Veränderungen in der Genexpression fremdstoffmetabolisierender Enzyme und Bedeutung genetischer Polymorphismen unter besonderer Berücksichtigung von HIV-Virustatika

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)
im Fach Pharmazie

eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I
der Humboldt Universität zu Berlin

von
Diplom-Biopharmakologin Isabella Gashaw , geb. Nowakowski
geb. am 15.09.1972 in Katowice (Polen)

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. J. Mlynek

Dekan:
Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. M. Linscheid

Gutachter:
1. Prof. Dr. med. J. Brockmöller
2. Prof. Dr. rer. nat. H.-H. Borchert

Tag der mündlichen Prüfung: 01.10.2003

Inhaltsverzeichnis

• 1  Einleitung
• 2  Theoretische Hintergründe
  • 2.1 HIV und Therapie
  • 2.2 Rolle der Cytochrom-P450-Enzyme und des P-Glykoproteins im Stoffwechsel der Virustatika
  • 2.3 Cytochrom-P450-Enzyme
    • 2.3.1 Cytochrom P-450 1A1
    • 2.3.2 Cytochrom P-450 1B1
    • 2.3.3 Cytochrom P-450 3A4
  • 2.4 P-Glykoprotein
  • 2.5 Alprazolam: Wirkung und Stoffwechsel
  • 2.6 Aufgabenstellung der Arbeit
• 3  Material
  • 3.1  Substanzen, Puffer, Lösungen und Medien
  • 3.2  Oligonukleotide
  • 3.3 Zelllinien
  • 3.4 Verwendete Kits
  • 3.5 Computerprogramme
  • 3.6 Datenbanken
  • 3.7 Geräte
  • 3.8 Sonstiges Zubehör
• 4  Methoden
  • 4.1 Zellkultivierung
  • 4.2 Durchführung der Studie
  • 4.3 Zytotoxizitätstest
  • 4.4 Methoden zur Analyse der mRNA
    • 4.4.1 Extraktionsverfahren zur Gewinnung von RNA
      • 4.4.1.1 Extraktion der zellulären RNA aus Zellkulturen
      • 4.4.1.2 Extraktion der zellulären RNA aus Leukozyten
      • 4.4.1.3 Gewinnung der zellulären RNA aus Leberproben
    • 4.4.2 Bestimmung der RNA-Konzentration
    • 4.4.3 Reverse Transkription - Polymerase Ketten Reaktion
      • 4.4.3.1 CYP1A1 RT-PCR
      • 4.4.3.2  CYP1B1 RT-PCR
      • 4.4.3.3 CYP3A4 RT-PCR
      • 4.4.3.4 MDR1 RT-PCR
      • 4.4.3.5 β-Mikroglobulin RT-PCR
    • 4.4.4 Agarose-Gelelektrophorese
    • 4.4.5 Kapillarelektrophorese
    • 4.4.6 Inter-day und intra-day Variationskoeffizient
  • 4.5 Sequenzierung
  • 4.6 Methoden zur Analyse der DNA
    • 4.6.1 Isolierung der genomischen DNA
    • 4.6.2 Analyse des CYP3A4*1B Genotyps
    • 4.6.3  Analyse des CYP3A4*3 Genotyps
    • 4.6.4 Analyse des CYP3A5*1 Genotyps
    • 4.6.5 Analyse des CYP2C19*2 Genotyps
  • 4.7  Bestimmung der Konzentration von Alprazolam im Plasma
  • 4.8 Statistische Auswertung
• 5  Ergebnisse
  • 5.1 Induktion der CYP1A1 und CYP1B1 mRNA durch antiretrovirale Mittel
  • 5.2  Induktion der CYP3A4 und MDR1 mRNA durch antiretrovirale Mittel
  • 5.3  CYP3A4 mRNA Expression in Leukozyten unter Rifampicin Induktion: Korrelation mit der Pharmakokinetik von Alprazolam unter Berücksichtigung bekannter Polymorphismen
• 6  Diskussion
  • 6.1 RNA Analytik mittels RT-PCR
  • 6.2 Untersuchungen zur Genexpression in Zellkulturen
  • 6.3 CYP3A4 mRNA Bestimmung in Leukozyten und Korrelation mit der Pharmakokinetik von Alprazolam
• 7  Zusammenfassung
• 8 Literaturverzeichnis
• Abkürzungsverzeichnis
• Danksagung
• Erklärung

