Aus dem Institut für Transfusionsmedizin
der Medizinischen Fakultät der Charité – Universitätsmedizin Berlin

DISSERTATION

Polyelektrolytbeschichtung von Mikrokapseln (PEMC)- Adsorption und Aktivität von Trypsin

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät der Charité – Universitätsmedizin Berlin

von


Eike Garbers
aus Ulm

Gutachter:
1. PD Dr. rer. nat. H. Bäumler
2. Prof. Dr. med. G. Brezesinski
3. Prof. Dr. B. Neu

Datum der Promotion: 23.06.2006

Inhaltsverzeichnis

• 1 Zusammenfassung
• 2 Einleitung
  • 2.1  Polyelektrolytmikrokapseln
    • 2.1.1  Herstellung von PEMC mittels Layer-by-Layer-Technologie
    • 2.1.2 Template für PEMC
    • 2.1.3 Membraneigenschaften und Polyelektrolytbeschichtung von PEMC
  • 2.2 Anwendungsmöglichkeiten
  • 2.3 Trypsin
  • 2.4 Aufgabenstellung
• 3 Material und Methoden
  • 3.1  Biologische und chemische Materialien
    • 3.1.1  Erythrozyten
    • 3.1.2 Chemikalien
    • 3.1.3 Lösungen
  • 3.2 Herstellung der Polyelektrolytmikrokapseln
    • 3.2.1  Fixierung, Polyelektrolytbeschichtung und Auflösung des Kerns
    • 3.2.2 Polyelektrolytbeschichtung fixierter Erythrozyten
    • 3.2.3 Weiterbeschichtung der Polyelektrolytmikrokapseln
      • 3.2.3.1 Weiterbeschichtung mit Trypsin und einem Polyelektrolyt
      • 3.2.3.2 Weiterbeschichtung mit FITC-markiertem Trypsin und einem Polyelektrolyten
  • 3.3 Methoden zur Charakterisierung der Polyelektrolytmikrokapseln
    • 3.3.1  Konfokale Laser Scanning Mikroskopie (CLSM)
      • 3.3.1.1 Bestimmung von Zellzahlen
      • 3.3.1.2 Untersuchung von Fluoreszenzsignalen an weiterbeschichteten PEMC
    • 3.3.2 Zellelektrophorese
    • 3.3.3 Durchflusszytometrie (FACS)
    • 3.3.4 Photometrische Messungen
      • 3.3.4.1 Bestimmung der Trypsinkonzentration in wässrigen Lösungen
      • 3.3.4.2 Bestimmung der Konzentration von p-Nitroanilin
      • 3.3.4.3 Bestimmung der Proteinkonzentration nach Lowry
      • 3.3.4.4 Bestimmung der Enzymaktivität
      • 3.3.4.5 Untersuchung des Einflusses unterschiedlicher Polyanionen auf die Enzymaktivität
• 4 Ergebnisse
  • 4.1  Untersuchung der Trypsinkonzentration in Überständen der Waschzyklen
  • 4.2 Einfluss unterschiedlicher Polyanionen auf die Enzymaktivität
    • 4.2.1  PSS
    • 4.2.2 Alginat
    • 4.2.3 Dextransulphat
  • 4.3 Untersuchungen mittels CLSM
  • 4.4 Verfolgen des Schichtaufbaus mittels Zellelektrophorese
    • 4.4.1  Zellelektrophoretische Mobilität der PEMC bei Beschichtung mit PSS und Trypsin
    • 4.4.2 Zellelektrophoretische Mobilität bei Beschichtung mit Alginat und Trypsin
  • 4.5 Messung der Fluoreszenzintensität mit dem Flowzytometer
    • 4.5.1  Fluoreszenzintensität bei Beschichtung mit PSS und FITC-Trypsin
    • 4.5.2 Fluoreszenzintensität bei Beschichtung mit Alginat und FITC-Trypsin
  • 4.6 Ergebnisse photometrischer Messungen
    • 4.6.1  Menge gebundenen Trypsins pro PEMC
    • 4.6.2 Aktivität pro Kapsel
    • 4.6.3 Aktivität des immobilisierten Enzyms bezogen auf die gemessene Enzymkonzentration
    • 4.6.4 Vergleich der Aktivitäten von an PEMC immobilisiertem und freiem Enzym
    • 4.6.5 Einfluss des pH-Wertes auf die Aktivität des freien und immobilisierten Enzyms
• 5 Diskussion
  • 5.1  Layer-by-Layer Adsorption von Trypsin
  • 5.2 Einfluss unterschiedlicher Polyanionen auf die Enzymaktivität
  • 5.3 Untersuchung der Oberflächenladungen bei der Layer-by-Layer Beschichtung
  • 5.4 Untersuchungen mittels CLSM
  • 5.5 Durchflusszytometrische (FACS) Untersuchungen zur Layer-by-Layer Beschichtung der Polyelektrolytmikrokapseln
  • 5.6 Photometrische Messungen
    • 5.6.1  Menge gebundenen Trypsins pro PEMC
    • 5.6.2 Aktivität des immobilisierten Trypsins pro einzelner PEMC
  • 5.7 Korrelation zwischen flowzytometrischen und photometrischen Messungen
  • 5.8 Diskussion der vergleichenden Versuche zum Einfluss des pH-Wertes auf die Enzymaktivität von freiem und immobilisiertem Trypsin
• Verzeichnis der Abkürzungen und Formelzeichen
• Literaturverzeichnis
• Danksagung
• Erklärung
• Lebenslauf

