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2  Theoretische Hintergründe

2.1 HIV und Therapie

Das HIV (humanes Immundefektvirus) gehört zur Familie der Retroviren und trägt zwei einzelsträngige RNA-Moleküle als Genom (Abbildung 1). Um an der Proteinsynthese der Wirtszelle teilnehmen zu können, enthält das Virus die Reverse Transkriptase, das namensgebende Enzym der Familie. Dieses Enzym ermöglicht das Umschreiben der im Virus vorhandenen RNA in eine komplementäre doppelsträngige DNA-Sequenz. Viren dieser Gruppe waren bereits vor über 40 Jahren als Erreger von Tumorerkrankungen in Tieren nachgewiesen worden. Man bezeichnete sie deshalb auch als Oncornaviren. Als erster humanpathogener Retrovirus wurde 1978 der Erreger der adulten T-Zell-Leukämie (das HTLV-I), entdeckt [1]. Alle bisher bekannten pathogenen Retroviren zeigen einen ausgesprochenen Zelltropismus für eine Subpopulation der T-Lymphozyten (Helfer-T-Lymphozyten, CD4-positive Zellen), und werden deshalb als HTL-Viren (human T-cell leukemia virus) bezeichnet. Die HTL-Viren werden ihrerseits in verschieden funktionellen Gruppen unterteilt. Während die Leukämie Erreger zu einer verstärkten Proliferation von funktionell abnormen Helfer-T-Lymphozyten führen, zerstören die HI-Viren diesen Zelltyp.

Abbildung 1: Lebenszyklus des HIV

Die einzelnen Schritte des Vermehrungszyklus können Ansatzpunkte für die antiretrovirale Therapie darstellen (kennzeichnet mit a bis f). Die Infektion der Zielzelle erfolgt, nachdem das Virus an der Oberfläche andockt und mit der Zellmembran fusioniert (a). Nach ihrer Freisetzung in die Zelle wird die HIV-RNA (b) mit Hilfe der Reversen Transkriptase (c) in die DNA umgeschrieben und kann als Provirus in die genomische DNA integriert (d) werden. Eine spätere Aktivierung des Virus resultiert in der Translation der Polyproteine, die mittels Protease (e) gespalten werden. Anschließend wird das Virus verpackt und durch Knospung (f) freigesetzt.

Beim Menschen kommen fünf der sieben Gruppen der Retroviren vor, wovon das HIV (früher zur Unterfamilie der Lentiviren gezählt) eine eigene darstellt. Das Virus unterscheidet sich durch die Komplexität seines viralen Genoms von den anderen Retroviren. Es sind zwei Serotypen beschrieben, der HIV-1 Erreger (zurückzuführen auf einige Unterarten des Schimpansen Pan troglodytes) sowie der HIV-2 (zurückzuführen auf Rauchgrau- oder Mohrenmangaben Cercocebus torquatus atys). HIV-2 verursacht die sogenannte afrikanische AIDS und wurde 1986 in Westafrika entdeckt. Dieser Virus zeigt außerordentlich starke genetische Homologie zu einem bei Makakken (Rhesusaffen) Immundefekt verursachenden Virus, dem SIV (simian immunodeficiency virus). Diese Homologie beträgt zu SIV 75 - 80% während die HIV-1 RNA mit der HIV-2 RNA lediglich zu 40% übereinstimmt [2]. Da das HIV-2 hauptsächlich in Westafrika endemisch ist, ist noch relativ wenig über den Verlauf der HIV-2 Infektion bekannt. Es wird angenommen, dass die Inkubationszeit von HIV-2 erheblich länger ist als bei HIV-1 und die Infektiösität geringer.

Die weltweit meisten Fälle von AIDS werden durch HIV-1 ausgelöst während HIV-2 sich im wesentlichen auf Westafrika und historisch damit liierte Länder wie Frankreich und Belgien beschränkt.

Die infektiösen Partikel bestehen aus einem von der Hüllmembran umgebenen Kapsid. Die viralen Glykoproteine: Transmembranes Protein und externes Glykoprotein sind mit der Membran assoziiert und werden als ein gemeinsames Vorläuferprotein gebildet. Die Matrixproteine sind mit [Seite 3↓]der Innenseite der Hüllmembran verbunden. Das Virion bindet über seine Oberflächen-Glykoproteine an spezifische Rezeptoren (u.a. an das CD4) auf der Oberfläche der Wirtszelle (Abbildung 1). Die beiden RNA-Moleküle werden daraufhin von der viralen RNA-abhängigen DNA-Polymerase in die sogenannte provirale DNA umgeschrieben, diese wird in die chromosomale DNA der Wirtszelle integriert und mit jeder Zellteilung an die Tochterzellen weitergegeben. Ausgehend vom integrierten DNA-Provirus erfolgt die Transkription mittels zellulärer RNA-Polymerasen. Die reifen Virionen werden abschließend aus der Zelle ausgeschleust, um neue Zellen zu infizieren. Die hauptsächlichen Zielzellen des HIV sind die CD4-Lymphozyten, deren Zerstörung für den immun­suppressiven Effekt des HIV mitverantwortlich ist. Es können aber auch andere CD4 tragende Zellen infiziert werden, z. B. Monozyten, Makrophagen und die Langerhans-Zellen der Haut. Im Anfangsstadium der Infektion kommt es zu einem transienten Anstieg der CD8-Lymphozyten (zytotoxische L.). Danach folgt eine meist jahrelange Phase der zunehmenden Immunsuppression, gekennzeichnet durch einen Abfall der CD4-Zahlen bei zunehmender Virusreplikation.

Mit der Aufklärung des Lebenszyklus des HIV sind verschiedene potentielle Ansatzpunkte für eine antiretrovirale Therapie aufgedeckt worden. Dennoch nutzt man bislang nur zwei der Schritte der Virusvermehrung. Zum einen ist es die Transkription der Virus-RNA zu DNA, für welche die Reverse Transkriptase verantwortlich ist, und zum anderen die proteo­lytische Verarbeitung viraler Vorläuferproteine für die Fusion zu reifen Viruspartikeln. Diesen Prozess katalysiert die virale Protease.

Tabelle 1: Antiretrovirale Stoffklassen, Substanzen und Dosierung

Substanzgruppe

Substanz

Dosis

Wichtigste Nebenwirkungen

Reverse Transkriptase
Inhibitoren– Nukleosidanaloga (NRTI)

  

Alle NRTIs: selten Laktatazidose

Abacavir (ABC)

2 x 300 mg

Hypersensitivitäts-Syndrom bei 5%

Lamivudin (3TC)

2 x 150 mg

Kopfschmerz

Stavudin (d4T)

2 x 40 mg

Neuropathie, Pankreatitis

Zalcitabin (ddC)

3 x 0.75 mg

Neuropathie, orale Ulzera

Zidovudin (AZT, ZDV)

2 x 250 mg

Cephalgie 50%, Neutropenie, Anämie,

Didanosin (ddI)

2 x 200 mg

Pankreatitis, Neuropathie,

Proteaseinhibitoren (PI)

  

alle PIs: Glukoseintoleranz, Fettstoffwechselstörung und Lipodystrophiesyndrom

Amprenavir (APV)

2 x 1200 mg

Diarrhö, Kopfschmerz, Arzneiexanthem

Indinavir (CRX, IDV)

3 x 800 mg

Nephrolithiasis, Hyperbilirubinämie

Lopinavir (LPV) + Ritonavir

2 x 230/57.5 bis 2 x 400/100 mg

Diarrhö, Pankreatitis

Nelfinavir (NFV)

3 x 750 mg

Diarrhö 20%, Übelkeit, Schwindel

Ritonavir (RTV)

2 x 600 mg

Lebertoxizität, Diarrhö, Übelkeit, Hypertriglyzeridämie

Saquinavir (SQV)

2 x 400-600 mg
3 x 1200 mg

Lebertoxizität, Diarrhö, Übelkeit (meist mild)

Reverse Transkriptase
Inhibitoren – Nichtnukleosidisch (NNRTI)

  

alle NNRTIs: Arzneireaktionen

Efavirenz (EFV)

1 x 600 mg

Psychotrope NW; Arzneiexanthem

Delavirdin (DLV)

3 x 400 mg

Arzneiexanthem bei 50%

Nevirapin (NVP)

2 x 200 mg

Arzneiexanthem, Lebertoxizität


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Als erste antiretroviral wirksame Substanz wurde 1986 der nukleosidische Inhibitor der Reversen Transkriptase Zidovudin (Abbildung 2) zur HIV-Behandlung zugelassen. Es wurde in Monotherapie angewandt und brachte aufgrund der raschen Resistenzentwicklung wenig Erfolg. Die Kombinations­therapien wurden möglich, als weitere Nukleosidanaloga zugelassen wurden. Chronologisch aufgezählt waren es Didanosin, Zalcitabin, Lamivudin und Stavudin. Heute sind 15 Arzneimittel zugelassen, die miteinander kombiniert den Patienten verabreicht werden (Tabelle 1). Sie werden in drei Klassen aufgeteilt. Es sind die Nukleosidischen Reverse Transkriptase Inhibitoren (NRTIs), die Nicht-Nukleosidischen Reverse Transkriptase Inhibitoren (NNRTIs) sowie die Proteaseinhibitoren (PIs).

