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4  Methoden

4.1 Zellkultivierung

Die Zellen wurden in flüssigem Stickstoff bei etwa –170 °C gelagert und nach Bedarf unter der Sicherheitswerkbank aufgetaut. Es wurden etwa 1 x 107 Zellen pro 260 ml Kulturflasche kultiviert, indem sie in 15 ml Medium (s. Tabelle 12) aufgenommen wurden. Dem Medium wurde Kälberserum zugesetzt, das Wachstumsfaktoren enthält, sowie die Antibiotika Penicillin und Streptomycin. Alle benötigten Medien und Lösungen wurden vor Gebrauch auf 37 °C vorgewärmt. Die Zellen wurden in wassergesättigter Atmosphäre bei konstant 37 °C und 5 % CO2 im Brutschrank kultiviert. Kurz vor dem Erreichen der Konfluenz, d.h. wenn fast die gesamte Oberfläche mit den Zellen bedeckt war, wurden die Zellen subkultiviert, indem sie zunächst mit PBS mehrmals gewaschen, um anschließend mit einer Trypsin-EDTA Lösung vom Flaschenboden gelöst zu werden.

Tabelle 12: Wachstumscharakteristika der Zellkulturen

Zelllinie

Verdopplungszeit

Medium

Serum

HeLa

48 h

DME Medium mit Glutamin

10 % Kälberserum

HepG2

50 h

RPMI 1640 Medium

10 bzw. 5 % Kälberserum

Caco-2

80 h

DME Medium mit Glutamin

20 % Kälberserum

COLO-320

38 h

RPMI 1640 Medium

10 bzw. 5 % Kälberserum

Die Testlösungen wurden in Verdünnungsreihen in Methanol angesetzt. Für die Inkubations­versuche wurden Zellkulturplatten mit 6 Kavitäten verwendet. Je 100 µl der Testlösung wurden auf die Kavitäten pipettiert und ca. 20 min bei Raumtemperatur inkubiert, bis das Lösungsmittel vollständig verdampft war. In der Zwischenzeit wurden die Zellen geerntet und in 2.5 ml PBS pro Flasche aufgenommen. Die Zellen wurden vereint und leicht gemischt. Je 0.5 ml Zellen wurden auf die Substanzen verteilt und auf ein Gesamtvolumen von 2 ml mit Medium vermischt. Ausgehend von der Konfluenz waren stets etwa 1 Million Zellen pro Kavität vorhanden.

Die Zellen wurden 20 Stunden im Brutschrank bei 37 °C inkubiert, wobei die Platten nach einer Stunde nochmals geschwenkt wurden, um eine vollständige Lösung der Testsubstanzen im Medium zu gewährleisten. Ein Kontrollansatz aus Medium und Testlösung wurde mitgeführt und die Löslichkeit der Substanzen im Versuchsansatz spektralphotometrisch geprüft.

Die Medikamente wurden als Reinsubstanzen verwendet (s. 3.1), mit Ausnahme von Kaletra und Efavirenz (Sustiva), die nur in Form von Weichkapseln zur Verfügung standen. Folgende Arzneimittel wurden in den angegebenen Konzentrationen benutzt:

Substanz

Konzentration minimale

[µg/Kavität] maximale

Tagesdosis [µg]

Rifampicin

40

400

60

Abacavir

40

400

60

Didanosin

12.5

125

20

Lamivudin

0.25

250

15

Stavudin

0.25

250

8

Zalcitabin

0.25

250

0.23

Zidovudin

0.25

400

50

Delavirdin

80

800

120

Efavirenz

8

80

60

Nevirapin

40

400

40

Amprenavir

80

800

240

Indinavir

80

1600

240

Kaletra

10

100

240

Nelfinavir

0.8

1600

225

Ritonavir

20

1600

120

Saquinavir

0.8

450

360

Die errechneten Tagesdosen bezogen sich auf das Verteilungsvolumen in der Zellkultur (2.5 ml) und wurden von bekannten Tagesdosen heruntergerechnet, ausgehend von einem [Seite 25↓]durchschnittlichen Verteilungsvolumen des Menschen von 20 Liter (Anteil der extrazellulären Flüssigkeit im Körper).

Bei den Inkubationsversuchen der Zellkulturen über 40 und 72 Stunden wurden die Substanzen auf separaten Platten in den entsprechenden Konzentration vorbereitet, mit Medium gemischt und auf die zuvor mit PBS gewaschenen adhärenten Zellen gegeben.

Nach der Inkubationszeit wurde in einem Festphasenverfahren aus den Zellen Gesamt-RNA gewonnen.

4.2 Durchführung der Studie

In die Studie zur Untersuchung der CYP3A Aktivität wurden 102 gesunde Probanden (67 männlich, 35 weiblich) eingeschlossen1. Alle Teilnehmer waren Nichtraucher im Durchschnittsalter von 28 Jahren (± 7) und mit einem mittleren Gewicht von 77 kg (± 11 kg). Bei den Frauen war die Einnahme oraler Kontrazeptiva ausgeschlossen und die Teilnehmerinnen begannen mit der Studie am zweiten und dritten Tag des monatlichen Regelzyklus. Die Studie wurde von der Ethik-Kommission der Charité geprüft und genehmigt.

Am Abend des ersten Tages (22:30 Uhr) erhielten die Probanden 1 mg Alprazolam (Tafil®) oral verabreicht und 10 Stunden später wurden Vollblutproben sowohl für die Untersuchung der kinetischen Parameter als auch für die mRNA Messungen entnommen (je 8 ml). Die letzte Mahlzeit des Tages konnte bis spätestens 90 min vor Verabreichen des Alprazolam eingenommen werden. Vom zweiten Tag an bekamen die Probanden 5 Tage lang 450 mg Rifampicin (Eremfat®) täglich oral verabreicht (am Tag 2 um 18:30, Tage 3 bis 6 um 8:30). Am sechsten Tag wurde eine zweite Dosis ALZ (1 mg) um 22:30 gegeben. 10 Stunden später wurde wieder Vollblut entnommen.

