Der permanente, postoperative Hypoparathyreoidismus - Schätzungen zufolge sind alleine in Deutschland jährlich circa 1500 Menschen davon betroffen - stellt eine wesentliche Komplikation von Schilddrüsenoperationen dar.

Bei gegebener vitaler Gefährdung des Patienten durch tetanische Krampfanfälle ist eine lebenslange Kalzium- und Vitamin D-Substitution notwendig. Diese vermag jedoch in vielen Fällen nicht die vielfältigen Stoffwechselwirkungen des PTH zu ersetzen.

Zahlreiche Autoren^{16 , 17 ,}berichteten über die erfolgreiche Allotransplantation von humanem Nebenschilddrüsengewebe unter Immunsuppression.

Da eine lebenslange Immunsuppression bei der Transplantation von parathyreoidalem Gewebe unverhältnismäßig erscheint, wurde nach gangbaren Alternativen ohne Immunsuppression gesucht: Yao et al. berichteten über die erfolgreiche Allotransplantation in den zerebralen Seitenventrikel von Ratten ohne Immunsuppression und zeigten so den offensichtlich privilegierten Immunstatus dieser Lokalisation²⁰.

Verschiedene Konzepte zielten darauf ab, die Immunantwort des Transplantatempfängers durch Reduktion sogenannter passenger cells – spezialisierter Zellpopulationen, wie Lymphozyten, Makrophagen sowie dentritische Zellen, die sowohl MHC I- als auch MHC II- Antigene exprimieren - zu modulieren. Mehreren Arbeitsgruppen gelang dies durch die in vitro-Kultivierung des Spendergewebes. Es konnte so ein zeitweiliges Überleben der Allotransplantate ohne Immunsuppression erreicht werden^{21 , 23 , 24 , 25}. Feind et al. konnten auf diese Weise im Tierversuch eine Überlebenszeit des allogenen Spenderorgans von mehreren Monaten ohne Immunsuppression und ohne Substitution von Kalzium oder Vitamin D erreichen²⁶.

Eine andere Forschergruppe transplantierte humanes Parathyreozytengewebe unter die Nierenkapsel von Nacktmäusen, die dabei als Zwischenwirt dienen. Im nichtimmunsupprimierten, HLA-A sowie B inkompatiblen Empfängertier konnte so eine längere Überlebenszeit des Transplantates erreicht werden²².

Die Mikroverkapselung von humanem Nebenschilddrüsengewebe zeigt einen vielversprechenden therapeutischen Ansatz in der Behandlung des parathyreopriven, postoperativen Hypoparathyreoidismus auf.

Erfolgreiche in vivo und in vitro Experimente mit verkapselten Parathyreozyten wurden bereits in den neunziger Jahren von Hasse et al. beschrieben: 1994 gelang dieser Arbeitsgruppe im Langzeitversuch die Allotransplantation von enkapsuliertem Nebenschilddrüsengewebe im Tiermodell ohne Immunsuppression. Gewebepartikel der Nebenschilddrüsen wurden, nach Isolation und Gewebekultur, mit Bariumalginat verkapselt und hypokalzämischen Ratten verpflanzt. Diese zeigten auch nach einem Beobachtungszeitraum von 90 Tagen noch normale Serumkalziumkonzentrationen^{38 , 39 , 40}.

Wenig später gelang ebenfalls Hasse et al. die erste experimentelle parathyreoidale Xenotransplantation ohne Immunsuppression³⁶.

Eine italienische Forschungsgruppe beschrieb Versuche mit alginatverkapselten Parathreozyten aus primären Monolayerkulturen. In einer in vitro Studie zeigten die mikroverkapselten gegenüber den unverkapselten Zellen der Vergleichsgruppe eine bessere PTH-Sensitivität sowie eine höhere Hormonsekretion⁶⁸.