Tabellen

• Tabelle 1: Antiretrovirale Stoffklassen, Substanzen und Dosierung
• Tabelle 2: Metabolismus der HIV Medikamente
• Tabelle 3: Bekannte inhibierende und aktivierende Eigenschaften der antiretroviralen Mittel auf pharmakologisch relevante Proteine
• Tabelle 4: Einige Substrate von CYP3A4
• Tabelle 5: Substrate des MDR1 Transporters
• Tabelle 6: Verwendete Puffer
• Tabelle 7: Getestete Medikamente
• Tabelle 8: Weitere Forschungschemikalien
• Tabelle 9: Verwendete Enzyme
• Tabelle 10: Sequenzen aller verwendeten Oligonukleotide
• Tabelle 11: Charakteristika der verwendeten Zellkulturen
• Tabelle 12: Wachstumscharakteristika der Zellkulturen
• Tabelle 13: Die Effekte der getesteten antiretroviralen Mittel auf die CYP1A1 und CYP1B1 mRNA Expression
• Tabelle 14: Expression von CYP3A4 und MDR1 in verschiedenen humanen Zelltypen
• Tabelle 15: Die getesteten Substanzen und die Expression von CYP3A4 und MDR1 mRNA in COLO-320 Zellkultur
• Tabelle 16: Die getesteten Substanzen und die Expression von CYP3A4 und MDR1 mRNA in HepG2-Zellkultur
• Tabelle 17: CYP3A4 mRNA in Leukozyten und Alprazolam Kinetik
• Tabelle 18: Die ermittelten Parameter für die Testgüte der beiden verwendeten analytischen Verfahren.
• Tabelle 19: Korrelation des Geschlechts mit der CYP3A4 mRNA Expression und Alprazolam Konzentration
• Tabelle 20: Verteilung der untersuchten Genotypen mit den Alprazolam Konzentrationen und CYP3A4 mRNA Gehalt
• Tabelle 21: Literaturvergleich der Primer zur Detektion von CYP3A4 mRNA in Leukozyten.
• Tabelle 22: Einige Parameter zur Pharmakokinetik der untersuchten antiretroviralen Mittel
• Tabelle 23: Inhibierende und aktivierende Eigenschaften der untersuchten antiretroviralen Mittel auf pharmakologisch aktive Proteine