Tabellen

• Tab. 1: Verwendete Chemikalien
• Tab. 2: Versuchsaufbau zur Untersuchung des Einflusses des Polyanions auf die Enzymaktivität. Angaben in µl. Eingeschlossen wird ein Ansatz ‚0’ ohne Zugabe eines Polyelektrolyten.

Bilder

• Abb. 1: SFM-Aufnahme von Luftgetrockneten Polyelektrolytmikrokapseln bestehend aus fünf Schichten ((PSS/PAH)₂PSS) (a) bzw. (DxSO₄/PAH)₂DxSO₄. Unten sind die Höhenprofile der entsprechenden Kapseln dargestellt [35].
• Abb. 2: Schema des Vorgehens zur Layer-by-Layer-Technologie zum Aufbau von Polyelektrolytschichten auf geladene Oberflächen.
• Abb. 3: Strukturformeln von Poly(natriumstyrensulfonat) (PSS), Poly(allylaminhydrochlorid) (PAH) und Alginat
• Abb. 4: Links: transmissionselektronenmikroskopische Aufnahmen a) fixierter Erythrozyten, b) fixierter Erythrozyten mit 10 Polyelektrolytschichten und c) einer Polyelektrolythülle (10 Schichten) nach dem Zersetzen des Erythrozyten. Die Balken entsprechen jeweils 1 µm. Rechts: rasterelektronemikoskopische Aufnahme fixierter Echinozyten mit 10 Polyelektrolytschichten (PAH/PSS) [62].
• Abb. 5: photometrisch aufgezeichnete Wellenlängenspektren von Trypsin und FITC-Trypsin. Trypsin zeigt ein Absorptionsmaximum bei etwa 280nm. Nach Anlagerung von FITC zeigt sich ein zusätzliches Absorptionsmaximum bei 510 nm. Dieses entspricht dem FITC-Absorptionsmaximum [82]. Konzentrationen ca. 0,5 mg/ml.
• Abb. 6: Schematische Darstellung der konsekutiven Polyelektrolytanlagerung an die Erythrozytenmembran. Aufgrund der negativen Ladung der Erytroztenmembran bei pH7,4 wird der Schichtaufbau mit dem negativen Polyelektrolyten PSS begonnen. Darauf folgt die Beschichtung mit PAH. Dieser Vorgang wird alternierend wiederholt, bis die gewünschte Schichtzahl erreicht ist. Abschließend wird der Erythrozyt im Inneren der Kapsel durch NaOH aufgelöst [Bäumler et al. 2003].
• Abb. 7: Strahlengang in einem CLSM. Das konfokale Prinzip beruht darauf, dass bei Untersuchung dreidimensionaler Objekte nur jeweils eine optische Ebene abgebildet wird. Es werden Überschneidungen verhindert und es gelingt, Schnittebenen einzelner Zellen zu untersuchen. [93]
• Abb. 8: Darstellungsoptionen der Software FACS-Diva. Oben links: Darstellung der gemessenen SSC/FSC-Streulichtwerte der Partikel mit angelegtem Gate P1, in dem die zu untersuchenden Partikel lokalisiert sind. Oben rechts: Darstellung der Fluoreszenzintensität und des SSC derselben Partikel. Rot dargestellt sind die Partikel innerhalb des Gates P1. Mitte: Histogramm der Fluoreszenzintensitäten der Partikel innerhalb des Gates P1 mit Messinterwallen 1 und 2, die einzelne PEMC und Doublets darstellen. Unten: statistische Auswertung der Daten aus P1, Messinterwall 1 und 2 sowie der Gesamtpartikel.
• Abb. 9: Schematische Darstellung des blauviolettfarbenen Komplexes, auf dessen Entstehen die Proteinbestimmung nach Lowry beruht. Sein Zentralatom ist ein Cu²⁺ –Ion, seine Liganden vier Elektronenpaare von Stickstoffatomen vierer Peptidbindungen.
• Abb. 10: photometrisch gemessene Trypsinkonzentration in den Überständen. Dargestellt sind die Mittelwerte und Standardabweichungen der Trypsinkonzentrationen in mg/ml. n=10 (Messwerte: 1= 1,19±0,32; 2= 0,10±0,03; 3= 0,00±0,01; 4= 0,00±0,01)
