18933

15734

7

34062

16279

11298

10002

6592

9370

8

275415

52038

13028

6474

5095

3135

9

23604

10210

8759

11592

7470

10714

10

130095

616350

1309350

1249500

1126744

196857

Mittelwert

371829

101074

169680

156663

140603

37745

SEM

240460

58232

127819

122438

110543

19612

Tabelle 7: PTH-Verlauf unverkapselter Parathyreozyten [n=10] – Absolutwerte [pg/ml]

In vitro-Sensitivität enkapsulierter Parathyreozyten

Um die in vitro-Sensitivität verkapselter, humaner Parathyreozyten zu überprüfen, wurden n =30 verkapselte Zellkulturen am Tag 6 des Versuchszyklus in Kalziumkonzentrationen von 0,5 mmol/l, 1,5 mmol/l, 2,0 mmol/l, 2,5 mmol/l sowie 3,5 mmol/l Kalzium inkubiert und nach 48 h die jeweilige Parathormonsekretion bestimmt. Die Kalziumsensitivität der Parathyreozyten wurde als Differenz zwischen den an Tag 8 bestimmten Hormonwerten und den Ausgangswerten von Tag 6 definiert. Um auch hier eine bessere Vergleichbarkeit der Zellkulturen zu gewährleisten, wurde der Leerwert (2,0 mmol/l Kalzium) gleich Null gesetzt (Abb.17).

Unter Kalziumentzug konnte ein deutlicher Anstieg der PTH-Sekretion beobachtet werden. So wird bei 0,5 mmol/l Kalzium eine Zunahme der PTH-Sekretion von 14 11,00 %, bzw. bei 1,5 mmol/l Kalzium von 10 9,00 % bestimmt (Tab.8).

Wurde dem Medium Kalzium hinzugegeben, konnte die PTH-Sekretion supprimiert werden. Bei 2,5 mmol/l Kalzium wurde ein Abfall von –26 12,00 % bzw. bei 3,5 mmol/l Kalzium von –29 10,00 % bestimmt.

Abbildung 17:In vitro-Sensitivität enkapsulierter Parathyreozyten

mmol/l

0,5

1,5

2,0

2,5

3,5

Versuch

V1

93,0

9,0

0,0

-17,0

-24,0

V2

-28,0

-61,0

0,0

-99,0

-64,0

V3

18,0

21,0

0,0

24,0

-39,0

V4

39,0

-2,0

0,0

7,0

4,0

V5

36,0

22,0

0,0

-36,0

-26,0

V6

17,0

35,0

0,0

-12,0

-8,0

V7

11,0

-6,0

0,0

7,0

-17,0

V8

33,0

-19,0

0,0

10,0

-10,0

V9

9,0

-10,0

0,0

41,0

59,0

V10

-32,0

24,0

0,0

-32,0

-20,0

Mittelwert

14,0

10,0

0,0

-26,0

-29,0

SEM

11,0

9,0

0,0

12,0

10,0

Tabelle 8: Veränderung der PTH-Sekretion enkapsulierter Parathyreozyten [%] (Differenz zwischen den Werten vor und nach Inkubation in unterschiedlichen Kalziumkonzentrationen) [n=10]

Abbildung 18:Enkapsulierte Parathyreozyten (Phasenkontrastmikroskop, 40-fache Vergrößerung)

PTH-Sekretion enkapsulierter Parathyreozyten PTH-Sekretion enkapsulierter Parathyreozyten - Kurzzeitversuche

Als Parameter für den Funktionszustand der enkapsulierten Parathyreozyten wurde deren PTH-Sekretion in n=30 Versuchen an den Tagen 4 (= erster Tag nach Enkapsulierung), 6, 8, 10 und 12 bestimmt. Die PTH-Probe wurde jeweils aus dem Kulturmedium abgenommen.

über den gesamten Beobachtungszeitraum hinweg konnte ein nahezu linearer Anstieg der PTH-Sekretion der einzelnen Zellkulturen verzeichnet werden. Dies konnte, trotz der sehr heterogenen Zellreihen, in allen Versuchen übereinstimmend beobachtet werden.