Erste klinische Erfolge mit alginatverkapselten Nebenschilddrüsenpartikeln gelang 1997 ebenfalls der Marburger Arbeitsgruppe um Hasse et al. Zwei weiblichen Patientinnen, die nach subtotaler, bilateraler Schilddrüsenresektion an einer postoperativen Hypokalzämie litten, wurden mikroverkapselte Parathyreozyten in die Unterarmmuskulatur eingepflanzt. Bei beiden konnte eine vorübergehende Besserung der klinischen Symptomatik bei halbierter Substitutionsmedikation erreicht werden⁴¹.

Grundlage einer funktionsfähigen Mikrokapsel ist ein optimales Verhältnis zwischen ausreichender nutritiver Permeabilität, die eine möglichst dünne Membran erfordert, und eine ausreichende mechanische Stabilität, die eine eher dickere Membran verlangt. Alginat ist das bisher am häufigsten eingesetzte Material für die Bildung von Mikrokapseln. Es kann sowohl alleine als auch in Kombination mit positiv geladenem Polylysin eingesetzt werden. Gebräuchlich sind auch durch divalente Kationen (v.a. Kalzium und Barium) quervernetzte und somit stabilere Alginate. In diesem Verfahren werden die Zellen mit einer 1-3 % Alginatlösung vermischt und die Tropfen während ca. 5 min. in einem 1 %igen Bad aus beispielsweise CaCl₂ quervernetzt. Optional können die Tropfen anschließend in einem 0,05 - 0,1 % Bad aus Poly-l-Lysin präzipitiert werden, um eine zusätzliche äußere Membran zu schaffen⁶⁹.

Agarose ist ein weiteres, aus Seealgen hergestelltes Enkapsulierungsmedium. Es handelt sich hierbei um ein sich thermisch verfestigendes Material. Bei höheren Temperaturen liegt es flüssig vor und verfestigt sich beim Abkühlen. Entscheidender Nachteil ist die im Langzeitverhalten mangelhafte immunisolatorische Eigenschaft dieses Stoffes⁷⁰.

Bessere Eigenschaften diesbezüglich scheint eine weiterentwickelte Multilayer-Agarose-kapsel zu besitzen: Diese modifizierte Mikrokapsel besteht aus einem Gemisch aus Agarose und Polystyrensulfonsäure (PSSa) mit einer äußeren Schicht aus Carboxymethylcellulose (CMC). Der Zusatz von PSSa scheint die Fähigkeit zu besitzen, Komplementaktivität durch eine Interaktion mit Komplementproteinen unterdrücken zu können. Im in vivo-Modell konnte eine längere Funktionsfähigkeit des Transplantates im Vergleich zur konventionellen Agarosekapsel gezeigt werden⁷¹.

Sefton et al. entwickelten Mikrokapseln aus einem synthetischen, wasserunlöslichen Polymer (Polyacrylate einschließlich Polyacrylmethylmethacrylat (PMMA), Hydroxyethylmethacrylat-Methylmethacrylat (HEMA-MMA) und Eudragit). Diese scheinen gegenüber den wasserlöslichen Acrylaten Vorteile in bezug auf Biokompatibilität und Festigkeit zu besitzen. Polyacrylate wurden bisher für die Enkapsulierung von Inselzellen sowie PC-12 Zellen sowohl in vitro als auch in vivo eingesetzt^{72 , 73}.

Dautzenberg entwickelte Anfang der achziger Jahre ein Enkapsulierungssystem auf Basis der gegensätzlich geladenen Polyelektrolyte Natriumcellulosesulfat und Polydiallyldimethylammoniumchlorid, NaCS / Poly-DADMAC.

Die Verkapselung erfolgt hierbei über ein einfaches Ein-Schritt-System. Toxizitätsstudien konnten bisher keinerlei mitogene oder toxische Eigenschaften nachweisen⁵⁵.

Die Mikroverkapselung mit NaCS und Poly-DADMAC wird seit den neunziger Jahren auf verschiedenen Gebieten der Medizin und Biotechnologie erfolgreich experimentell eingesetzt^{37 , 48 , 74}.

In dieser Arbeit wird erstmalig die Eignung von NaCS und Poly-DADMAC für die Mikroverkapselung von kryokonservierten, humanen Nebenschilddrüsenzellen geprüft.