Die Nicht-Nukleosidischen Hemmstoffe der Reversen Transkriptase, Delavirdin, Nevirapin und Efavirenz (Abbildung 2), hemmen die Reverse Transkriptase (RT) des HIV-1 am allosterischen Zentrum des Enzyms, indem sie sich an eine Stelle des Moleküls anlagern, die mit dem katalytischen Zentrum assoziiert ist. Die Affinität zur RT ist höher als zu DNA-abhängigen DNA-Polymerasen der Säugetierzellen. Die derzeit verfügbaren NNRTIs sind nur gegen HIV-1 wirksam. Konzentrationen von Efavirenz im unteren nanomolaren Bereich waren in Zellkulturuntersuchungen ausreichend, um die Vermehrung von HIV-1 zu hemmen.

Die Nukleosidischen Reverse Transkriptase Inhibitoren müssen im Gegensatz zu NNRTIs nach Aufnahme in die Zelle zum Triphosphat phosphoryliert werden, und die entstehenden Triphosphate konkurrieren mit den Wirtszelltriphosphaten um die Bindung an der Reversen Transkriptase. Sie hemmen das Enzym kompetitiv im aktiven Zentrum und werden in die DNA eingebaut, was zum Kettenabbruch führt. Die Affinität der NRTIs zur RT ist höher als zu DNA-abhängigen DNA-Polymerasen der Säugetierzellen. Außer Stavudin sind alle NRTIs sowohl gegen HIV-1 als auch gegen HIV-2 einsetzbar.

Proteaseinhibitoren hemmen die virale Protease im aktiven Zentrum und verhindern somit die proteolytische Spaltung der Polyproteine in die funktionsfähigen Endprodukte. Dieser Vorgang läuft vermutlich während oder kurz nach dem Ausknospen des Virus von der Zellmembran ab, wodurch die PIs anders als die RTIs den viralen Reifungsprozess auch in bereits infizierten Zellen unterdrücken. Während effizienter Behandlung mit Proteaseinhibitoren können nur unreife, nicht infektiöse Virushüllen exprimiert werden. Die Affinität zu viraler Protease ist höher als zu humanen Enzymen wie z. B. Renin (ist ebenfalls eine Aspartatprotease), was eine ausreichend hohe Selektivität bietet. Bis auf Indinavir sind alle Proteaseinhibitoren sowohl gegen HIV-1 als auch gegen HIV-2 wirksam. Saquinavir (Abbildung 2) war der erste Proteaseinhibitor, der zur AIDS-Therapie eingesetzt wurde. Im Fall von Kaletra® handelt es sich Kombination aus Lopinavir und niedrig dosiertem Ritonavir („Boosting“), das den Cytochrom P-450-Metabolismus hemmt, was wiederum zur Erhöhung der Bioverfügbarkeit von Lopinavir führt.

Die Wirkspiegel der einzelnen HIV-Therapeutika werden von einer Vielzahl von Faktoren beeinflusst. So weisen die antiretroviralen Pharmaka, im besonderen die Proteaseinhibitoren, eine sehr unterschiedliche Bioverfügbarkeit auf (Tabelle 2). Um die orale Bioverfügbarkeit zu vergrößern, wird Amprenavir mit großen Mengen Vitamin E verabreicht [3]. Vitamin E erhöht die Löslichkeit durch Mizellenbildung und die Permeabilität durch Hemmung des aktiven Transports über P-Glykoprotein [4].

Wie bei der antibakteriellen Therapie stellt die Resistenzentwicklung auch bei der antiretroviralen Therapie ein großes Problem dar. Eine durch erhebliche Fehlerrate der Reversen Transkriptase bedingte hohe Mutationsneigung und eine suboptimale Virushemmung, die durch ungenügende Wirkstoffspiegel ausgelöst wird, führen beim HIV sehr häufig zu Resistenzen. Die Medikamente können Kreuzresistenzen zu Vertretern derselben Klasse aufweisen [5, 6, 7]. Therapieziel ist daher immer eine möglichst vollständige Unterdrückung der Virusvermehrung, die an der Viruslast gemessen wird. Ein Therapieversagen kann auch auf mangelnde Einhaltung der Richtlinien durch den Patienten, pharmakokinetische Einflüsse und Änderungen des intrazellulären Arzneimittelmetabolismus zurückgeführt werden.


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Abbildung 2: Strukturformeln der antiretroviralen Mittel

Es sind die in dieser Arbeit verwendeten Wirkstoffe dargestellt.

Weitere Substanzen befinden sich in unterschiedlichen Stadien der Entwicklung, wie Emtricitabin, Capravirin, Emivirin, T-20 (Pentafusid) und AMD3100 (Bicyclam). Hierbei handelt es sich um Korezeptor-Antagonisten, Adsorptions-(gp120-) und Fusions-(gp41-)Inhibitoren, Antisense-Oligonukleotide, Integrase- und Transkriptions-(Transaktivations-)Inhibitoren. Auch bei bereits verwendeten Angriffspunkten ist mit Neuentwicklungen zu rechnen, wie z. B. den Nukleosid-Phosphonat-Analoge Adefovir und Tenofovir disoproxil.


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Die heutige Therapie stützt sich auf die Richtlinien der sogenannten hochaktiven antiretroviralen Therapie (HAART), deren Ziel es ist, die Viruslast auf ein Niveau unterhalb der Nachweisgrenze zu drücken und diesen Zustand lebenslang zu erhalten. Gegenwärtig liegt die Nachweisgrenze bei 20 bis 50 viralen Genomkopien pro 1 ml Plasma. Die Viruslast dient als Surrogatmarker, denn je niedriger die Viruslast desto höher die Lebenserwartung. Für eine wirksame Initialtherapie stehen eine Reihe von Optionen zur Verfügung, die in Abbildung 3 dargestellt sind.

Abbildung 3: Prinzip der hochaktiven antiretroviralen Therapie

Im Rahmen der Therapie werden Nukleosidische und Nicht-Nukleosidische Reverse Transkriptase Inhibitoren sowie Proteaseinhibitoren in verschiedenen Kombinationsmöglichkeiten verwendet.

Die günstigen Kombinationseffekte, die durch den Einsatz zweier NRTIs entstehen, sind zum Teil darauf zurückzuführen, dass Resistenz-Mutationen, die durch eines der Medikamente hervorgerufen werden, durch die Zweitmutation - bedingt durch die andere Substanz - abgeschwächt oder aufgehoben werden. So führt eine Mutation am Kodon 74 des Reverse Transkriptase-Gens, die unter Behandlung mit Didanosin selektiert wird, dazu, dass die Empfindlichkeit des Virusstammes mit einer für Zidovudin typischen Mutation am Kodon 215 gegen diese Substanz wieder erhöht wird [8]. In den Therapieschemata spielt Zidovudin eine zentrale Rolle, da hier kaum eine relevante Kreuzresistenz zu anderen Substanzen bekannt ist.

Aufgrund des HIV-bedingten Defekts der zellulären Immunfunktion, der Zerstörung der T-Helfer-Zellen zeichnet sich das Endstadium der Erkrankung durch eine erhöhte Anfälligkeit gegen Mikroorganismen aus, die nur bei einer Abwehrschwäche pathogen sind sowie durch ein vermehrtes Auftreten maligner Tumoren (Kaposi-Sarkom, Non-Hodgin’s Lymphom) und Störungen des Nervensystems, die auf einen Virusbefall des Gehirns zurückzuführen sind. Aus diesen Begleiterkrankungen resultiert eine zusätzliche Notwendigkeit der Mehrfachtherapie, die ein Arzneimittel-Wechselwirkungen Risiko impliziert.

2.2 Rolle der Cytochrom-P450-Enzyme und des P-Glykoproteins im Stoffwechsel der Virustatika

Die Superfamilie der Cytochrom-P450-Enzyme spielt eine wesentliche Rolle im Stoffwechsel der meisten Virustatika, da alle Nicht-Nukleosidischen Reverse Transkriptase Inhibitoren und alle Proteaseinhibitoren über dieses System in der Leber und in der Darmmukosa metabolisiert werden (Tabelle 2). Die Metabolisierung kann durch Fremdstoffe (z. B. Pharmaka, aber auch Nahrungsbestandteile wie Grapefruitsaft-Komponenten), Hormone und Metabolite moduliert werden. So führt eine Enzyminduktion zu einer erhöhten Clearance der Substrate, dies geht mit einer verkürzten Halbwertszeit und niedrigeren Plasmakonzentrationen einher. Die Inhibition des Enzymsystems hängt dagegen mit einer Verringerung der Clearance, einer Verlängerung der Halbwertszeit und höheren Plasmaspiegeln zusammen. Medikamente, die intensiv am Cytochrom-P-450-System verstoffwechselt werden, sind vielfältigen Interaktionen mit anderen Pharmaka unterworfen. Dies führt dazu, dass die Plasmakonzentrationen der verschiedenen Pharmaka intra- und interindividuell außerordentlich stark schwanken können. Zu niedrige Plasmaspiegel sind häufig mit einem Wirkverlust der betreffenden Substanz, zu hohe Konzentrationen mit einer vermehrten Toxizität assoziiert.