Für die mRNA Messungen wurde das Vollblut mit dem Vacutainer cpt System entnommen. Direkt im Anschluss wurden die Leukozyten nach Anweisungen des Herstellers in mehreren Zentrifugationsschritten isoliert und bis zur RNA-Präparation bei –80 °C tiefgefroren.

4.3 Zytotoxizitätstest

Zur Überprüfung des zytotoxischen Potentials der verwendeten Substanzen wurde der Laktat-Dehydrogenase-Verfahren (LDH) angewandt. Dieser Test greift die Membranintegrität der Zellen nach Behandlung mit Arzneimitteln auf und basiert auf der Bestimmung der LDH-Aktivität im Kulturüberstand. Das im Zytoplasma lokalisierte Enzym gelang im Fall einer Beschädigung der Zellmembran in den Kulturüberstand, wo es kolorimetrisch detektiert wurde. Dabei war die Menge an freigesetztem LDH proportional zu der Zahl der beschädigten oder lysierten Zellen.

Die LDH-Aktivität wird über die enzymatische Umsetzung von Laktat zu Pyruvat erfasst. Das dabei entstehende NADH H+ wird zur Reduktion eines Tetrazoliumsalzes zu Formazan genutzt. Diese Reaktion wird in einem Lesegerät bei 490 nm gegen Referenzwellenlänge von 630 nm gemessen.

Die Zellen wurden wie unter 4.1 beschrieben in Mikrotiterplatte ausgesät, die Inkubation mit den Arzneimitteln erfolgte in DMEM mit 1% FKS, um den hohen LDH-Hintergrund des Serums zu minimieren. Je 50 µl der zellfreien Überstände wurden in eine frische Mikrotiterplatte überführt, mit 50 µl Reaktionsgemisch versetzt und zur Farbentwicklung 30 min lichtgeschützt inkubiert. Die Indikatorreaktion wurde durch Zugabe von 10 µl HCl 1 N pro Kavität gestoppt und gemessen. Hintergrundkontrolle bildete das Medium. Als Negativkontrolle dienten unbehandelte Zellen, während die maximale Menge an LDH im Überstand durch die Lyse von Zellen mit 1% Triton gemessen wurde. Um einen Einfluss der Testsubstanzen auf die LDH-Aktivität auszuschließen, wurden diese direkt im Medium verdünnt und getestet.

Berechnung (alle Werte abzüglich Hintergrund):


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Einen weiterer Hinweis für die Zytotoxizität der Substanzen stellte die erreichte RNA-Ausbeute dar. Da man immer vergleichbare Zellzahl in die Inkubationsversuche eingesetzt hat, sollte die RNA-Ausbeute in einem annähernd gleichgewichtigem Verhältnis stehen.

4.4 Methoden zur Analyse der mRNA

In der vorliegenden Arbeit wurden die mRNA-Konzentrationen von CYP1A1, CYP1B1, CYP3A4 und MDR1 mittels der Reversen Transkription Polymerase Ketten Reaktion (RT-PCR) bestimmt. Hierfür mussten zunächst die Verfahren etabliert werden. Bei den Genen für CYP1A1 und CYP1B1 wurde eine RT-PCR in zwei Schritten in PCR-Maschinen durchgeführt, während die anschließende Detektion in einer Kapillarelektrophorese am ABIPrism™310 Gerät erfolgte. Für die CYP3A4 und MDR1 mRNA wurde eine Echtzeit RT-PCR, ebenfalls in zwei Schritten, am LightCycler™ etabliert. Im folgenden wird auch auf die Extraktionsmethodik der Gesamt RNA näher eingegangen. Da verschiedene Zellsysteme benutzt wurden, wurden unterschiedliche Methoden zur RNA Isolation angewandt.

4.4.1 Extraktionsverfahren zur Gewinnung von RNA

Vor den Arbeiten mit RNA wurden die Arbeitsflächen mit RNase AWAY gereinigt. Für alle Lösungen wurde RNase freies Wasser benutzt, das zuvor mit Diethylpyrocarbonat angesetzt wurde. Alle Präparationen erfolgten mit sterilen, gefilterten, RNase freien Pipettenspitzen, um eventuellen Kontaminationen vorzubeugen.

4.4.1.1 Extraktion der zellulären RNA aus Zellkulturen

Die zelluläre RNA wurde in einem Festphasenverfahren mittels des SNAP™ Total RNA Extraktion Kit gewonnen. Die Arbeitsschritte wurden entsprechend der Anleitung des Herstellers durchgeführt, wobei der Prozedur ein DNase-Verdau angeschlossen wurde, um eventuelle Verunreinigungen mit genomischer DNA zu beseitigen. Die gewonnene RNA wurde photometrisch auf ihre Reinheit und Konzentration überprüft und bei –80 °C eingefroren.

Es wurden Stichproben der RNA Proben entnommen und 5 µl in einem 1 %-Agarosegel elektrophoretisch getrennt, wodurch die 18S und 28S rRNA-Banden sichtbar wurden. Bei eventuellen Verunreinigungen mit genomischer DNA müsste diese im hochmolekularen Bereich sichtbar sein während Proteine an den Taschen des Gels zu finden wären. Degradierte RNA würde man am Muster erkennen, da die beiden rRNA-Banden sich durch eine Degradierung zu einem Schmier vereinen würden.

4.4.1.2 Extraktion der zellulären RNA aus Leukozyten

Die Leukozyten wurden aus 8 ml Frischblut extrahiert, das zuvor in das Vacutainer®cpt System entnommen wurde. In mehreren Zentrifugationsschritten wurden die Leukozyten von Erythrozyten separiert und mit PBS Puffer gewaschen. Anschließend wurden die Proben bei -80 °C gelagert.