Voraussetzung für die Verkapselung lebender Zellen ist die Bio-und Immunkompatibilität des Verkapselungsmaterials. Eine fibrotische Gewebsreaktion, eine Makrophagenaktivierung sowie die Freisetzung von Zytokinen und zytotoxischen Stoffen sollte idealerweise nicht vorhanden oder nur sehr gering ausgeprägt sein. Direkte Konsequenz eines nicht-biokompatiblen Verfahrens ist die Fibrosierung mit nachfolgendem Funktionsverlust des Transplantates. Kapselgröße, äußere Beschaffenheit der Membran, enkapsuliertes Gewebe und das zur Verkapselung verwendete Material gelten als die Hauptparameter, die eine mögliche Reaktion des Empfängers beeinflussen können⁷⁵.

Die Empfängerimmunantwort beginnt üblicherweise mit der Absorption von Zelladhäsionsproteinen, Immunglobulinen, Komplementkomponenten, Wachstumsfaktoren und anderen Serumproteinen an der Oberfläche der transplantierten Mikrokapsel. Die Spezifität und Menge der absorbierten Proteine ist abhängig vom verwendeten Enkapsulierungsmaterial^{76 , 77 , 78}.

Bei der akuten Entzündungsreaktion sind vor allem eosinophile und polymorphkernige Granulozyten anwesend, während die chronische Entzündungsreaktion durch Makrophagen, Fibroblasten und Fremdkörperriesenzellen gekennzeichnet ist.

Die Implantation von Biomaterialien kann zu einer ausgeprägten Entzündungsreaktion führen, die sich hauptsächlich in einem Überwuchs des Materials mit fibroblastenähnlichen und makrophagenähnlichen Zellen manifestiert⁷⁹. Eine wichtige Rolle bei der Adhäsion von Entzündungs- und Immunzellen an die Oberfläche von Mikrokapseln spielt die Interaktion ihrer Oberflächenrezeptoren mit absorbierten Proteinen an der Kapseloberfläche⁸⁰.

Siebers et al. wiesen nach, dass der Grad der Fibrosierung transplantierter Alginatkapseln zunimmt, je differenter Spender- und Empfängergewebe sind⁸¹.

Offensichtlich wird die Adhäsion von Zellen nicht nur durch das verwendete Kapselmaterial, sondern auch durch das verkapselte Gewebe verursacht: Es konnte gezeigt werden, dass implantierte leere Mikrokapseln frei von adhärierten Zellen blieben, während Kapseln, die xenogene Zellen enthielten, eine Makrophagenaktivierung in vitro und eine fibrotische Reaktion in vivo auslösten⁸². Die Zerstörung des xenogenen Materials innerhalb der Kapsel wird möglicherweise durch von untergegangenen verkapselten Zellen freigesetzte und nach außen diffundierte Antigene ausgelöst. Diese Antigene werden u.a. von Makrophagen phagozytiert und CD4+ T-Zellen präsentiert, wodurch schließlich die Entzündungsreaktion ausgelöst wird, die in der Zerstörung der verkapselten Zellen mündet.

Iwata et al. konnten die Menge der freiwerdenden xenogenen Antigene durch in vitro Kultivierung der Agarosekapseln vermindern. Hierdurch konnte offensichtlich eine Erholung der enkapsulierten Zellen erreicht und die Freisetzung von Antigenen reduziert werden⁸³.

Die Kapselmembran dient als physikalische Barriere, um einen Kontakt zwischen transplantiertem Gewebe und Immunsystem zu verhindern. Faktoren, wie molekularer Aufbau, dreidimensionale Struktur, elektrostatische Ladung sowie intra- und extrakapsuläre Konzentrationen sind wichtige Faktoren, die die Diffusionsrate von Molekülen an der Kapselmembran beeinflussen können. Gelingt es Immunglobulinen, die Membran zu penetrieren, wird die Komplementkaskade aktiviert, was im Untergang der transplantierten Zellen mündet⁸³.

Die Effektorphase sowohl des unspezifischen als auch des spezifischen Immunsystems wird zu einem großen Teil durch Gewebshormone, so genannte Zytokine, ausgelöst.