• Abb. 11: Einfluss der PSS-Konzentration auf die Trypsinaktivität. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardabweichungen. n=4. Konzentrationsangaben in mg/ml. Abszisse: prozentuale Aktivität im Vergleich zum Kontrollwert ohne PSS-Zugabe. Die Aktivitätsbestimmung wurde im Spektrophotometer bei einer Wellenlänge von 420nm über 180Sekunden durchgeführt. pH 7,4
• Abb. 12: Einfluss der Alginat-Konzentration auf die Trypsinaktivität. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardabweichungen. n=4. Konzentrationsangaben in mg/ml. Abszisse: prozentuale Aktivität im Vergleich zum Kontrollwert ohne Alginat-Zugabe. Die Aktivitätsbestimmung wurde im Spektrophotometer bei einer Wellenlänge von 420nm über 180Sekunden durchgeführt.
• Abb. 13: Einfluss der Dextransulphat-Konzentration auf die Trypsinaktivität. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardabweichungen. n=4. Konzentrationsangaben in mg/ml. Abszisse: prozentuale Aktivität im vergleich zum Kontrollwert ohne Dextransulphat-Zugabe. Die Aktivitätsbestimmung wurde im Spektrophotometer bei einer Wellenlänge von 420nm über 180 Sekunden durchgeführt. pH 7,4
• Abb. 14: Lokalisation des Fluoreszenzsignals. Dargestellt ist das Fluoreszenzsignal von PEMC, die mit 5 Schichten FITC-Trypsin im Wechsel mit PSS nach dem zuvor beschriebenen Verfahren (s. 2.2.2.2) beschichtet wurden. Nach Anregung mit einem Argon-Laser (488nm) in Tris-Puffer pH 7,4. Aufgenommen mit einem 100x Ölimmersions-Objektiv.
• Abb. 15: Intensität des Fluoreszenzsignals. Dargestellt ist das Fluoreszenzsignal von PEMC, die mit a= 4 Schichten, b= 6 Schichten, c= 7 Schichten, d= 9 Schichten und e= 10 Schichten FITC-Trypsin im Wechsel mit PSS beschichtet wurden. Nach Anregung mit einem Argon-Laser (488nm) in Tris-Puffer pH 7,4. Aufgenommen mit einem 63x LD Objektiv unter Konstanthaltung der Belichtungseinstellungen nach zuvor beschriebenem Verfahren.
• Abb: 16: Darstellung der Fluoreszenzintensität entlang einer roten Linie in CLSM-Aufnahmen
• Abb. 17: Darstellung der häufigsten Fluoreszenzintensitäten aus CLSM-Aufnahmen von PEMC, die alternierend mit FITC-Trypsin und PSS beschichtet wurden. Dargestellt sind relative Fluoreszenzintensitäten. Ihnen wurde eine lineare Trendlinie angepasst, die rot in der Abbildung dargestellt ist. Ihre Geradengleichung ist in der Abbildung angegeben. Das Bestimmtheitsmaß dieser Trendlinie beträgt 0,98. Intensitätsangaben sind relative Werte ohne Einheit, die Schichtzahl bezeichnet die Anzahl aufgebrachter FITC-Trypsin Schichten. Die klein dargestellten Histogramme zeigen die Verteilung der Fluoreszenzintensität für PEMC mit 4 bzw. 9 Schichten FITC-Trypsin.
• Abb. 18: Zellelektrophoretische Mobilität von PEMC, die alternierend mit PSS und Trypsin beschichtet wurden. Gemessen wurde in PBS bei pH 7,4. Dargestellt sind die mittleren Mobilitätswerte in 10^-8m²V^-1s^-1 und deren Standardabweichung. n = 180.
• Abb. 19: Zellelektrophoretische Mobilität von PEMC, die alternierend mit Alginat und Trypsin beschichtet wurden. Gemessen wurde in PBS bei pH 7,4. Dargestellt sind die mittleren Mobilitätswerte in 10^-8m²V^-1s^-1 und deren Standardabweichung. n = 180
• Abb. 20: Histogramm von PEMC, die alternierend mit FITC-Trypsin und Alginat beschichtet wurden. Die graue Kurve entspricht Partikeln mit einer Schicht FITC-Trypsin. Blau sind Partikel mit 3 Schichten FITC-Trypsin dargestellt. Die rote Linie zeigt den Peak der schwarzen Kurve, der PEMC-Triplets entspricht. Dieser liegt bei der FI, die derer von einzelnen PEMC mit drei Schichten Trypsin entspricht (blaue Kurve). Aufgetragen sind die Ereignishäufigkeit (Count) und die relative Fluoreszenzintensität (FITC) der Partikel. Die Skalierung ist logarithmisch.