Die zelluläre RNA wurde mit Hilfe der vorgefertigten Lösung TRIzol™ LS nach Anleitung des Herstellers gewonnen. Hierbei handelt es sich um eine Modifizierung des klassischen Phenol-Chloroform Verfahrens zur RNA Extraktion nach Chomczynski und Sacchi [191]. Die Prozedur wurde modifiziert durch Zugabe von 10 ng des RNase freien Glykogens vor der Homogenisierung der Leukozyten. Die RNA Lösung wurde einer 15-minutigen Inkubation mit jeweils 10 U RNase freien RQ1 DNase bei 37 °C unterzogen. Nach der Extraktion wurde die RNA-Ausbeute und Reinheit im Photometer ermittelt. Schließlich wurden die Proben bei –80 °C eingefroren.

4.4.1.3 Gewinnung der zellulären RNA aus Leberproben

Für die Etablierung der RT-PCR Methode zur Quantifizierung von CYP3A4 mRNA in Leukozyten wurden humane Leberfragmente als Positivkontrolle für starke Expression herangezogen. Drei humane Leberproben wurden vom Institute for the Advancement of Medicine (Exton, PA, USA) bezogen. Die kleinen Leberfragmente wurden durch Homogenisieren zerstückelt. Anschließend wurde das gewonnene Homogenat zur RNA-Isolierung mittels TRIzol™ genützt.

4.4.2 Bestimmung der RNA-Konzentration

Zur photometrischen Bestimmung der Konzentration wurden je 50 µl der Proben-RNA entnommen und in der UVette gegen RNase freies Wasser als Leerwert gemessen. Die gemessene RNA [Seite 27↓]konnte wiederverwendet werden.

Die Konzentration der gewonnenen RNA wurde über die optische Dichte wie folgt bestimmt:

Die Zahl 40 stellt einen RNA-spezifischen Faktor dar, der einer Lösung mit optischer Dichte von 1 entspricht, die ungefähr 40 ng/µl RNA enthält.

Der Quotient aus der optischen Dichte bei 260 und 280 nm ist ein Maß für die Verunreinigung durch Proteine. Der Wert sollte größer als 1.5 sein, so dass nur RNA gleichmäßiger Reinheit in den Versuchen eingesetzt wird. Alle Proben wurden auf 25 ng/µl eingestellt, portioniert und bei –80 °C gelagert.

4.4.3 Reverse Transkription - Polymerase Ketten Reaktion

Die Regulation der Genexpression kann über Bestimmung der mRNA Konzentrationen überprüft werden. Zur Zeit werden vorwiegend fünf folgende Methoden genützt: Northern Blotting [192], in situ Hybridisierung [193], RNase protection Verfahren [194], cDNA Arrays [195] und Reverse Transkription - Polymerase Ketten Reaktion (RT-PCR) [196]. Die Analysen mittels Northern Blotting geben Informationen über mRNA Größe, alternatives Spleißen und die Integrität der RNA Proben. Die RNase protection Verfahren werden benutzt, um die Transkriptionsinitiation und Termination sowie Intron/Exon Banden zu kartieren. Die Technik der in situ Hybridisierung ist sehr komplex, allerdings erlaubt sie als einzige die Bestimmung der Lokalisierung der Transkripte in bestimmten Zellen eines Gewebes. Die sensitivste all dieser Methoden ist die RT-PCR, die eine Bestimmung geringster Mengen von Transkripten ermöglicht und Vergleiche in verschiedenen Populationen von Proben zulässt.

In der vorliegenden Arbeit wurden die Mengen der mRNA mittels der quantitativen RT-PCR untersucht. Es wurden zwei verschiedene Möglichkeiten der Quantifizierung über die PCR genutzt: die kompetitive RT-PCR sowie die Echtzeit RT-PCR.

4.4.3.1 CYP1A1 RT-PCR

Bei der quantitativen RT-PCR zur Bestimmung der CYP1A1 mRNA Menge handelt es sich um ein auf kompetitiver Verdrängung basierendes Verfahren, in dem die Proben-RNA gemeinsam mit einer definierten Menge sequenzgleicher Standardmoleküle vervielfältigt wird. Die Primer zur Amplifizierung der cDNA wurden so gewählt, dass sie das Intron 6 umspannen, um eine eventuelle Kontamination mit genomischer DNA aus der Auswertung ausschließen zu können. Die Primer 1A1-1 und 1A1-2 (Tabelle 10) ergaben ein Fragment von 177 bp. Die Standardmoleküle waren 17 Basen länger als die CYP1A1 mRNA und somit in der Elektrophorese gut zu unterscheiden (Abbildung 10).


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Abbildung 12: Prinzip der Herstellung des externen Standards zur Quantifizierung der CYP1A1 und CYP1B1 mRNA

A: Konstruktion des RNA-Standards für die Quantifizierung der CYP1A1 mRNA
B: Maßnahmen der Herstellung des CYP1B1 RNA-Standards

Die Hauptschritte beinhalten eine Amplifikation zwei Segmente aus der genomischen DNA, eine Restriktionsspaltung der Fragmente als Vorbereitung für die anschließende Ligation und schließlich eine in vitro Transkription in die RNA. Die Standardkonstrukte waren um 17 bzw. 32 Basen länger als die entsprechenden mRNA-Fragmente.