Folgende Zytokine sind an einer Entzündungsreaktion gegen enkapsulierte Zellen beteiligt: Interferon (INF ), Interferon (INF ), Interleukin-15 (IL-15), Interleukin-12 (IL-12), Tumornekrosefaktor (TNF ), Interleukin-1 (IL-1), Interleukin-6 (Il-6) und Interleukin-10 (IL-10) .

Der Effekt von Zytokinen und Wachstumsfaktoren wird in zwei Phasen unterteilt: In der Akutphase verstärken TNF und Interleukin-1 die T-Zell-initiierte Entzündungsreaktion.

In der chronischen Phase stimulieren die selben Zytokine Fibroblasten zur Proliferation und Kollagenproduktion. Folge der von den aktivierten Makrophagen freigesetzten Zytokinen ist die Bildung von fibrotischem Gewebe um die transplantierte Mikrokapsel.

Die fibrotische Gewebsreaktion ist das Ergebnis einer Überempfindlichkeitsreaktion vom verzögerten Typ, wenn die Elimination des Fremdantigens erfolglos geblieben ist. Aufgrund ihres niedrigen Molekulargewichtes können Zytokine leicht die semipermeable Kapselmembran durchdringen und zu einer Beschädigung der enkapsulierten Zellen führen⁸⁴.

Die Verwendung eines Alginat/Polylysin-Komplexes für die Enkapsulierung von Langerhans-Inseln ist die häufigste und somit am besten erforschte bisherige Anwendung eines Zellverkapselungssystems. Entsprechend groß ist die Zahl der vorhandenen Publikationen verschiedener unabhängiger Forschungsgruppen hierzu.

Seit der erstmaligen Anwendung durch Lim und Sun³⁴ wurde das ALG/PLL–System mehrfach modifiziert¹⁰⁸, um eine Reduzierung der Empfängerimmunantwort auf die transplantierten Alginatkapseln zu erreichen.

Biokompatible Alginat/PLL-Kapseln zeichnen sich durch hohe mechanische Stabilität und eine glatte Oberfläche aus. Diese Eigenschaften werden durch die Verwendung eines höher viskosen anstelle eines niedrig viskosen Alginates erzielt.

Zunehmende Hydrophilie im Kapselinneren und ein daraus resultierendes Anschwellen der Kapseln durch freiwerdendes Kalzium nach dem Enkapsulierungsprozess konnte verhindert werden, indem durch die Verwendung von Na₂SO₄ divalentes Kalzium gegen monovalentes Natrium ausgetauscht wurde⁸⁵.

Eine Forschungsgruppe um Schneider et al. konnte durch eine Modifikation der Membraneigenschaften eine verbesserte Diffusionskapazität und Insulinantwort erreichen⁸⁶.

In in vivo Versuchen wurde ein Zusammenhang zwischen Kapseldurchmesser und Empfängerimmunantwort bei der Transplantation von verkapselten Langerhans-Inseln entdeckt: Die Reduzierung des Kapseldurchmessers von 800 µm auf 500 µm war mit einer Erhöhung des Anteils unzureichend enkapsulierter Zellen assoziiert. Hieraus wurde eine stärkere Empfängerimmunantwort und somit eine verminderte Transplantatfunktion abgeleitet⁸⁷.

Als Hauptursache für eine unzureichende Transplantatfunktion zeigten sich die Fibrosierung sowie mitogene Eigenschaften der transplantierten Alginat-Mikrokapseln:

Kommerziell eingesetzte Alginate sind aufgebaut aus variablen homopolymerischen Regionen aus -D-Mannuronsäure (sog. M-blocks) und -L-Guluronsäure (sog. G-blocks) sowie alternierenden Regionen (sog. MG-blocks).

Alginate mit einem hohen Anteil an Mannuronsäure stimulieren offensichtlich Monozyten zur Produktion von proinflammatorischen Substanzen wie TNF, Interleukin-1 und Interleukin-6 und rufen somit eine Entzündungsreaktion sowie eine humorale Immunantwort hervor.