• Abb. 21: relative Fluoreszenzintensitäten in Abhängigkeit von der Schichtenanzahl von PEMC, die alternierend mit FITC-Trypsin und PSS beschichtet wurden. Die Schichtenanzahl bezeichnet die Anzahl der FITC-Trypsin Schichten. Dargestellt sind mittlere Fluoreszenzintensitäten und deren Standardabweichung. n = 24.000-31.000. Gemessen wurde in PBS bei pH 7,4. Es ist eine lineare Trendlinie in rot dargestellt, deren Geradengleichung in der Abbildung gezeigt ist. Ihr Bestimmtheitsmaß beträgt 0,99.
• Abb. 22: relative Fluoreszenzintensitäten in Abhängigkeit von der Schichtenanzahl von PEMC, die alternierend mit FITC-Trypsin und Alginat beschichtet wurden. Dargestellt sind mittlere Fluoreszenzintensitäten und deren Standardabweichung. n = 24.000-31.000. Die Schichtenanzahl bezeichnet die Anzahl der FITC-Trypsin Schichten. Gemessen wurde in PBS bei pH 7,4. Es ist eine lineare Trendlinie in rot dargestellt, deren Geradengleichung in der Abbildung gezeigt ist. Ihr Bestimmtheitsmaß beträgt 0,99.
• Abb. 23: Relative Fluoreszenzintensitäten in Abhängigkeit von der Schichtenanzahl von PEMC, die alternierend mit FITC-Trypsin und Alginat beschichtet wurden. Dargestellt sind mittlere Fluoreszenzintensitäten und deren Standardabweichung. n = 24.000-31.000. Es sind jeweils die Intensitäten aufeinander folgender Schichtenpaare FITC-Trypsin/Alginat dargestellt. Durch Aufbringen einer zusätzlichen Alginatschicht verringert sich das Fluoreszenzsignal im Vergleich zu den PEMC ohne zusätzliche Alginatschicht nicht. Gemessen wurde in PBS bei pH 7,4.
• Abb. 24: Trypsin-Standardkurve zur Errechnug von Trypsinkonzentrationen von stark verdünnten wässrigen Lösungen aus photometrisch bestimmten Extinktionswerten unter Verwendung der Methode nach Lowry. Dargestellt sind Mittelwerte und deren Standardabweichung. n = 5. Konzentrationsangaben in µg/ml. Das Bestimmtheitsmaß der dargestellten Trendlinie beträgt 0,99. Ihre Geradengleichung ist in der Abbildung angegeben.
• Abb. 25: Trypsinmenge in pg pro PEMC bei Beschichtung mit Trypsin und PSS. Dargestellt sind die durch die Methode nach Lowry bestimmten Proteinkonzentrationen bezogen auf die ermittelte Zellzahl. Es resultiert die Angabe in pg pro PEMC. Angegeben sind Mittelwerte und ein Fehler von 20%. n = 2.
• Abb. 26: Trypsinmenge in pg pro PEMC bei Beschichtung mit Trypsin und Alginat. Dargestellt sind die durch die Methode nach Lowry bestimmten Proteinkonzentrationen bezogen auf die ermittelte Zellzahl. Es resultiert die Angabe in pg pro PEMC. Angegeben sind Mittelwerte und ein Fehler von 20%. n = 2.
• Abb. 27: Aktivität bezogen auf einzelne PEMC. Die Zahlwerte der Abszisse entsprechen der Anzahl der Trypsin-Schichten der jeweiligen PEMC. Auf der Ordinate ist die Aktivität bezogen auf eine einzelne PEMC dargestellt (ΔE µl /s n * 10⁹ ). Schwarz = Beschichtungsserie mit Alginat/Trypsin, rot = PSS/Trypsin dargestellt. Gleichfarbig zu den Messwerten wurden lineare Trendlinien angepasst, deren Geradengleichung und Bestimmtheitsmaß in der Abbildung angegeben sind. Dargestellt sind Mittelwerte und deren Standardabweichungen. n=3
• Abb. 28: Aktivität von mit Trypsin beschichteten PEMC bezogen auf die photometrisch bestimmte Trypsinkonzentration (Lowry). Angegeben sind Mittelwerte der Aktivität und die Standardabweichung. n=3. Werte in (ΔE ml / s µg x 10⁶).