Anschließend wurden die Fragmente mit Hilfe der T4-DNA Ligase nach Anleitung des Herstellers verbunden. 3 µl des Ligationsansatzes wurden für eine weitere Reaktion verwendet. Das PCR-Gemisch wurde aus folgenden Komponenten in einem Volumen von 30 µl zusammengesetzt:

Substanz

Volumen [µl]

10 x Puffer

3

MgCl2 [50 mM]

1

dNTPs [je 2 mM]

2

Primer 1A1-IST7 [10 µM]

4.5

Primer 1A1-ISRT [10 µM]

3.5

Taq-Polymerase [5 U/µl]

0.25

Wasser

12.75

Die Reaktions­bedingungen entsprachen denen einer herkömmlichen 35-Zyklen PCR mit Anlagerung der Primer bei 50 °C. Nach der Kontrollelektrophorese der Amplifikate (Bande bei 256 bp) fand eine Aufreinigung der Fragmente in Filtereinheiten statt. Die DNA wurde in 20 µl Wasser aufgenommen und im folgenden Schritt der in vitro Transkription mittels T7 RNA-Polymerase in die RNA unterzogen. Anschließend wurde die RNA im Phenol-Chloroform Verfahren aufgereinigt, photometrisch gemessen und zu den benötigten Konzentrationen verdünnt.

Die RT-PCR Reaktion fand in zwei Schritten statt. Für die Reverse Transkription (RT) der mRNA wurde die MuMLV Reverse Transkriptase benutzt. Die Reversen Transkriptionen für CYP1A1 und CYP1B1 erfolgten genspezifisch, d.h. es wurde ein sequenzspezifischer Primer benutzt. Zunächst wurden für jede Probe vier RT Ansätze mit verschiedener Konzentration der Standard-RNA angefertigt. Diese wurden auf 100 ng der vorgegebenen Probe gegeben und in einer PCR-Maschine für eine Stunde bei 37 °C inkubiert. Pro Ansatz wurden folgende Komponenten pipettiert:


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Substanz

Volumen [µl]

5 x 1. Strang Puffer

4

DTT [0.1 M]

2

dNTPs [je 10 mM]

1

Primer 1A1 RT [10 µM]

2

RNase Inhibitor [40 U/µl]

0.2

MuMLV Reverse Transkriptase [200 U/µl]

0.4

sRNA 001

1

Wasser

5.4

Direkt nach der Transkription wurde allen Proben das PCR-Gemisch zugegeben. Dieser bestand aus folgenden Komponenten:

Substanz

Volumen [µl]

10xPuffer

2

MgCl2 [50 mM]

0.6

dNTPs [je 2 mM]

1

Primer 1A1-1 [10 µM]

0.6

Primer 1A1-2 [10 µM]

0.6

Taq-Polymerase [5 U/µl]

0.2

Wasser

15

Vorausgegangene Untersuchungen haben ergeben, dass die auf diese Weise zusammengesetzte PCR nach 27 Zyklen noch in der exponentiellen Anstiegsphase ist, so dass dieser Zeitpunkt als geeignet für die quantitative Auswertung der Produkte gewählt wurde. Die Reaktion umfasste einen Denaturierungsschritt bei 94 °C für 2 min, 27 Amplifikationszyklen bestehend aus je 20 s bei 94 °C und 65 °C sowie 40 s bei 72 °C. Nach einer abschließenden 4 min-Elongation erfolgte die Kühlung. Zur Detektion in der Kapillarelektrophorese wurden 4 µl der Produkte entnommen. In Abbildung 13 sind die Resultate aus vier PCRs mit unterschiedlichen Standardkonzentrationen und einer RNA-Probe demonstriert. Aus den Signalstärken wurden die Flächen unter den Kurven ausgerechnet und entsprachen der DNA-Konzentration.

Abbildung 13: Ergebnisse der RT-PCRs für CYP1A1 mRNA einer Probe

Pro RNA-Probe wurden vier RT-PCR Ansätze mit vier verschiedenen RNA-Standard Konzentrationen angefertigt. Auf der Abszisse ist die Größe der Moleküle dargestellt, während die Ordinate die Signalstärke anzeigt (Bildschirmabzug). Die Probe enthielt 85 Kopien mRNA/ng CYP1A1 RNA.


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4.4.3.2  CYP1B1 RT-PCR

Die Quantifizierung der CYP1B1 mRNA erfolgte in zwei Schritten und die PCR-Produkte wurden in einer Kapillarelektrophorese aufgetrennt. Das Prinzip der Quantifizierung der CYP1B1 mRNA gleicht dem zur Bestimmung von CYP1A1 mRNA. Der Standard wurde in 1:10 Stufen verdünnt und den Reaktionsansätzen zugegeben. Das amplifizierte CYP1B1 Segment betrug 201 bp, der kompetitive RNA Standard 233 b (Abbildung 10).

Zunächst wurden in separaten PCRs zwei Fragmente (144 und 87 bp) aus genomischer DNA hergestellt, wobei die Primer 1B1-F1 und 1B1-F2 EcoRI-Erkennungsstellen trugen. Nach elektrophoretischer Überprüfung und Aufreinigung (s.o.) wurden beide Produkte mit je 20 U EcoRI verdaut. Die gereinigten Amplifikate wurden vereinigt und in einem 20 µl Ansatz mit 1 U T4-Ligase versetzt. In einer weiteren PCR (Primer: 1B1-IST7 und 1B1-ISRT, Anlagerung bei 50 °C) wurden 3 µl des Produktes vervielfältigt. Nach elektrophoretischer Überprüfung wurden die Fragmente aufgereinigt und einer in vitro Transkription unterzogen. Die aufgereinigte RNA wurde photometrisch gemessen und die Molekülanzahl ermittelt.