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Tabelle 2: Metabolismus der HIV Medikamente

Substanz

Enzyme

Transport

Lit.

Abacavir

Alkohol-Dehydrogenase, UDP-Glukuronyl­transferase

 

[9]

Didanosin

Xanthin Oxidase

CNT2

[10, 11, 12]

Lamivudin

Sulfoxidase
70% unverändert ausgeschieden

 

[13]

Stavudin

 

CPNT, ENT

[11, 14]

Zalcitabin

 

CNT*

[1, 15]

Zidovudin

UGT2B7

CNT*

[11, 16, 17, 18]

Delavirdin

CYP3A4 >> CYP2D6 (20%)
<5% unverändert ausgeschieden

 

[19, 20, 21, 22]

Efavirenz

CYP3A4, CYP2B6
GST

 

[22, 23, 24, 25]

Nevirapin

CYP3A4
CYP2B6
CYP2D6
GST

 

[22, 26, 27]

Amprenavir

CYP3A4 >> CYP2D6, CYP2C9

MDR1

[3, 28, 29]

Indinavir

CYP3A4
CYP3A5

MDR1, MRP1/2

[28, 29, 30, 31, 32, 33,34]

Lopinavir

CYP3A4/5

 

[35]

Nelfinavir

CYP3A4 (52 %)
CYP2C19, 2D6, 2C9

MDR1, MRP2

[28,34, 36, 37, 38]

Ritonavir

CYP3A4, CYP3A5,
CYP2D6

MDR1, MRP1, MRP2

[28, 29, 32, 33, 34, 39, 40]

Saquinavir

CYP3A

MDR1, MRP2

[28, 33, 41, 42, 43]

* Konzentrativer Na+ Nucleosid-Transporter

Die Nukleosidischen Reverse Transkriptase Inhibitoren Abacavir, Didanosin, Lamivudin, Stavudin, Zalcitabin und Zidovudin werden in der Leber kaum metabolisiert. Die Cytochrom-P450-Enzyme scheinen im Stoffwechsel dieser Komponenten keine große Rolle zu spielen. Mehr Informationen gibt es inzwischen zum Transport der NRTIs aus dem Darm. Es ist eine Reihe von Transportern für die Aufnahme der Nukleosidanaloga aus dem Gastrointestinaltrakt zuständig [11], wie z. B. der Konzentrative Natriumabhängige Nukleosidtransporter CNT (concentrative nucleoside transporter, transportiert v.a. Pyrimidine) und ENT (equilibrative nucleoside transporter). Außerdem wird vermutet, dass das MRP5 (multidrug-resisance protein 5), ein Mitglied der Superfamilie der ATP-bindenden Kassette, für den Transport der Nukleosidanaloga verantwortlich ist [44]. Die genaue Zuordnung der Medikamente zu den Transportern ist der Tabelle 2 zu entnehmen.

Der Nicht-Nukleosidische Reverse Transkriptase Inhibitor Efavirenz (EFV) induziert das Cytochrom-P450-Enzym 3A4 (Tabelle 3) in der Leber und beschleunigt somit die eigene Metabolisierung [25]. Bei gesunden Probanden erfolgte auf eine 10-tägige Behandlung durch tägliche Mehrfachgaben von 200 bis 400 mg eine unerwartet schwache Kumulation (22 - 42 % geringer als vorgesehen) mit einer kürzeren terminalen Halbwertszeit (40 - 55 h gegenüber 52 - 76 h nach Einnahme der Einzeldosis).

Ein weiteres NNRTI, Nevirapin, zeigt Wechselwirkungen mit Nelfinavir. Wie eine Studie an AIDS-Patienten zeigte, verringert die Koadministration von Nelfinavir und Nevirapin die Plasmaspiegel von NFV um 50 % [45]. Beide Substanzen werden vorwiegend über das Cytochrom-P450 3A4 verstoffwechselt. Inzwischen ist auch bekannt, dass NVP das CYP3A4 induziert [46].

Die meisten Proteaseinhibitoren beeinflussen den Cytochrom-P450 abhängigen Stoffwechsel der Arzneimittel durch Inhibtion des CYP3A4 (Tabelle 3). Im Fall von den Proteaseinhibitoren Saquinavir (SQV) und Ritonavir wird die Enzymhemmung von CYP3A4 therapeutisch genützt. Ritonavir ist ein Inhibitor von CYP3A4 und hemmt den Stoffwechsel von SQV bei gesunden Probanden [47]. Die Kombination von SQV mit RTV resultiert in signifikanter Arzneimittel Wechselwirkung vermittelt durch Enzyminhibition, die bei den Patienten zu sehr hohen SQV-Dosen und somit zur potentiellen Toxizität führt. Ritonavir erhöht die Serumspiegel von Saquinavir um das 20-fache. Während der Kombinationstherapie von SQV mit RTV empfiehlt es sich die SQV-Dosen [Seite 8↓]drastisch zu reduzieren [48]. Eine Studie an sechs Patienten zeigte starke interindividuelle Unterschiede in der Pharmakokinetik von Saquinavir nach einer Koadministration mit Nelfinavir, das die Bioverfügbarkeit von Saquinavir erhöht [49]. Die Proteaseinhibitoren weisen mit vielen Arzneimitteln Wechselwirkungen über eine Konkurrenz am CYP3A4 auf. RTV hemmt auch CYP1A2, CYP2C9 und CYP2E1. Indinavir inhibiert weniger CYP3A4 als RTV und hat keinen Einfluss auf CYP1A2, CYP2C9 oder CYP2E1 katalysierte Reaktionen [50]. Nach neueren Erkenntnissen ist Saquinavir an der Inhibition von CYP2C9 beteiligt (Aktivität gemessen in Leber Mikrosomen) [51].

Die Gruppe um R.B. Kim zeigte, dass die Proteaseinhibitoren Indinavir, Nelfinavir und Saquinavir durch das MDR1 (P-Glykoprotein) aus den Zellen transportiert werden [37]. Dadurch werden die Bioverfügbarkeit sowie die Passage durch die Bluthirnschranke, an derer Aufrechterhaltung MDR1 beteiligt ist, eingeschränkt. Die Proteaseinhibitoren können MDR1 inaktivieren, in dem sie das Protein aktiv hemmen. Was die Stärke der MDR1 Inhibition betrifft, so differieren die Aussagen. Während 1999 von Drewe et al. berichtet wurde, dass Ritonavir ein sehr potenter Inhibitor des Transportsystems ist [52], haben in vitro Untersuchungen der Arbeitsgruppe um Huisman lediglich eine moderate Hemmung des MDR1 vermittelten Transportes durch SQV und RTV gezeigt [43]. In vivo Versuche an Mäusen ergaben, dass MDR1 die Bioverfügbarkeit von SQV im Gehirn und Fetus limitierte, wenn es zusammen mit hohen Dosen von RTV verabreicht wurde [43].

Tabelle 3: Bekannte inhibierende und aktivierende Eigenschaften der antiretroviralen Mittel auf pharmakologisch relevante Proteine

Substanz

Inhibitor

Induktor

Lit.

Delavirdin

CYP3A4, 2C9, 2D6, 2C19, MDR1

 

[21, 22, 53]

Efavirenz

CYP2C9, 2C19, 3A4, MDR1

CYP3A4

[22, 25, 53]

Nevirapin

MDR1

CYP3A4

[22, 27]

Amprenavir

CYP3A4

MDR1

[3, 28]

Indinavir

CYP3A4

CYP1A1

[54, 55]

Nelfinavir

CYP3A4, MDR1

CYP1A1, MDR1

[28, 34, 38, 55]

Ritonavir

CYP3A4, 2D6, 2C9

CYP1A1, 1A4, GST

[28, 34, 51, 54, 55]

Saquinavir

CYP3A4, 2C9, MDR1

CYP1A1, MDR1

[28, 43, 51, 54, 55]

Abgesehen von den durch die Virustatika verursachten Effekten, müssen auch die Folgen der Gabe von anderen Medikamenten beachtet werden. Da durch CYP3A4 neben den antiretroviralen Substanzen auch zahlreiche andere Fremdstoffe metabolisiert werden, sind Interaktionen mit anderen Arzneimitteln und Nahrungsbestandteilen zu erwarten (wie Phenobarbital, Phenytoin, Dexamethason, Carbamazepin, Grapefruitsaft). Durch gleichzeitige Verabreichung des Rifampicin (RIF) wurde die Plasmakonzentration von Saquinavir um 46% reduziert [56, 57]. Weil es durch die Enzyminduktion zu subtherapeutischen Konzentrationen von Saquinavir kommen kann, soll die Kombination beider Medikamente vermieden werden. Andererseits führt die gleichzeitige Gabe von Grapefruitsaft zu einem Anstieg der Saquinavir-Bioverfügbarkeit um das doppelte [58]. Auch mit Ketokonazol und ähnlichen Azol-Antimykotika kann es zu Interaktionen kommen.