Es ergaben sich folgende Werte (Tab.9) (jeweils in pg/ml): Tag 4: 1238 205; Tag 6: 2157 295; Tag 8: 3215 510; Tag 10: 3987 582; Tag 12: 5193 835.

Um die Vergleichbarkeit sowie die Anschaulichkeit der sehr heterogenen Zellkulturen zu verbessern, wurden die Absolutwerte in Relativwerte umgerechnet (Abb.19).

Abbildung 19:PTH-Verlauf enkapsulierter Parathyreozyten - Relativwerte [%]

Tag

4

6

8

10

12

Versuch

1

1353

929

1264

1566

1750

2

1048

668

959

1127

1216

3

1002

3156

3721

5332

2673

4

673

2251

2621

2925

1181

5

42

170

204

164

211

6

62

183

178

129

144

7

488

1170

1939

2394

3744

8

546

1047

2972

2402

4232

9

1393

3639

11857

8434

10996

10

1028

4093

9788

8222

11750

11

482

1226

2974

2980

3081

12

461

1483

3959

1784

4326

13

286

446

647

1041

1761

14

1400

2359

3425

4187

5420

15

1030

1950

3015

3778

4914

16

1247

2154

3215

3998

5178

17

4211

4897

3715

3713

5775

18

1355

4235

4208

8822

10756

19

305

945

1186

2144

3327

20

4801

7262

8150

9826

16286

21

2800

2727

2039

2695

3267

22

1188

1187

1759

2280

2624

23

824

1390

1239

2113

2867

24

1939

2640

5636

9387

16290

25

2881

3041

6636

11903

13026

26

1611

3842

3578

7008

8866

27

418

255

258

415

717

28

990

2043

2420

4132

3543

29

276

764

672

1184

1364

30

1007

2546

2229

3524

4500

Mittelwert

1238

2157

3215

3987

5193

SEM

205

295

510

582

835

Tabelle 9: PTH-Verlauf enkapsulierter Parathyreozyten [pg/ml] [n=30]

PTH-Sekretion enkapsulierter Parathyreozyten - Langzeitversuche

Da während des 12-tägigen Versuchszyklus unerwarteterweise ein kontinuierlicher Anstieg der PTH-Sekretion sämtlicher enkapsulierter Zellkulturen zu verzeichnen war, wurde beschlossen, die letzten zehn Versuche über einen längeren Zeitraum zu beobachten.

In diesen Versuchen wurden an den Tagen 40 und 85 zusätzliche PTH-Proben entnommen, um das Langzeitsekretionsverhalten zu überprüfen.

In allen zehn Versuchen wurde übereinstimmend eine weitere, nahezu lineare Zunahme der PTH-Sekretion festgestellt (Tab.10) (Werte jeweils in pg/ml): Tag 4: 1238 287; Tag 6: 2157 354; Tag 8: 3215 656; Tag 10: 3987 1191; Tag 12: 5193 1663; Tag 40: 30484 8686; Tag 85: 54892 287.

Zur Verbesserung der Anschaulichkeit erfolgte die Darstellung in Prozentualwerten (Abb.20).

Abbildung 20:PTH-Verlauf enkapsulierter Parathyreozyten - Relativwerte [%] (Langzeitversuche) [n=10]

Tag

4

6

8

10

12

40

85

Versuch

21

2800

2727

2039

2695

3267

8454

22345

22

1188

1187

1759

2280

2624

9998

36777

23

824

1390

1239

2113

2867

15987

45101

24

1939

2640

5636

9387

16290

62222

76888

25

2881

3041

6636

11903

13026

15623

22665

26

1611

3842

3578

7008

8866

76945

92346

27

418

255

258

415

717

6953

23415

28

990

2043

2420

4132

3543

56889

77973

29

276

764

672

1184

1364

3570

18587

30

1007

2546

2229

3524

4500

48195

132825

Mittelwert

1238

2157

3215

3987

5193

30484

54892

SEM

287

354

656

1191

1663

8686

287

Tabelle 10: PTH-Verlauf enkapsulierter Parathyreozyten - Absolutwerte [pg/ml]
(Langzeitversuche)