Für die Reverse Transkription wurden 50 ng Proben-RNA genutzt und das Gemisch setzte sich aus folgenden Komponenten zusammen:

Substanz

Volumen [µl]

5x 1. Strang Puffer

4

DTT [0.1 M]

2

dNTPs [je 10 mM]

1

Primer 1B1 RT [10 µM]

2

RNase Inhibitor [40 U/µl]

0.2

MuMLV Reverse Transkriptase [200 U/µl]

0.4

sRNA

1

Wasser

7.4

Die Ansätze wurden eine Stunde bei 37 °C inkubiert und anschließend wurde allen Proben das PCR-Gemisch mit folgenden Komponenten zugegeben:

Substanz

Volumen [µl]

10xPuffer

2

MgCl2 [50 mM]

0.4

dNTPs [je 2 mM]

1

Primer 1B1-1 [10 µM]

0.6

Primer 1B1-2 [10 µM]

0.6

Taq-Polymerase [5 U/µl]

0.2

Wasser

15.2

Die Anlagerungstemperatur betrug 60 °C und die PCR-Kinetik wurde nach 25 Zyklen beendet. Abschließend wurden 2 µl der Produkte unter den gleichen Bedingungen wie im Fall der CYP1A1 mRNA Detektion elektrophoretisch aufgetrennt. Ein typisches Elektropherogramm zur Quantifizierung der CYP1B1 mRNA ist in Abbildung 14 illustriert.


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Abbildung 14: Ergebnisse der RT-PCRs für CYP1B1 einer Probe

Pro RNA-Probe wurden vier RT-PCR Ansätze mit vier verschiedenen RNA-Standard Konzentrationen angefertigt. Auf der Abszisse ist die Größe der Moleküle dargestellt (mRNA bei 198 bp, Standard bei 234 bp; Abweichungen von tatsächlicher Größe sind bedingt durch die Elektrophorese), während die Ordinate die Signalstärke anzeigt (Bildschirmabzug). Die Probe enthielt 1.3 x 104 Moleküle CYP1B1 mRNA/ng RNA.

4.4.3.3 CYP3A4 RT-PCR

Für die Erfassung der Menge der CYP3A4 mRNA wurde ein Echtzeit-RT-PCR Verfahren am LightCycler System entwickelt [197]. Die Quantifizierung erfolgte über einen externen Standard, der in der Sequenz mit der gemessenen CYP3A4 mRNA identisch war und der in einer Verdünnungsreihe aus bekannten Konzentrationen bei jeder PCR im LightCycler in separaten Kapillaren mitgeführt wurde, nachdem er im selben Ansatz in die cDNA transkribiert wurde.

Abbildung 15: Das Prinzip der Detektion der entstehenden PCR-Produkte mittels zwei Hybridisierungssonden


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Die PCR fand in einer Glaskapillare statt, die entstehenden DNA-Fragmente werden mit Hilfe einer Fluoreszenzmarkierung detektiert. Für diese Methode verwendet man sogenannte Hybridisierungs­­sonden. Hierbei handelte es sich um zwei Oligonukleotide, die streng komplementär zur gewünschten Matrize in 3‘-Richtung lagen. Das Prinzip der Signalübertragung ist in Abbildung 15 demonstriert. Während eine Sonde am 5’-Ende mit einem LC Red (640 bzw. 705 nm) Farbstoff markiert war, trug die zweite Sonde am 3‘-Ende ein Fluorescein. Um der Extension an der LC Red-Probe vorzubeugen, war dieses Oligonukleotid am 3‘-Ende phosphoryliert. Beide Sonden lagerten sich benachbart zueinander an die während der PCR amplifizierte cDNA an und die Resonanz Energie wurde vom Donor Fluorophor (in diesem Fall das 3‘-Fluorescein) zum Akzeptor (5‘-LC Red) transferiert [198, 199]. Die Messung erfolgte während der Anlagerung der Primer und der Sonden an die Matrize. Auf diese Weise kann man am Monitor den Verlauf der PCR verfolgen.

Der erste Schritt der Reversen Transkription wurde in einer herkömmlichen PCR-Maschine durchgeführt. Die gesamte mRNA der Zelle wurde mit Hilfe des dT15 Primers in cDNA umgeschrieben. Anschließend wurde die CYP3A4 cDNA im LightCycler amplifiziert. Für die Berechnung der Molekülanzahl wurde in gesonderten Kapillaren eine CYP3A4 Standardreihe vervielfältigt. Aus den bekannten RNA-Konzentrationen ließ sich die Anzahl der Moleküle berechnen. Das synthetisierte CYP3A4 RNA Fragment betrug 218 b, was einer Molekülmasse von 71.9 kDa entspricht.

Abbildung 16: Prinzip der Herstellung des externen Standards zur Quantifizierung der CYP3A4 mRNA

Für die Herstellung des Standards (Abbildung 16) wurde zunächst eine konventionelle RT-PCR mit den zuvor für die CYP3A4 Messung optimierten Bedingungen (s.u.) durchgeführt. Anschließend wurde die cDNA über Filtereinheiten entsprechend den Anweisungen des Herstellers gereinigt und in 20 µl Wasser aufgenommen. 4 µl des gereinigten Produktes wurden folgendem Reaktionsgemisch zugegeben:

Substanz

Volumen [µl]

10 x Puffer

3

MgCl2 [50 mM]

1

dNTPs [je 2 mM]

2

Primer T7Pr [10 µM]

4.5

Primer RTPr [10 µM]

3.5

Taq-Polymerase [5 U/µl]

0.25

Wasser

12.75

Die Proben wurden unter folgenden Konditionen amplifiziert: 2 min bei 94 °C, 40 Zyklen von 40 s bei 94 °C, 55 °C und 72 °C und anschließenden 4 min bei 72 °C. Nach einer Kontrolle der PCR im [Seite 33↓]Agarosegel wurden die PCR Produkte erneut über Filtereinheiten gereinigt. Für die 90-min-in-vitro-Transkription bei 37 °C wurde die T7 RNA Polymerase entsprechend dem Protokoll des Herstellers benutzt. Die anschließende Behandlung mit RNase freien RQ1-DNase befreite die Proben von evtl. noch vorhandenen DNA. In einer Phenol-Chloroform Extraktion wurde die RNA gereinigt, im Photometer die Konzentration und Reinheit gemessen und die Spezifität des Fragmentes wurde durch DNA-Sequenzanalyse getestet.