2.3 Cytochrom-P450-Enzyme

Die Cytochrom-P450-Enzyme bilden eine Superfamilie von Hämproteinen, die eine Schlüsselrolle im oxidativen Stoffwechsel zahlreicher endogener und exogener Substanzen spielt. Die Proteine bekamen Ihren Namen von ihrem Absorptionsmaximum bei 450 nm der Kohlenstoffmonoxid gebundenen Form. Die von den Enzymen dieser Familie vermittelte Oxidation erhöht die Polarität vieler Fremdstoffe und beschleunigt somit deren Eliminierung aus dem Körper. Auf der anderen Seite können jedoch die Cytochrom-P450-Enzyme zur Toxifizierung bestimmter Substrate beitragen und/oder eventuelle Kanzerogenität hervorrufen bzw. erhöhen. Außerdem sind diese Enzyme an der Biosynthese von Steroidhormonen beteiligt, oxidieren die ungesättigten Fettsäuren zu intrazellulären Boten und verstoffwechseln fettlöslichen Vitamine [59].

Die Cytochrom-P450-Enzyme sind lokalisiert im endoplasmatischen Retikulum (mikrosomale Fraktion) oder in der mitochondrialen Fraktion der Gewebe der Säugetiere. Die Arzneimittel metabolisierenden Cytochrom-P450-Enzyme werden in großen Mengen in hepatischen [Seite 9↓]mikrosomalen Fraktionen exprimiert, geringere Mengen wurden in der Lunge, Niere und im gastrointestinalen Trakt gefunden.

Es sind inzwischen insgesamt über 300 Gene bekannt, die für Vertreter der Cytochrom-P-450-Enzymfamilie kodieren. Die heutige Nomenklatur lässt eine direkte Zuordnung der einzelnen Enzyme zu ihrer funktionellen Gruppe zu, denn sie basiert auf der Annahme, dass sich der Umfang der Sequenz- und der Funktionsidentität umgekehrt proportional zum Entwicklungsabstand von einem evolutionärem Vorläufer verringert. Bezogen auf die Sequenzidentität der Proteine gehören alle Enzyme mit mehr als 40% Homologie derselben Familie an, während mehr als 55% der Übereinstimmungen die Klassifizierung in die gleiche Subfamilie erlauben. Die Enzyme werden wie folgt bezeichnet: die erste Zahl entspricht der Familienzugehörigkeit, der Buchstabe beschreibt die Subfamilie, während die darauffolgende Zahl für das Mitglied der Familie spezifisch ist. Familien mit der Zahl bis 100 sind ausschließlich für die eukaryotischen Systeme reserviert, während die Mikroorganismen die Zahlen über 100 für die Beschreibung der CYP-Familie beanspruchen.

Die CYP1 Familie beinhaltet zwei Subfamilien, CYP1A und CYP1B. Alle Mitglieder der beiden Subfamilien, CYP1A1, CYP1A2 und CYP1B1 sind induzierbare Enzyme, deren Expression über den Aryl-Kohlenwasserstoff-Rezeptor (AhR) Signalweg reguliert wird.

2.3.1 Cytochrom P-450 1A1

Das Cytochrom P-450 1A1 (CYP1A1) spielt eine wichtige Rolle im Stoffwechsel polyzyklischer Kohlenwasserstoffe zu reaktiven Epoxiden (Abbildung 4), die wiederum durch Epoxidhydrolasen in Diole überführt werden. Bei Benz(a)pyren ist nur die Aufspaltung der Epoxide an Positionen 4 und 5 bzw. 7 und 8 möglich. Bei einer Epoxidierung des Benz(a)pyren-7,8-dihydrodiols an den Positionen 9 und 10 wird die Hydrolyse durch Epoxidhydrolasen sterisch gehindert, was in einer hohen Reaktivität des Benz(a)pyren-7,8-dihydrodiol-9,10-epoxids resultiert, welches DNA Addukte eingehen kann [60]. Solche Adduktformationen gelten als Initiatoren des Tumorgeschehens [61]. CYP1A1 verstoffwechselt neben den genannten Fremdstoffen auch die Arzneimittel Ethoxy­resorufin, Warfarin, Amiodaron, Propranolol und Acetaminophen, diese sind auch Substrate des CYP1A2 [62, 63]. Gemeinsam mit CYP3A4 ist CYP1A1 an der Biosynthese der endogenen Steroide beteiligt, indem es beispielweise Progesteron hydrolysiert [64].

Abbildung 4: Aktivierung des Benzo(a)pyrens zum kanzerogenen Diol

Die Abbildung wurde entnommen und modifiziert aus: http://www.le.ac.uk/pa/msc/mde1.pdf

CYP1A1 wurde lokalisiert auf dem Chromosom 15q22, wo es zusammen mit dem CYP1A2 Gen ein 23 kb großes Cluster bildet [65]. Beide Gene liegen in gegensätzlicher Orientierung, wobei sie eine gemeinsame 5‘ flankierende Region benutzen. Auf dieser befinden sich Enhancer Elemente, an die Substrate binden können. Somit werden beide Gene gemeinsam reguliert. CYP1A1 mRNA weist eine Länge von 2.8 kb auf [66], während die genomische DNA 7 Exons beinhaltet. Das Protein besteht aus 512 Aminosäuren und hat ein Molekulargewicht von 58 kDa [66].


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CYP1A1 wird vorwiegend in extrahepatischen Geweben exprimiert und in vereinzelten Fällen - meist erst nach Induktion - in der Leber [67, 68]. Die Expression der Cytochrom-P450-Enzyme Isoformen wird über Interaktionen der cis-aktiven Elemente an den CYP Genen mit den DNA-bindenden, trans-aktiven Faktoren reguliert. Das CYP1A1 verfügt über mehrere Cis-Elemente mit verschiedenen Funktionen [69, 70], von denen das auf die Xenobiotika ansprechende Element (xenobiotic responsive element, XRE) als Enhancer fungiert. Es wurden sechs XRE Sequenzen (Abbildung 5) in breiten Bereichen der 5’ flankierenden Region gefunden, die alle das CACGC Motiv enthalten [69, 71]. Das auf die Glukokortikoide ansprechende Element (glucocortecoid-responsive element, GRE) funktioniert im Zusammenhang mit dem XRE ebenfalls als Enhancer und wurde im ersten Intron des CYP1A1 Gens der Ratte gefunden [72]. Eine entsprechende homologe Sequenz befindet sich auch im humanen CYP1A1. Der nukleare Transkriptionsfaktor Oct-1 bindet im 5’ Bereich des Gens an ein negatives regulatorisches Element (NRE) und unterdrückt die Expression [73]. Das NRE wurde ca. 800 Basen vor dem Transkriptionsstart lokalisiert und besteht aus einem ATGCAAAA Oktamer. Das für die basale Transkription verantwortliche Element (basic transcription element, BTE) ist essentiell für die vollständige Aktivierung des CYP1A1 [74] und wurde in der 5’ UTR nachgewiesen.

Abbildung 5: Die regulatorischen Elemente des CYP1A1

Es sind die Transkription des CYP1A1 beeinflussende Elemente schematisiert. An die XRE-Segmente binden die Heterodimere aus AhR und ARNT. Der Glukokortikoidrezeptor erkennt die im ersten Intron befindliche Erkennungssequenz GRE. Weitere Erläuterungen im Text.