Bilder

• Abbildung 1: Lebenszyklus des HIV
• Abbildung 2: Strukturformeln der antiretroviralen Mittel
• Abbildung 3: Prinzip der hochaktiven antiretroviralen Therapie
• Abbildung 4: Aktivierung des Benzo(a)pyrens zum kanzerogenen Diol
• Abbildung 5: Die regulatorischen Elemente des CYP1A1
• Abbildung 6: Verlauf eines Regulationsweges
• Abbildung 7: Die regulatorischen Elemente des CYP1B1 Gens
• Abbildung 8: Organisation der pharmakologisch bedeutsamen regulatorischen Segmente des CYP3A4 Gens
• Abbildung 9: Liganden des Pregnan-X-Rezeptors und des Konstitutiven Androstan Rezeptors
• Abbildung 10: Organisation der regulatorischen Einheit des MDR1 Gens
• Abbildung 11: Biotransformation von Alprazolam
• Abbildung 12: Prinzip der Herstellung des externen Standards zur Quantifizierung der CYP1A1 und CYP1B1 mRNA
• Abbildung 13: Ergebnisse der RT-PCRs für CYP1A1 mRNA einer Probe
• Abbildung 14: Ergebnisse der RT-PCRs für CYP1B1 einer Probe
• Abbildung 15: Das Prinzip der Detektion der entstehenden PCR-Produkte mittels zwei Hybridisierungssonden
• Abbildung 16: Prinzip der Herstellung des externen Standards zur Quantifizierung der CYP3A4 mRNA
• Abbildung 17: PCR des CYP3A4 RNA Standards
• Abbildung 18: CYP3A4 PCR-Verlauf
• Abbildung 19: CYP1A1 mRNA Expression nach Inkubation mit 6 nukleosidischen Reverse Transkriptase Inhibitoren
• Abbildung 20: Nukleosidischen Reverse Transkriptase Inhibitoren und die Expression von CYP1B1 mRNA
• Abbildung 21: Effekte von Efavirenz und Nevirapin auf mRNA Expression von CYP1A1 und CYP1B1
• Abbildung 22: CYP1A1 mRNA Expression unter Einwirkung von Proteaseinhibitoren
• Abbildung 23: CYP1B1 mRNA Konzentrationen nach 18-stündigen Inkubationen mit Proteaseinhibitoren
• Abbildung 24: Einfluss der Passagenzahl auf die CYP3A4 mRNA Expression
• Abbildung 25: Konzentrationsabhängige Veränderungen in der mRNA Expression von CYP3A4 und MDR1 nach mehrtägiger Behandlung mit Rifampicin
• Abbildung 26: CYP3A4 mRNA Expression in HepG2 und COLO-320 Zellkultur unter Einwirkung der Nukleosidischen Reverse Transkriptase Inhibitoren.
• Abbildung 27: MDR1 mRNA Expression in HepG2 und COLO-320 Zellkultur unter Einwirkung der Nukleosidischen Reverse Transkriptase Inhibitoren.
• Abbildung 28: Einfluss der Nicht-Nukleosidischen Reverse Transkriptase Inhibitoren auf die Expression von CYP3A4 und MDR1 mRNA in COLO-320 und HepG2-Zellen.
• Abbildung 29: CYP3A4 mRNA Expression unter Einwirkung der Proteaseinhibitoren in der COLO-320- und HepG2-Zellkultur
• Abbildung 30: Veränderungen in der MDR1 mRNA Expression nach Inkubationen mit Proteaseinhibitoren in der COLO-320 und HepG2-Zellkultur
• Abbildung 31: Der maximale Induktionseffekt der untersuchten Medikamente auf die Expression von CYP3A4 und MDR1 mRNA
• Abbildung 32: Sequenzvergleich eines cDNA Amplifikates aus Leukozyten mit den Vertretern der CYP3A Subfamilie
• Abbildung 33: CYP3A4 PCR-Kinetik aus drei Leukozytenproben vor und nach der Induktion
• Abbildung 34: Individuelle Unterschiede im CYP3A4 mRNA Gehalt und Alprazolam Clearance bei 96 gesunden Probanden vor und nach Rifampicin Behandlung
• Abbildung 35: Logarithmisch transformierte Häufigkeitsverteilung der CYP3A4 mRNA Kopien in Leukozyten von 96 Probanden vor und nach Behandlung mit Rifampicin
• Abbildung 36: Häufigkeitsverteilung der Werte für die Alprazolam-Clearance
• Abbildung 37: Korrelation der CYP3A4 mRNA Mengen in Leukozyten mit der Alprazolam Clearance vor und nach fünftägiger Rifampicin Behandlung bei 96 Probanden
• Abbildung 38: Stängel-Blatt-Diagramme zur Korrelation der Induktion von CYP3A4 mit dem Geschlecht
• Abbildung 39: Der maximale Induktionseffekt der antiretroviralen Mittel auf die mRNA Expression von CYP1A1 und CYP1B1.
• Abbildung 40: Die maximalen Induktionseffekte der untersuchten Substanzen auf die Expression der CYP3A4 und MDR1 mRNA in COLO-320 und HepG2-Zellkultur
• Abbildung 41: Einfluss des C3435T Polymorphismus im MDR1 Gen auf die CD4+ Zellzahlen in AIDS-Patienten