Die Bedingungen für die Reverse Transkription waren für CYP3A4, MDR1 und β-Mikroglobulin gleich und der Reaktionsmix enthielt folgende Komponenten:

Substanz

Volumen [µl]

5x 1. Strang Puffer

4

DTT [0.1 M]

2

dNTPs [je 10 mM]

1

BSA [1mg/ml]

0.5

Primer Oligo dT(15) [10 µM]

2

RNase Inhibitor [40 U/µl]

0.2

MuMLV Reverse Transkriptase [200 U/µl]

0.4

Wasser

5.9

Die Ansätze wurden wie folgt inkubiert: 10min bei 26 °C, 60 min bei 42 °C, 2 min bei 95 °C, Kühlung auf 4 °C. Direkt im Anschluss wurde die Reaktion am LightCycler mit folgenden Komponenten durchgeführt, wobei 40 ng der cDNA (8 µl) vervielfältigt wurden:

Substanz

Volumen [µl]

10xPuffer

0.7

MgCl2 [50 mM]

0.9

dNTPs [je 2 mM]

0.7

DMSO [100 %]

0.7

BSA [1 mg/ml]

0.6

Primer CYP3A4F [10 µM]

0.5

Primer CYP3A4R [10 µM]

0.5

Sonde CYP3AFlu [10 µM]

0.25

Sonde CYP3ALCred [10 µM]

0.25

Platinum Taq Polymerase [5 U/µl]

0.33

Wasser

1.57

Folgende Reaktionsbedingungen stellten sich als optimal heraus: 40 s bei 95 °C, anschließend 45 Zyklen bestehend aus 0 s bei 95 °C sowie je 10 s bei 55 °C und 72 °C. Eine abschließende Elongation war wegen der Detektion in Echtzeit nicht notwendig.

Die Abbildung 17 zeigt Zunahme der Amplifikatmenge im Verlauf der PCR einer Verdünnungsreihe der CYP3A4 RNA Standards. Die lineare Regression der Daten wird aus den logarithmierten Werten für die Konzentration (hier wurde das Gewicht in Femtogramm als Maßstab gewählt) und der Zyklenanzahl des Schwellenwertes ermittelt. Die Werte auf der linken Seite der Standardkurve beschreiben die in der Regressionsgeraden enthaltenen Daten. Diese beruhen auf mathematischen Berechnungen und stehen im Verhältnis zur Reaktion selbst. Die Steigung (slope) wird durch folgende Gleichung mathematisch beschrieben: -1/log E, wobei E die Reaktionseffizienz widerspiegelt. Für die Effizienz ist ein Akzeptanzbereich beschrieben. Dieser beträgt das 1.5- bis 2.2-fache der Amplifikation pro Lauf. Wenn das PCR-Produkt in jedem Zyklus verdoppelt wird, beträgt die Effizienz genau 2, was einer Steigung der Standardkurve von –3.3 entspricht. Im Fall von CYP3A4 in Leukozyten wird mit sehr geringen Mengen an Ausgangsmaterial gearbeitet, so dass die mathematischen Beschreibungen der Standardkurve von den für große Mengen an Nukleinsäuren errechneten theoretischen Idealwerten ein wenig abweichen.


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Abbildung 17: PCR des CYP3A4 RNA Standards

A. Der Verlauf der PCR einer 10fachen Verdünnungsreihe des CYP3A4 Standards. 1-5 beschreiben die mRNA Konzentration von 3.5 x 105 bis 3.5 x 101 Kopien während 6 und 7 die Negativkontrollen für RT bzw. PCR darstellen. B. Standardkurve für die CYP3A4 mRNA, abgeleitet aus den in Abbildung A dargestellten Daten. Es ist der Logarithmus der Konzentration gegen den sog. threshold cycle (CT) jedes Experimentes eingezeichnet. Der CT definiert die Zyklusnummer, bei der die Menge des Amplifikats einen Schwellenwert über der Basislinie erreichte. Das Verhältnis zwischen den RNA-Kopien und weist eine Linearität auf (r = -0.98, Bildschirmabzug).

In Abbildung 18 ist die Amplifikation der CYP3A4 mRNA aus fünf Leukozyten-Proben und drei Leber-Proben über 45 Zyklen veranschaulicht. Die Leberproben wurden als Positivkontrolle für hohe CYP3A4 mRNA Konzentrationen gewählt, um die Realisierbarkeit des Verfahrens bei geringen und hohen Kopienzahlen zu demonstrieren. Die hier dargestellten Leberproben enthielten im Durchschnitt 3 x 105 CYP3A4 mRNA Moleküle pro 1 ng Gesamt RNA (Einzelwerte: 5 x 105, 1 x 105, 2 x 105).


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Abbildung 18: CYP3A4 PCR-Verlauf

Verlauf einer PCR mit CYP3A4 mRNA aus Leukozyten-Proben und Leber-Proben. Die Verdünnungsreihe des Standards hatte Konzentrationen von 3.5 x 108 bis 3.5 x 101 Kopien pro Ansatz (Bildschirmabzug).

4.4.3.4 MDR1 RT-PCR

Die Ermittlung der Molekülzahl der MDR1 mRNA erfolgte ebenfalls als Echtzeit RT-PCR am LightCycler. Die Sequenzen der Primer wurden der Arbeit von Schneider et. al. entnommen und lagen im Exon 21 bzw. 22 des Gens, was ein Produkt von 168 bp ergab [200]. Der externe Standard wurde nach gleichem Prinzip erstellt wie bei der CYP3A4 Messung, entsprach in seiner Sequenz dem MDR1 cDNA Fragment und wurde stets in sechs Verdünnungsstufen mitgeführt.