Zimmermann et al. konnten in der Elektrophorese nachweisen, dass Alginate mindestens zehn bis zwanzig Fraktionen unterschiedlicher elektrophoretischer Mobilität enthielten, die mitogene Eigenschaften besaßen.

Diese mitogenen Anteile konnten elektrophoretisch separiert werden. Die somit aufgereinigten Alginate zeigten in in vitro und in vivo-Versuchen keine mitogenen Eigenschaften mehr^{37 , 88}. Der unerwünschte Effekt der Fibrosierung konnte um 90 % reduziert werden. Weiterhin zeigte sich, dass durch eine Erhöhung des Anteils an Glukoronsäure die mechanische Stabilität und somit ein Anschwellen der Kapseln mit der Folge einer fibrotischen Überwucherung verhindert werden konnte^{89 , 90}.

Die Überlebenszeit der Mikrokapseln blieb jedoch weiterhin auf eine Zeitspanne von sechs bis zehn Wochen beschränkt. Es wurde postuliert, dass unzureichende Nutrition aufgrund mangelnder Blutversorgung der verkapselten Zellen hierfür verantwortlich ist^{91 , 92}. Unterstützt wurde diese Annahme durch die Beobachtung, dass der größte Anteil nekrotischer Zellen im Kapselinneren zu finden war.

Bei der Transplantation von Mikrokapseln aus Natriumcellulosesulfat in die Bauchhöhle konnte während eines zehnmonatigen Beobachtungszeitraumes weder eine Entzündungsreaktion noch eine aseptische Peritonitis beobachtet werden⁷⁴.

Zusammenfassend sind drei Aspekte der Bio- und Immunokompatibilität zu berücksichtigen^{93 , 94}.

1. Die Reaktion des enkapsulierten Gewebes auf die Verkapselung

2. Fremdkörperreaktion des Empfängers gegen die Mikrokapseln

3. Immunologische Reaktion des Empfängers gegen das verkapselte Spendergewebe.

Die Verwendung von semipermeablen Mikrokapseln zur Immobilisierung von Zellen repräsentiert eine wirkungsvolle Methode, einerseits eine nutritive Versorgung des verkapselten Gewebes und die freie Passage von Zellprodukten sicherzustellen und andererseits dessen immunologische Rejektion zu verhindern.

Die therapeutischen Anwendungsmöglichkeiten der Mikroenkapsulierungstechnologie sind vielfältig:

Der erstmalige erfolgreiche Einsatz der Mikroenkapsulierungstechnologie gelang Lim et al. 1980 mit der Verkapselung von Langerhans-Inseln des Pankreas zur Therapie des insulinabhängigen Diabetes mellitus Typ I³⁴.

Zahlreiche Forschungsgruppen arbeiteten seither an der Verkapselung von Langerhans-Inseln. Trotz vielversprechender Ergebnisse bei der Transplantation von mikroverkapselten Insulin-produzierenden Zellen in in vivo Versuchen⁹⁵ blieb der klinische Einsatz bisher auf eine geringe Anzahl von Fällen beschränkt^{96 , 97 , 98}.

Probleme der Biokompatibilität standen hierbei anfangs im Vordergrund: Die Insulinsekretion wurde durch in situ-Fibrosierung der transplantierten Alginat-Kapseln stark eingeschränkt. Durch Verwendung eines hochaufgereinigten Alginates konnte dieses Problem reduziert werden. Die Funktionsdauer der Transplantate blieb jedoch weiterhin beschränkt^{99 , 100}.

Im Tiermodell konnte mit der Verkapselung von genetisch veränderten, Erythropoetin-produzierenden Myoblasten ein vielversprechender Ansatz in der Behandlung von Anämien unterschiedlichster Genese aufgezeigt werden¹⁰¹.