Die Cytochrom-P450-Enzyme der CYP1-Familie unterliegen einer Induktion der Transkription über den Aryl-Kohlenwasserstoff-Rezeptor (AhR), an den die Induktoren binden [75]. Der Rezeptor stellt ein regulatorisches Protein im Cytoplasma dar und gehört der PER-ARNT-SIM (PAS) Familie der Transkriptionsfaktoren an. Über diesen Signalweg werden mehrere Gruppen von Enzymen gemeinsam induziert; neben den CYP1A1, CYP1A2 und CYP1B1 werden auch die Glutathion­transferase der alpha-Familie, eine UDP-Glucuronosyltransferase der 1-Familie, die NAD(P)-Menadion-Oxido-Reduktase, eine Aldehyddehyrogenase und die N-Myristoyltransferase 2 in ihrer Synthese verstärkt [75, 76, 77, 78]. Als Induktoren fungieren die planaren polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffe wie das 3-Methylcholantren, Benz(a)anthracen, Benzo(a)pyren sowie zahlreiche polychlorierte oder polybromierte Biphenyle, Dibenzofurane und polychlorierte Dibenzo-p-dioxine, wobei das 2,3,7,8-Tetrachlordibenzo-p-dioxin (TCDD) extrem potent ist [79]. Im Zellinneren (s. Abbildung 6) werden die Fremdstoff-Moleküle an den Ah-Rezeptor gebunden, der wiederum an das Hitzeschock Protein Hsp90 gebunden ist. Daraufhin dissoziiert das Hsp90 vom AhR ab und der Ligand-Rezeptor-Komplex bindet an den ARNT (Ah-Rezeptor nukleärer Translokator), woraufhin ein Transport in aktivierter Form in den Zellkern stattfindet, wo der Komplex schließlich an die entsprechenden Enhancer-Elemente der DNA andockt. Durch die AhR aktivierte Gen-Batterie wird die Transkription der oben genannten Enzyme induziert. Das Ausmaß der Induktion des jeweiligen Fremdstoffes wird zusätzlich durch die Existenz von Kontrollgenen in der Nähe der exprimierenden Zonen beeinflusst, die bewirken, dass nicht jeder Induktor gleichermaßen jedes Enzym der Ah-Gen-Batterie induziert. Außerdem ist der AhR an zellspezifischer Modulation von Wachstum und Differenzierung beteiligt, indem er in entsprechende Signalkaskaden der Apoptose eingebunden ist [80]. Die zugrundeliegenden Mechanismen werden noch untersucht. Die Enzyminduktion tritt bereits nach einmaliger, jedoch wesentlich stärker nach längerfristiger Aufnahme der Fremdstoffe auf. Durch persistente Liganden [Seite 11↓]wie Dioxine kommt es wahrscheinlich zur Entgleisung dieser Homöostasefunktionen und zu toxischen Wirkungen, wie der Beschleunigung der Kanzerogenese durch Tumorpromotion. Bei Rauchern wurden signifikant höhere Mengen an CYP1A1 und CYP1B1 mRNA detektiert als bei Nichtrauchern [81].

Abbildung 6: Verlauf eines Regulationsweges

Gezeigt ist die AhR-vermittelte Regulation des CYP1A1 nach Whitlock et al. [75].

Die CYP1A Gene können auch posttranskriptionell reguliert werden. Es wurde an Rattenlebern gezeigt, dass Pyridin die Konzentration der CYP1A1/2 mRNA durch deren Stabilisierung erhöht [82]. Generell scheint die CYP1A1 mRNA weniger stabil zu sein, wie an der HepG2 Zelllinie gezeigt wurde [83]. Es wurde nachgewiesen, dass der poly(A)-Schwanz am 3’-Terminus der mRNA im Vergleich zu mRNAs anderer Cytochrom-P450-Enzyme sehr schnell deadenyliert wird. Während die CYP2E1 mRNA eine Halbwertszeit von mehr als 24 Stunden aufwies, lag die Hälfte der CYP1A1 mRNA bereits nach 2.4 Stunden im degradierten Zustand vor.

2.3.2 Cytochrom P-450 1B1

Die Cytochrom P-450 1B1 (CYP1B1) mRNA wurde in Lymphozyten, Lungen, Uterus und Leber detektiert [84, 85]. Der Expressionsstatus von CYP1B1 in adulten Leber ist sehr niedrig und lediglich drei von sechs fetalen Lebern exprimierten CYP1B1 [86]. Es zeigt eine erhöhte Expression in vielen humanen Tumoren und scheint eine wichtige Rolle in Tumorentwicklung und Progression zu spielen, da es als potentielles Target für Arzneimittel gegen Krebs, indem es gehemmt wird, sowie als Biomarker für Tumoren fungieren kann [87, 88]. Das Enzym ist verantwortlich für die Metabolisierung von 7,12-Dimethylbenz(a)anthrazen (DMBA) in die Dihydrodiol Epoxide [87]. Außerdem ist es wie alle Vertreter der CYP1-Familie am Stoffwechsel von Koffein und Theophyllin beteiligt [89].

CYP1B1 weist in Hinsicht auf die Sequenz der Nukleinsäuren und Aminosäuren etwa 40% Homologie zu den anderen Vertretern der CYP1 Subfamilie auf. Das CYP1B1 Gen ist 12 kb groß und besteht aus drei Exons und zwei Introns. Es ist auf Chromosom 2p22-21 lokalisiert [90]. Die mRNA beträgt 5.2 kb, der Leserahmen beginnt im Gegensatz zu allen anderen Cytochrom-P450-Enzyme erst im Exon 2. Insgesamt ist diese mRNA die längste aller humaner P-450 mit der [Seite 12↓]einfachsten Genstruktur [85].

Die Induzierbarkeit des Enzyms wurde noch vor der eindeutigen Identifizierung des verantwortlichen Gens erkannt. Das CYP1B1 enthält neun XRE Motive in der 5’-UTR und mindestens drei von Ihnen vermitteln die Dioxin-induzierte Transkription des Gens [90]. Das XRE an Position –833 ist essentiell für die konstitutive Expression des CYP1B1 Gens [91]. Vier regulatorische Elemente sind für die maximale Promotoraktivität notwendig [92]. Es sind die beiden in Gegenrichtung orientierten Sp1-Elemente (-84 bis -89 und -68 bis -73), eine sogenannte TATA-ähnliche Box (-34 to -29), und ein initiatorisches Motiv (-5 to +3). In Abbildung 7 sind die wichtigsten regulatorischen Elemente des Gens schematisiert.

Abbildung 7: Die regulatorischen Elemente des CYP1B1 Gens

In der 5’ flankierenden Region sind 9 XRE-Segmente vorhanden, an die die Heterodimere aus AhR und ARNT binden. INI stellt die initiatorische Einheit dar. Weitere Details sind dem Text zu entnehmen.

Das Gen wird gemeinsam mit den CYP1A1 und CYP1A2 Genen über den AhR reguliert. Der Regulationsweg ist in Abbildung 6 dargestellt.

2.3.3 Cytochrom P-450 3A4

CYP3A ist beteiligt am Metabolismus von über 50% der therapeutisch eingesetzten Medikamente [93, 94, 95]. Meistens ist das CYP3A4 in eine Kaskade von Enzymen eingebunden, die am Stoffwechsel desselben Medikaments (Tabelle 4) beteiligt sind. Es kann durch die eigenen Substrate in seiner Aktivität beeinflusst werden. Während die Inhibition des Enzyms meist durch sterische Einwirkungen des Substrats (v.a. reversibel, kompetitiv) am Protein verursacht wird, erfolgt die Induktion der Aktivität vorwiegend auf der transkriptionellen Ebene der Proteinbiosynthese. Als primärer Katalysator der Steroid-6β-Hydroxylierung spielt das CYP3A4 außerdem eine wichtige Rolle in der Steroidhormon-Homöostase [64].

Die humane Cytochrom P-450 3A Subfamilie wurde in Form eines etwa 231 kb großen Clusters auf dem Chromosom 7 am q21.1 lokalisiert und enthält vier funktionelle Mitglieder: CYP3A4, CYP3A5, CYP3A7 sowie das erst vor kurzem beschriebene CYP3A43 [96, 97, 98]. Während die ersten drei Gene in derselben Richtung gelesen werden, ist die Sequenz von CYP3A43 in gegensätzlicher Richtung auf dem Chromosom orientiert.

Alle vier Vertreter der CYP3A Subfamilie sind in ihren Aminosäuresequenzen sehr homolog. Auch die Basenhomologie der DNA ist vor allem bei CYP3A4, CYP3A5 und CYP3A7 sehr stark. Die Expressionsmuster der einzelnen Vertreter unterscheiden sich jedoch voneinander. CYP3A4 ist die am häufigstem vorkommende Isoform dieser Subfamilie in der adulten Leber und stellt insgesamt etwa 30% der Gesamtheit der hepatischen Cytochrom-P450-Enzyme dar [94, 99]. Am fetalen Stoffwechsel scheint dieses Enzym nicht beteiligt zu sein. Es wurden relativ hohe Mengen an CYP3A4 Protein im Intestinaltrakt gefunden, wo es 70% des Gesamtgehalts der Cytochrom-P450-Enzyme darstellt, und in der Niere [94, 100]. Verschiedene Gruppen haben die Expression von CYP3A4 mRNA in Leukozyten untersucht und die Berichte darüber waren zum Teil gegensätzlich [101, 102, 103, 104]. CYP3A5 wird polymorph exprimiert und konnte in 20 bis 30% der adulten Lebern nachgewiesen werden [105, 106] und wird als die hauptsächliche CYP3A Isoform in der Lunge und im Darm diskutiert [107, 108]. Wie vor kurzem nachgewiesen wurde, exprimieren lediglich 5 bis 10% der Kaukasier ein funktionstüchtiges CYP3A5 Enzym [106]. Das CYP3A7 wurde fast ausschließlich in fetalen Hepatozyten detektiert und spielt in der Biotransformation [Seite 13↓]adulter Organismen kaum eine Rolle [109]. CYP3A43 wird vor allem in der Leber, Niere und den Hoden exprimiert. Es wurde jedoch auch in anderen Geweben in niedrigen Mengen detektiert [97].