Für die PCR am LightCycler wurden folgende Komponenten gemischt:

Substanz

Volumen [µl]

10 x Puffer

1.6

MgCl2 [50 mM]

0.7

dNTPs [je 2 mM]

0.7

DMSO [100%]

0.7

BSA [1 mg/ml]

0.6

Primer umdr1 [10 µM]

0.4

Primer dmdr1 [10 µM]

0.4

Sonde mdr1Flu [10 µM]

0.2

Sonde mdr1LCred [10 µM]

0.2

Taq Polymerase [5 U/µl]

0.2

Wasser

2.3

Die Reaktionsbedingungen im LightCycler glichen den für die CYP3A4 Messungen.

4.4.3.5 β-Mikroglobulin RT-PCR

In den meisten Fällen war eine absolute Quantifizierung über einen synthetisch hergestellten Standard völlig ausreichend. Um jedoch auch unspezifische Effekte der Substanzen herauszufiltern, wurde bei ausgewählten Proben parallel zu CYP3A4 bzw. MDR1 auch das sogenannte house keeping Gen, β-Mikroglobulin, gemessen. Dieses Gen gilt als konstitutiv konstant reguliert und soll in allen Individuen in äquivalenten Mengen exprimiert werden. Für diese mRNA wurde ebenfalls ein externer Standard konstruiert nach dem unter 4.3.3.3 beschriebenen Prinzip, so dass auch hier die absolute Kopienzahl der mRNA gemessen werden konnte. [Seite 36↓]Üblicherweise wurde ein RT-Ansatz zu einem Teil für die CYP3A4 bzw. MDR1 Messung gebraucht, während aus dem anderen die β-Mikroglobulin Fragmente vervielfältigt wurden.

Der PCR-Ansatz und die Reaktionsbedingungen entsprachen den zur Bestimmung der MDR1 mRNA.

4.4.4 Agarose-Gelelektrophorese

Zur Kontrolle der amplifizierten Fragmente wurde eine Gelelektrophorese durchgeführt. Je nach Fragmentgröße wurden 1 bis 3 % Gele hergestellt. Zu Anfang der Arbeiten erfolgte die Färbung der Nukleinsäuren mit Ethidiumbromid, später mit dem Nukleinsäurefarbstoff GelStar.

4.4.5 Kapillarelektrophorese

Die Größe und Menge der zuvor in der Polymerase Kettenreaktion amplifizierten CYP1A1 und CYP1B1 cDNA-Fragmente wurden mittels Kapillarelektrophorese detektiert.

Im Gegensatz zur Flachbett-Gelelektrophorese wird die Kapillarelektrophorese in Kapillaren aus amorphem Quarz mit einem Innendurchmesser von 75 µm durchgeführt. Als Trennmedium wird ein Polymer (das POP4) eingesetzt, um den Stromtransport zu gewährleisten und den pH-Wert in der Kapillare konstant zu halten. Die Trennungen finden bei einer elektrischen Feldstärke von mehreren hundert V/cm statt, der Strom durch die Kapillaren ist auf Grund des kleinen Innendurchmessers aber gering (im Bereich von 100 µA). Die durch die hohe Spannung erzeugte Wärme kann wegen des geringen Durchmessers der Kapillare und damit einem günstigen Oberflächen-Volumen-Verhältnis effektiv abgeführt werden. Die Detektion der Analyte erfolgte mit Hilfe der Fluoreszenzmessung am Detektionsfenster.

Entsprechend der Auftrennung in einem herkömmlichen Agarosegel wandern die positiv geladenen DNA-Fragmente von der Kathode zur Anode. Beide Elektroden sind in Puffertanks eingetaucht, zwischen denen die Glaskapillare eingespannt ist. Die Proben befinden sich in einem automatischen Probengeber und werden computergesteuert in die Kapillare befördert. Es wird eine Spannung angelegt, so dass die DNA proportional zur Größe je nach der Ladekapazität der Kapillare, die wiederum aus der Kapillardichte und der Injektionszeit resultiert, in die Kapillare aufgenommen wird. Die Kapillare wird in den Puffer eingetaucht und die Elektrophorese begonnen. Nach 30 cm Laufstrecke erreichen zunächst die kürzeren, später die längeren DNA-Polymere das Detektionsfenster, an dem die Fluoreszenz der entsprechend markierten Fragmente gemessen wird. Am Bildschirm kann der Ablauf verfolgt werden. Die Größe und Stärke der Signale sind proportional zur Konzentration der DNA-Fragmente. Für die Auswertung wurde die AUC (Fläche unter der Kurve) genutzt.

Für die Detektion mittels Kapillarelektrophorese wurden fluoreszenzmarkierte Primer für die PCR verwandt. Als Farbstoff wurde Fluorescein (FAM) gewählt. Nach der Amplifikation wurde ein Detektionsmix erstellt, der einen ROX gefärbten Größenstandard (ROX500) enthielt. 2 bzw. 4 µl des Amplifikates wurden dem Mix aus HPLC Reinstwasser und Standard zugesetzt und in den Probengeber gestellt.

4.4.6 Inter-day und intra-day Variationskoeffizient

Für die Etablierung des jeweiligen Verfahrens war die Ermittlung des Variationskoeffizienten notwendig.

Für die Bestimmung des inter-day Variationskoeffizienten (CV) der CYP1A1 und CYP1B1 RT-PCRs wurde je eine Proben-RNA aus der Zellkultur an verschiedenen Tagen bestimmt. Der Koeffizient der Variation (CV) für das Verfahren zur Bestimmung der CYP1A1 mRNA betrug 26 % (n = 9) für eine Probe mit 21 Kopien CYP1A1 mRNA/ng Gesamt-RNA; der entsprechende intra-day Koeffizient lag bei 24 % (n = 8) für eine Probe mit 28 Kopien CYP1A1. Für die CYP1B1 RT-PCR betrug der inter-day CV 24 % (n = 5) für Messungen einer Probe mit 3.4 x 104 Kopien CYP1B1 mRNA/1ng Gesamt-RNA; der intra-day CV lag bei 22 % (n = 9) für eine Probe mit 2.9 x 104 Kopien.