• Abb. 29: Aktivität von Trypsinlösungen in Tris-Puffer (pH 7,4) bei unterschiedlichen Trypsinkonzentrationen. Konzentrationsangaben in mg/ml. Die Aktivität ist als Extinktionsänderung pro Sekunde dargestellt. Gezeigt sind Mittelwerte und die Standardabweichung (ΔE/s). n = 3
• Abb. 30: Darstellung der verbleibenden Aktivität des an PEMC immobilisierten Trypsins für verschiedene aufeinander folgende PEMC Beschichtungen. Dargestellt ist die verbleibende Restaktivität des an die PEMC gebundenen Trypsins in %. Als Bezug diente Trypsin, dass in Tris-Puffer bei pH7,4 untersucht wurde (s. 3.6.2). Gezeigt sind Mittelwerte und der Fehlerbereich einer Standardabweichung. Hell ist die Beschichtungsserie mit Alginat und Trypsin, dunkel die mit PSS und Trypsin dargestellt. n=3
• Abb. 31: Untersuchung der Enzymaktivität bei Änderung des pH-Wertes. Rot dargestellt sind Trypsin-Lösungen in destilliertem Wasser (0,5 mg/ml). Schwarz ist die Aktivität von PEMC-Suspensionen ((PSS/PAH)₂PSS-Trypsin) in destilliertem Wasser dargestellt. Bestimmt wurde die Aktivität als ΔE/s. Die höchste Aktivität einer Gruppe wurde als 100% definiert und alle anderen daran gemessen. Die Puffer sind Borat-Puffer. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardabweichungen. n=5
• Abb. 32: Untersuchung der Enzymaktivität bei Änderung des pH-Wertes. Rot dargestellt sind Trypsin-Lösungen in destilliertem Wasser (0,5 mg/ml). Schwarz dargestellt ist die Aktivität von PEMC, die mit Trypsin und Alginat ((PSS/PAH)₂PSS-Trypsin-PSS-Trypsin) beschichtet wurden. Bestimmt wurde die Aktivität als ΔE/s. Die höchste Aktivität einer Reihe wurde als 100% definiert und alle anderen daran gemessen. Als Puffer wurde ein Borat-Puffer-System verwendet. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardabweichungen. n=5
• Abb. 33: Untersuchung der Enzymaktivität bei Änderung des pH-Wertes. Rot dargestellt sind Trypsin-Lösungen in destilliertem Wasser (0,5 mg/ml). Schwarz dargestellt ist die Aktivität von PEMC, die mit Trypsin und PSS ((PSS/PAH)₂PSS-Trypsin-Alginat-Trypsin) beschichtet wurden. Bestimmt wurde die Aktivität als ΔE/s. Die höchste Aktivität einer Gruppe wurde als 100% definiert und alle anderen daran gemessen. Es wurde Borat-Puffer verwendet. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardabweichungen. n=5
• Abb. 34: Korrelation der normierten Messwerte der photometrisch bestimmten Proteinkonzentration pro PEMC (Lowry) und der flowzytometrisch bestimmten, normierten mittleren Fluoreszenzintensität. Rot ist eine angepasste Trendlinie abgebildet, deren Geradengleichung und Bestimmtheitsmaß in der Abbildung angegeben sind. Dargestellt sind Mittelwerte (dimensionslos) und eine Standardabweichung. n=3. A = Beschichtungsserie mit Alginat und Trypsin bzw. FITC-Trypsin, B = Beschichtungsserie mit PSS und Trypsin bzw. FITC-Trypsin.
• Abb. 35: Korrelation der normierten Messwerte der flowzytometrisch bestimmten, normierten mittleren Fluoreszenzintensität und den enzymkinetisch bestimmten (normierten) Aktivitätswerten pro PEMC. Rot ist eine angepasste Trendlinie abgebildet, deren Geradengleichung und Bestimmtheitsmaß in der Abbildung angegeben sind. Dargestellt sind Mittelwerte (dimensionslos) und eine Standardabweichung. n=3. A = Beschichtungsserie mit Alginat und Trypsin bzw. FITC-Trypsin, B = Beschichtungsserie mit PSS und Trypsin bzw. FITC-Trypsin.