Tabelle 4: Einige Substrate von CYP3A4

Wirkstoffgruppe

Substrate

Inhibitoren

Induktoren

Andere beteiligte Enzyme

Barbiturate

Phenobarbital

 

Phenobarbital

CYP2D6

Benzodiazepine

Alprazolam

  

CYP3A5

Diazepam

  

CYP3A5, 2C8, 2B6, 2C19, UDPGT

Midazolam

Midazolam

 

CYP3A5, 3A7

Triazolam

   

Immunsuppressiva

Ciclosporin

Ciclosporin

  
 

Tacrolimus

   

Glukokortikoide

Dexamethason

Dexamethason

Dexamethason

 

Antituberkulotika

Rifampicin

 

Rifampicin

CYP2E1

Kalziumantagonisten

Diltiazem

Diltiazem

  

Nifedipin

  

CYP3A5, 3A7

Verapamil

Verapamil

 

CYP2C8, 2C9, 1A2

Statine

Cerivastatin

   

Lovastatin

   

Simvastatin

Simvastatin

  

Makrolide

Clarithromycin

Clarithromycin

  

Erythromycin

Erythromycin

  

Taxane

Docetaxel

Docetaxel

 

CYP2C8

Paclitaxel

Paclitaxel

Paclitaxel

CYP2C8

Antimykotika

 

Ketokonazol

 

FMO

Proteaseinhibitoren

Ritonavir

Ritonavir

 

CYP2D6

Indinavir

Indinavir

 

CYP2D6

Saquinavir

Saquinavir

  

Nelfinavir

Nelfinavir

 

CYP2C19

Amprenavir

Amprenavir

  

Lopinavir

   

NNRTI

Delavirdin

Delavirdin

 

CYP2D6

  

Efavirenz

 

Nevirapin

 

Nevirapin

CYP2B6

Zidovudin

   

Protonenpumpen­hemmer

Omeprazol

Omeprazol

Omeprazol

CYP2C19

Lansoprazol

Lansoprazol

Lansoprazol

CYP2C19

Xanthine

Koffein

  

1A1, 1A2

Theophyllin

  

1A1, 1A2, 2E1

Quellen: [63, 95], http://medicine.iupui.edu/flockhart, http://www.hiv-druginteractions.org/index.htm, http://www.anaesthetist.com/physiol/basics/metabol/cyp/a.htm

Die bis zu 100fachen interindividuellen Unterschiede in der katalytischen Aktivität von CYP3A4 können durch genetische Polymorphismen oder Enzyminduktion verursacht werden [110]. In letzter Zeit mehren sich Berichte über neue Mutationen [111, 112, 113]. Die meisten der bekannten Polymorphismen haben keine Auswirkungen auf die Expression bzw. Aktivität von CYP3A4. Die ein Enhancer-Element betreffende Mutation in der 5’ flankierenden Region - Allel CYP3A4*1B – wird in Zusammenhang mit gehäuftem Auftreten von Prostata Tumoren gebracht, es wurde jedoch keine funktionelle Signifikanz gezeigt [114, 115]. Eine Untersuchung von 28 Mutationen im CYP3A4 Gen bei phänotypisierten Probanden fand keine Korrelation zu geringer hepatischer CYP3A4 Expression bzw. Enzymaktivität in vivo [116].

Das Gen wird über verschiedene Hormone transkriptionell reguliert, einschließlich der Glukokortikoide, Wachstumshormone und Triiodothyronin sowie über Arzneimittel wie Phenobarbital, Clotrimazol, Mifepriston (RU486) und Rifampicin (Tabelle 4). Der Signalweg der [Seite 14↓]Induktion ähnelt vom Prinzip dem der AhR vermittelten Aktivierung (Abbildung 6). Rifampicin ist bekannt als einer der stärksten Induktoren der CYP3A4 Expression sowohl in vivo als auch in kultivierten Hepatozyten [117, 118, 119, 120]. Die bis zu vierfache Induktion der CYP3A4 Expression durch Rifampicin oder andere Xenobiotika ist die Ursache vieler bekannter Arzneimittelwechselwirkungen und ist von beträchtlicher Bedeutung für Patienten, die einer Kombinationstherapie unterliegen, wie zum Beispiel bei HIV/AIDS.

Abbildung 8: Organisation der pharmakologisch bedeutsamen regulatorischen Segmente des CYP3A4 Gens

XREMs stellen Elemente dar, die auf die Xenobiotika ansprechen, DR-3 sind Sequenzen mit direkten Wiederholungen, unterbrochen durch 3 Basen, während ER-6 die umgekehrten Wieder­holungen, unterbrochen durch 6 Basen, darstellen. Die Abbildung wurde entnommen und ergänzt aus Sueyoshi und Negishi [121].

Der proximale Promotor des CYP3A4 Gens (Basen –172 bis –149) enthält zwei Kopien der AG(G/T)TCA Hexamere, der Erkennungssequenz für die Familie des Pregnan-X-Rezeptors der Transkriptionsfaktoren [122]. Ein distaler CYP3A4 Enhancer, der ca. –7.8 kbp vom Transkriptions­start entfernt liegt, enthält drei Erkennungselemente (dNR1, dNR2, dNR3), die das hPXR-RXR-α Heterodimer binden können, zusätzlich zu zwei cis-aktiven Elementen (FP1 und FP2) stromaufwärts der letzten PXR-bindenden Regionen, die essentiell für volle Transaktivierung durch Rifampicin sind [123]. Die Organisation der regulatorischen Einheit des CYP3A4 Gens ist in Abbildung 8 dargestellt.

Der Pregnan-X-Rezeptor (PXR, auch NR112, SXR oder PAR genannt) besteht aus einer Ligand bindenden Domäne mit lipophilem Charakter und einer DNA bindenden Domäne. Der Rezeptor wird über endogene und exogene Liganden aktiviert (Abbildung 7). Weitere Liganden des Rezeptors sind: natürlich vorkommende Steroide wie Pregnenolon und Progesteron, synthetisches Glukokortikoid, Taxol, Hyperforin, Phenobarbital [124, 125, 126]. Kürzlich wurde das Spektrum der PXR-Liganden um die Litocholsäure erweitert, die zu den Gallensäuren gehört, als hepatotoxisch gilt und über die CYP3A Enzyme hydroxyliert wird. Somit trägt die PXR vermittelte Induktion des Enzyms zu einer schnelleren Entgiftung des Körpers bei [127, 128].

Wie in Untersuchungen mit CYP3A4 Reportergen-Konstrukten gezeigt wurde, ist das Heterodimer aus PXR und RXR (Retinoid-X-Rezeptor) essentiell für die transkriptionelle Aktivierung durch Pregnane [129]. In Abwesenheit der Steroide liegt der zelluläre Rezeptor als Monomer vor und ist assoziiert mit einem Hitzeschockprotein-Komplex. Erst die dimerisierte Ligand-Rezeptor Einheit kann in den Zellkern befördert werden. Daraufhin wird mit dem Retinoid-X-Rezeptor ein hPXR-RXRα Heterodimer gebildet, der wiederum mit Transkriptionsfaktoren vor dem CYP3A4 interagiert, wodurch eine Induktion der Genexpression ausgelöst wird. Die Aktivierung des PXR Rezeptors ist speziesabhängig, was auch die unterschiedliche Induzierbarkeit des Menschen und der Maus erklärt [129]. 1996 wurde beschrieben, dass die CYP3A4 Expression mit der vom MDR1 Gen, welches für das P-Glykoprotein kodiert, koordiniert sein muss [130]. Neuere Erkenntnisse belegen, dass PXR für die Verstärkung der transkriptionellen Aktivierung beider Gene zuständig ist [125]. Das PXR Gen ist selbst induzierbar, seine Induktoren sind die von CYP3A4 (Tabelle 4). Für [Seite 15↓]Dexamethason, Clofibrat und Isoniazid wurde eine deutliche Aktivierung der PXR-Expression in Ratten beschrieben [131].

Abbildung 9: Liganden des Pregnan-X-Rezeptors und des Konstitutiven Androstan Rezeptors

Entnommen aus Willson et al. [126].