Eine andere Anwendung verfolgt eine Forschungsgruppe der Abteilung für HNO an der Charité in Berlin102: Die autologe Verpflanzung von Knorpelgeweben ist eine allgemein akzeptierte Methode in der Wiederherstellungschirurgie. Die Empfängerimmunantwort bei allogener Transplantation führt jedoch in vielen Fällen zur Instabilität des Transplantates oder induziert eine chronische Entzündungsreaktion. Im Mausmodell konnte durch die Makroverkapselung von Knorpelgewebe eine signifikante Reduzierung der Entzündungsreaktion im Vergleich zur Kontrollgruppe erreicht werden. Die verkapselten Gewebe zeigten keinerlei Degenerationszeichen¹⁰².

Tobias et al. erprobten die Allotransplantation von mikroverkapselten BDNF-produzierenden Fibroblasten ohne den Einsatz von Cyclosporin A im Tiermodell¹⁰³. Die BDNF-produzierenden Kapseln wurden in das geschädigte Rückenmark von adulten Ratten transplantiert. Die Vitalität der Zellen konnte noch nach einem Beobachtungszeitraum von vier Wochen nachgewiesen werden. Im Vergleich zur zellfreie Kapseln enthaltenden Kontrollgruppe zeigte sich in der Umgebung von Kapseln, die BDNF-produzierende Zellen enthalten, ein erhöhtes Wachstum von Axonen und Dendriten¹⁰³.

Die Blut-Hirn-Schranke stellt eine Schutzfunktion zwischen Gefäßsystem und Hirnparenchym dar. Sie bereitet jedoch häufig Probleme in der Versorgung des Gehirns mit pharmakologisch wirksamen Substanzen oder Metaboliten¹⁰⁴.

Eine Möglichkeit zur Überwindung der Blut-Hirn-Schranke stellt die Mikroverkapselung und intrazerebrale Transplantation von Zellen dar, die stoffwechselaktive Metabolite produzieren¹⁰⁵.

Date et al. gelang es, enkapsulierte dopaminproduzierende Zellen in das Striatum von hemiparkinsonoiden Primatenaffen zu verpflanzen. Die Dopaminproduktion konnte noch nach 12 Monaten nachgewiesen werden. Es gab keinerlei Anzeichen einer Immunantwort und die histologische Reaktion des Umgebungsgewebes war gering. Klinisch konnte eine Verminderung des Tremors an den Händen der Versuchsaffen beobachtet werden¹⁰⁶.

Zu ähnlich positiven Ergebnissen kamen Xue et al. Die Verpflanzung von mikroverkapselten, dopaminproduzierenden, chromaffinen Zellen in das Striatum von hemiparkinsonoiden Versuchsratten führte ebenfalls zu einer Verbesserung der klinischen Symptomatik¹⁰⁷.

(modifiziert nach: Li, Materials for immunoisolated cell transplantation)¹⁰⁸

Polymer

Zell- / Gewebetyp

Modell /
Empfänger

HEMA-MMA¹ und

Versch. Polyacrylate

PC-12

humane Fibroblasten

Inselzellen (Ratten)

HepG 2

in vitro

in vitro

in vitro

in vitro

ALG/PLL – PEI²

Inselzellen

Ratte

ALG/PLL – ALG³

mGH-C2C12 Myoblasten

Inselzellen

Humane Inselzellen

Hepatozyten (Ratte)

Hepatozyten (Ratte)

Adrenerge chromaffine Zellen (Kalb)

PC12

Inselzellen (Ratte)

Maus

Ratte

humanes Peritoneum

Gunn –Rattenmodell

Peritoneum (Ratte)

Nagetier

Primatenaffen

Ratte

NaCS / Poly-DADMAC⁴

humane Parathyreozyten

Knorpelzellen

antikörperproduzierende Zellen

humane Hepatozyten

in vitro

Maus

in vivo

in vitro

ALG-Komplex

Guinea-Schwein

in vitro

HEMA – co – MMA

Erythrozyten

Ba – ALG

Inselzellen (Ratte)

Porcine Inselzellen

Maus

Maus

Agarose

B6 Inselzellen (Maus)

Inselzellen (Hamster)

Maus

Maus

Agarose/PSS/PB/CMC⁵

PC-12

Inselzellen (Ratte)

Guinea-Schwein

Maus

Photo – quervernetzte PVA

Inselzellen (Maus)

Peritoneum (Maus)