Neben dem PXR spielt bei der CYP3A4 Aktivierung auch der Glukokortikoid-Rezeptors (GR, auch NR3C1) eine Rolle. Dexamethason ist ein bekannter Ligand des Rezeptors und bindet an das Heterodimer aus GR und hsp90. Anschließend dissoziiert das Hitzeschockprotein ab und der Ligand-Rezeptor-Komplex wird in den Nukleus transportiert, wo der Rezeptor die Transkription passender Gene auslösen kann. Klassische Gene, die eine GRE Sequenz besitzen, sind die Tyrosin-Aminotransferase oder das Säuger Tumor Virus MMTV [132]. Im Fall von CYP3A4, ist der GR nicht obligatorisch für die Regulation des Gens [133].

Der konstitutive Androstan Rezeptor (CAR, NR1_13) spielt ebenfalls eine Rolle in der transkriptionellen Aktivierung der CYP3A Gene. Eigentlich kontrolliert dieser Rezeptor die Expression der Alkohol-Dehydrogenase-3 Gene, wo er in Abwesenheit von Liganden transkriptionell aktiv ist. Die Bindung der Liganden (z. B. Androstenol) führt zur Suppression der Transkription [134]. Er liegt in angereicherter Form in der Leber vor, ist strukturell verwandt mit [Seite 16↓]dem PXR und bildet im Fall der CYP3A4 Regulation ein Heterodimer mit dem RXR [135, 136]. CAR wird, ähnlich wie GR, erst nach der Bindung des Liganden in den Nukleus transportiert [137]. Über diesen Signalweg wurde eine bis zu 13fache Induktion beobachtet. Die CAR-RXR Heterodimere binden an die ER6 Elemente im CYP3A4 Promotor. Die Induktion der CAR mRNA durch Glukokortikoide wie Dexamethason kann die transkriptionelle Aktivierung von CYP3A4 unterstützen [135]. Es kann von funktionellen Überkreuzungen aller drei Mechanismen (GR-, PXR- und CAR- vermittelte Induktion) der Initiation der Transkription ausgegangen werden.

Über den PXR-Signalweg werden neben CYP3A4 und MDR1 weitere Gene reguliert: CYP3A5, CYP3A7, CYP2C8 und CYP2B [123, 125, 138]. Die Expression des konjugierenden Enzym des Phase II Metabolismus Dehydroepiandrosteron-Sulfotransferase wird ebenfalls über den PXR-Signalweg reguliert [139].

Die CYP3A Gene können auch posttranskriptionell reguliert werden. Zanger und Mitarbeiter zeigten 1997, dass das häufig verwendete Lösungsmittel Dimethylsulfoxid die Proteinmenge der CYP3A und CYP2E1 Enzyme erhöht, was auf einen posttranskriptionellen Mechanismus zurückgeführt werden konnte [140]. Dieselbe Arbeitsgruppe bewies ein Jahr später, dass das DMSO die Degradation der betroffenen Proteine hemmt und deren Aktivität fördert [141]. Eine weitere posttranskriptionelle Regulation wurde für die Aktivierung durch die Makrolid­antibiotika Triacetyloleandomycin, Clotrimazol und Erythromycin beschrieben, die entweder über mRNA- oder Protein-Stabilisierung erfolgen könnte [142, 143].

2.4 P-Glykoprotein

Die Superfamilie der ATP-bindenden Transporter, zu der das P-Glykoprotein (MDR1) gehört, enthält membranständige Proteine, die eine Vielzahl der Substrate über extra- und intrazellulären Membranen befördern. Die Mitglieder werden nach ihrer Sequenzhomologie in der Nukleotid-bindenden Domäne und den phylogenetischen Analysen in verschiedene Subfamilien unterteilt: ABCA bis ABCG. Die ABCA-Subfamilie (ABC1) besteht aus 12 Transportern, die wiederum aufgrund der Homologien in intronischen Bereichen in zwei weitere Subgruppen unterteilt werden. Diese Proteine werden in allen Eukaryoten mit Ausnahme der Hefen synthetisiert. Die beiden größten Vertreter der ABC-Familie, ABCA1 und ABCA4 wurden intensiv untersucht und sind für den Cholesterol- bzw. Vitamin A-Transport zuständig. Die ABCB-Subfamilie ist für die Säuger charakteristisch und enthält 4 sogenannte volle Transporter sowie 7 Halb-Transporter, welche über Heterodimerbildung mit einem anderen Mitglied der Familie (z.B. ABC2 und ABC3) ihre Funktionalität erhalten. Das in der vorliegenden Arbeit untersuchte ABCB1 (PGY1, im folgenden MDR1 genannt) ist ein vollständiger Transporter, wurde am Genlokus q21.1 des Chromosom 7 kartiert und besteht aus 28 Exons mit einer 4.5-kb-mRNA [144]. Das Protein ist 170 kDa groß und besteht aus zwei Hälften, wovon jede eine hydrophobe transmembranäre Region besitzt sowie eine Domäne, die ein Nukleotid binden kann. Beide Hälften bestehen aus der gleichen Anzahl an Exons und man nimmt an, dass das gesamte Gen aus einer Fusion zwei verwandter Gene entstanden ist, die jedoch für selbständig funktionierender Proteine kodierten [144]. Seine Funktion liegt im Export der Substanzen mit überwiegend lipophilen, neutralen bis kationischen Eigenschaften vom Inneren der Zelle und von den Membranen nach Außen durch den sogenannten flip-flop Mechanismus [145]. Etwa 30% aller Arzneimittel werden über MDR1 transportiert. Das System wird für das Therapieversagen während und nach der Krebsbehandlung durch Chemotherapie verantwortlich gemacht, wobei die Überexpression des Gens in Tumorzellen einen wichtigen Faktor darstellt [146]. Diese sogenannte Multidrug-Resistenz ist verantwortlich für etwa 50% der Therapieversager der Chemotherapie.

Die physiologische Funktion des MDR1 in der Abwesenheit der Therapeutika oder Toxine ist noch nicht vollständig geklärt. Studien an MDR1A knock out Mäusen haben gezeigt, dass die Tiere normale Lebensfähigkeit, Fertilität sowie biochemische und immunologische Parameter aufweisen [147]. Neuere Erkenntnisse zeigen auch eine Beteiligung von MDR1 an der Apoptose, dem programmierten Zelltod [148]. Außerdem wird angenommen, dass im Falle eines genetisch bedingten Defekt am ABCA1 Genprodukt, welches zum Fettstoffwechsel wesentlich beiträgt, unter anderem das MDR1 Gen aktiviert wird und den Transport von Cholesterol und Phospholipiden übernimmt [149]. Das MDR1 zeichnet sich durch eine sehr breite Substratspezifität aus (Tabelle 5). Viele der CYP3A4 Substrate bzw. ihrer Metabolite werden durch das MDR1 aus der Zelle herausbefördert, wie es am Beispiel von Indinavir gezeigt wurde [150]. Im Gastrointestinaltrakt bewirken P-Glykoproteine eine Absorptionshemmung durch Zurückpumpen von Pharmaka in das Darmlumen. In der Leber führt MDR1 zu einer verstärkten Elimination in die Galle, außerdem wird die renale Elimination gefördert. MDR1 wirkt im Bereich der Blut-Hirn-Schranke einer [Seite 17↓]intrazerebralen Penetration von Substanzen entgegen [151]. Es kann induziert oder inhibiert (z. B. durch Ciclosporin A, Verapamil, Chinidin, Saquinavir, Ritonavir) werden.

Tabelle 5: Substrate des MDR1 Transporters

Wirkstoffgruppe

Substrate

Lit.

Steroid-Hormone

ß-Östradiol
Hydrocortison
Prednisolon

[152, 153]

Antiöstrogene

Tamoxifen
Clomifen

[152]

Neuropeptide

Neurokinin
Substanz P
Endomorphin 1 und 2

[154]

Zytostatika

Taxol

[155]

Kalziumantagonisten

Verapamil
Mibefradil

[156, 157]

Azol-Fungostatika

Ketokonazol
Intrakonazol

[158, 159]

Makrolid-Antibiotika

Erythromycin

[160]

Immunsuppressiva

Ciclosporin
Tacrolimus

[161, 162]

Antiepileptika

Phenobarbital
Lamotrigin

[163]

Antiarrhythmika

Digoxin
Amiodaron

[164]

HIV-Proteaseinhibitoren

Indinavir
Ritonavir
Saquinavir

[33]

Das P-Glykoprotein ist ubiquitär vorhanden mit vorwiegender Expression in der Darmschleimhaut [165], aber auch in den meisten Zellpopulationen des peripheren Blutes. T- und B-Lymphozyten sowie Monozyten/Makrophagen exprimieren MDR1 [166, 167, 168, 169]; es sind die Zellen, die als Targets für HIV-1 Infektionen dienen. Eine in den einzelnen Subpopulationen variierende MDR1 Expression könnte die Resistenz einiger Patienten gegenüber den Proteasehemmern erklären. Untersuchungen an CD4+ und CD8+ Zellen von 16 AIDS Patienten haben gezeigt, dass die MDR1 Expression im Verlauf der Erkrankung zunimmt, gleichzeitig aber die Funktionalität abnimmt [170].

Das MDR1 Gen wird wie das CYP3A4 durch verschiedene Xenobiotika über den PXR-Signalweg reguliert. Im Promotorbereich des Gens sind mehrere Transkriptionsfaktoren (Abbildung 10) zu finden, die zum einen für die basale Expression verantwortlich sind und zum anderen die Genexpression sowohl positiv als auch negativ regulieren können. So befindet sich zwischen –82 und –73 b eine zur Y-box der Histokompatibilität Komplexe der Klasse II (MHCII Gene) homologe Sequenz, die für eine vollständige Funktionalität des MDR1 notwendig ist [171]. Bei – 8 kb wurde ein regulatorisches Cluster gefunden, das Elemente beinhaltet, die eine Induktion via PXR ermöglichen. Aus diesem Bereich ist vor allem ein DR4 Motiv für eine RIF bedingte Induktion erforderlich, da dort der PXR bindet [172]. Wie durch in vitro Untersuchungen gezeigt wurde, interagiert das MEF1 Protein (MDR1-promoter enhancing factor 1) mit dem 5’-GTCAATCC Element des MDR1 Promotors und verstärkt die Expression des Gens [173]. Dieser Aspekt scheint in der Tumorgenese eine Rolle zu spielen.


[Seite 18↓]

Abbildung 10: Organisation der regulatorischen Einheit des MDR1 Gens

Es sind die Erkennungssegmente für Transkriptionsfaktoren in der nicht translatierten Region am 5’ Terminus des Gens dargestellt. Für die Pharmakologie ist vor allem das SXR-Element von Bedeutung, hier bindet das Heterodimer aus hPXR und RXRα.Die Abbildung wurde entnommen aus Labialle et. al. [174]

Das MDR1 wird polymorph exprimiert, was einen Einfluss auf die Bioverfügbarkeit vieler Arzneistoffe haben kann [165, 175, 176, 177, 178, 179]. Zur Zeit sind 15 verschiedene MDR1 Allele bekannt, die z.T. ethnisch verschieden exprimiert werden [178, 179]. Die meisten der bis jetzt bekannten Mutationen liegen in Intronen oder sind stumm, d.h. ohne Aminosäureaustausch als Folge. Drei bekannte Mutationen verändern die Proteinsequenz [175]. Eine stumme Mutation im Exon 26 (C3435T) konnte mit einer verminderten Transportfunktion in Verbindung gebracht werden [177]. Dieselbe Mutation wird hinsichtlich eines veränderten Ansprechens auf die Virustatika diskutiert [180]. Hierbei scheint das T-Allel mit einem erhöhten Anstieg an CD4 Zellen zusammenzuhängen, was für die homozygoten Träger des mutierten Allels einen Vorteil in der HIV-Therapie bringt. Ausgerechnet dieser Polymorphismus tritt häufiger bei den Kaukasiern (T/T: 71 - 74%) denn in der Afrikanischen Population auf (T/T: 27 - 39%) [177, 178].

2.5 Alprazolam: Wirkung und Stoffwechsel

Alprazolam (8-Chlor-1-methyl-6-phenyl-4H-1,2,4-triazolol[4,3-a][1,4]benzodiazepin, ALZ) ist ein Benzodiazepinderivat, das seine Verwendung vorwiegend als Tranquilizer findet.

Die Benzodiazepine bilden die zur Zeit wichtigste Gruppe innerhalb der Tranquilizer. Die meisten Substanzen leiten sich von Diazepam (C16H13ClN2O) bzw. dessen Metaboliten ab, wobei der intakte Siebenring für die Entfaltung der Wirkung notwendig ist. Außerdem ist die Lactam-Struktur von Bedeutung. Bei Alprazolam (C17H13ClN4) wurde ein zusätzlicher Ring eingeführt, der sich in einer veränderten Pharmakokinetik widerspiegelt.

Alprazolam wird über das Cytochrom P-450 3A zu dem Hauptmetabolit α-Hydroxy-Alprazolam und dem 4-Hydroxy-Alprazolam (Abbildung 11) oxidiert [181, 182, 183]. Neuere, auf in vitro Versuchen mit rekombinanten CYP Isoenzymen basierende Erkenntnisse deuten auf eine Beteiligung des CYP3A5 Enzyms bei der Verstoffwechslung zu α- bzw. 4-Hydroxy-Alprazolam hin. Zudem wurde in vivo festgestellt, dass die intrinsische Clearance für die α-Hydroxylierung von Alprazolam dreifach höher für CYP3A5 als für CYP3A4 ist [184]. Beide Metabolite weisen eine geringere Affinität zu den Benzodiazepin Rezeptoren als die Muttersubstanz auf. Die Metabolite werden nach der Oxidierung glukuronidiert, so dass die Plasmaspiegel der unkonjugierten Form weniger als 10% des Alprazolam betragen [181]. Zur Zeit sind keine anderen Cytochrom-P450-Enzyme bekannt, die am Stoffwechsel von Alprazolam beteiligt sein könnten [185, 186].

Es wurde eine strenge Korrelation zwischen den kinetischen Parametern von Alprazolam, nämlich der Fläche unter der Kurve und den Plasmaspiegeln 6, 8, 10 und 24h nach der Einnahme gezeigt. Dieses ermöglicht eine Bestimmung der CYP3A Aktivität in vivo über Messung der Alprazolam-Blutkonzentrationen 10h nach oraler Einnahme von 1 mg [187].


[Seite 19↓]

Abbildung 11: Biotransformation von Alprazolam

Es sind die Muttersubstanz sowie die Metabolite dargestellt [188].

Die typischen Inhibitoren des CYP3A4, wie Ketokonazol oder Itrakonazol, haben einen hemmenden Einfluss auf die Pharmakokinetik von Alprazolam [189]. Entsprechend können die CYP3A4 Induktoren den Alprazolam-Metabolismus beschleunigen und die Plasmaspiegel des Medikamentes reduzieren [190]. Auf diese Weise können die induktiven Effekte von Rifampicin auf die CYP3A Aktivität untersucht werden und mit der Induktion der mRNA Expression verglichen werden. In der vorliegenden Arbeit wurde Alprazolam als Testsubstanz für die in vivo Messung der Aktivität von CYP3A mittels HPLC herangezogen.

2.6 Aufgabenstellung der Arbeit

Eine Klärung der induktiven Vorgänge, die durch die antiretrovirale Therapie ausgelöst werden, könnte zur vereinfachten Voraussage bzw. Verhinderung der Resistenzentwicklung sowie der Nebenwirkungen beitragen. Außerdem ist es sinnvoll zu erläutern, welche Systeme inwiefern durch ein und dasselbe Arzneimittel induziert werden können. In dieser Arbeit werden zwei Wege der Regulation untersucht: zum einen die Regulation der Transkription der Vertreter der Familie CYP1 über den aromatischen Kohlenwasserstoff-Rezeptor und zum anderen die Aktivierung der CYP3A Gene und des MDR1 Transporters über den Pregnan-X-Rezeptor.

Ob die Wirkung von antiretroviralen Mitteln durch Enzym- bzw. MDR1-Induktion oder durch genetischen Polymorphismus im einzelnen klinisch relevant behindert wird, ist noch unklar. Eine eventuelle Auswirkung der Induktion der Virustatika auf den Therapieerfolg von anderen (Begleit‑)Erkrankungen soll diskutiert werden.

Neben den Untersuchungen zum induktiven Potential der Virustatika sollen die molekularen Mechanismen der interindividuellen Variabilität im Arzneistoffwechsel von CYP3A4 geprüft werden. Hierzu wurde eine Studie mit 100 gesunden Probanden durchgeführt. Die Teilnehmer bekamen Rifampicin verabreicht, um die Synthese von CYP3A4 steigern. Als gute Testprobe für HPLC-Untersuchungen zur Aktivitätsbestimmung der CYP3A Enzyme hat sich Alprazolam erwiesen [187] und wurde den Probanden sowohl vor als auch nach der fünftägigen Rifampicin-Induktion verabreicht. Die mRNA Konzentrationen in mononukleären Zellen des peripheren Blutes sollen mit den pharmakokinetischen Parametern von Alprazolam verglichen werden. Außerdem sollen bekannte CYP3A4 Mutationen durch die Korrelation mit der Enzymaktivität sowie der Enzymexpression auf ihre Funktionalität überprüft werden.

Die Zielstellungen der Arbeit sind die Untersuchungen zur Enzym- und MDR1-Induktion durch HIV-Virustatika und zur Expression von CYP3A Isoenzymen in Lymphozyten sowie die Korrelation mit der Enzymaktivität und bekannten Genotypen. Unter dem methodischen Aspekt, sollen verschiedene RT-PCR Verfahren entwickelt und angewandt werden.


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20.10.2004