Im Fall der CYP3A4 RT-PCR von geringen Kopienzahlen aus Lymphozyten wurden CVs für die gesamte Prozedur (ausgehend von der RNA Isolierung) wie folgt bestimmt. Zunächst wurden einem Probanden 80 ml Vollblut in 8-ml Vacutainer®cpt System entnommen und während der Präparation der Leukozyten in gleiche Mengen portioniert. Für die Evaluierung des inter-day assay Koeffizienten wurden sowohl Isolierung der RNA als auch die Messung der CYP3A4 mRNA an [Seite 37↓]verschiedenen Tagen durchgeführt, während für den intra-assay alle Schritte am selben Tag stattfanden. Der Variationskoeffizient betrug 29 % (n = 10) für die inter-day Bestimmung mit gemessenen 53 Kopien der CYP3A4 mRNA pro 1 ng der Gesamt RNA. Der entsprechende intra-day Koeffizient betrug 24 % (n = 10) für eine Probe mit 33 Kopien der CYP3A4 mRNA/ng RNA.

4.5 Sequenzierung

Die Spezifität der entwickelten RT-PCRs wurde mittels Sequenzierung überprüft.

Als Methode wurde das Prinzip der Sequenzierung nach Sanger [201] gewählt. Mit Hilfe einer modifizierten DNA-Polymerase und eines Oligonukleotid-Primers wurden unter Zugabe von dNTPs und mit vier verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen markierten Didesoxynukleotiden Kopien des zu sequenzierenden Stranges synthetisiert. Aufgrund der fehlenden OH-Gruppe am 3‘-Ende führte der Einbau eines Didesoxyribonukleotid-5‘-triphosphats zum Kettenabbruch. Die so entstandenen unterschiedlich großen Fragmente wurden in einer Kapillarelektrophorese getrennt und die Fluoreszenz jedes der nukleotidspezifisch eingebauten Fluoreszenzfarbstoffe wurden spezifisch detektiert und aufgezeichnet.

Die Sequenzierreaktion wurde mit einem BigDye™-Terminator-Reaktionsset, in dem sich das Enzym mit den markierten Nukleotiden befand, entsprechend der Anweisungen des Herstellers in einem Volumen von 10 µl angesetzt und erfolgte in einer PCR-Maschine mit folgendem Temperaturprofil: 25 Zyklen mit je 10 s bei 96 °C, 15 s bei 50 °C, 4 min bei 60 °C. Die Amplifikate wurden in einem Säulenverfahren aufgereinigt und in einer Vakuumzentrifuge getrocknet. Anschließend wurden die Proben im destillierten Wasser aufgenommen und in den Probengeber auf einen 48-Proben-Halter gestellt.

Die Auswertung der Daten erfolgte mit Hilfe des Programms „Sequencing Analysis“. Die erhaltenen Sequenzen wurden mit den bekannten Originalsequenzen im Programm „GeneDoc“ verglichen und im Programm „BLAST“ überprüft.

4.6 Methoden zur Analyse der DNA

Die Probanden der Studie zur Bestimmung der CYP3A Aktivität wurden hinsichtlich einiger Polymorphismen genotypisiert2. Es wurden die häufigsten CYP3A4 Mutationen, CYP3A4*1B und CYP3A4*3 untersucht. Außerdem wurde das Vorkommen der CYP3A5*1 Variante untersucht, da dieses Allel für die Expression des vollständigen CYP3A5 Protein notwendig ist [106]. Durch die Prüfung auf das CYP2C19*2 Allel sollte eine eventuelle Beteiligung des CYP2C19 Enzyms am Stoffwechsel von Alprazolam geklärt werden.

Die Analysen erfolgten mittels PCR-RFLP Verfahren (PCR – Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus), deren Prinzip auf einer sequenzspezifischen Spaltung der zuvor vervielfältigten DNA-Fragmente mit einer Endonuklease beruht.

4.6.1 Isolierung der genomischen DNA

Die DNA wurde aus 8 ml Vollblut im Phenol-Chloroform Verfahren extrahiert. Die Reinheit und Ausbeute wurden photometrisch überprüft und die DNA wurde auf 30 ng/µl eingestellt.

4.6.2 Analyse des CYP3A4*1B Genotyps

Da für die vorliegende Punktmutation keine Endonuklease mit passender Erkennungssequenz bekannt war, wurde der Vorwärtsprimer (3A4*1B_F) in die Nähe der Mutation gelegt und seine Sequenz so modifiziert, dass im Fall des Basenaustausches zu G eine Schnittstelle entstand. Da das Allel sehr selten ist, wurde eine Kontrollschnittstelle im Rückwärtsprimer (3A4*1B_R) eingefügt. Die Vervielfältigung der DNA erfolgte aus 60 ng unter PCR-Standardbedingungen (3 mM MgCl2) mit Zugabe von 1.5 % DMSO und einer Anlagerung der Primer bei 63 °C. Die 182 bp großen Amplifikate wurden mit BstNI (CC^WGG, wobei W = A oder T) nach Anleitung des Herstellers verdaut und elektrophoretisch detektiert. Die Produkte der Träger des Wildtyp-Allels CYP3A4*1A wiesen im Agarosegel Banden bei 23 bp und 59 bp auf, während die Träger des CYP3A4*1B Allels durch Banden von 23 bp und 136 bp charakterisiert wurden.


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4.6.3  Analyse des CYP3A4*3 Genotyps

Die PCR zur Bestimmung des Allels erfolgte mit Primern 3A4*3_F und 3A4*3_R (Anlagerung bei 64 °C; 3.5 mM MgCl2). Die Produkte von 289 bp Länge wurden mit der Restriktionsendonuklease MslI nach Angaben des Herstellers versetzt und die Resultate im Agarosegel ausgewertet. Das Wildtyp-Allel wurde in folgende Fragmente geschnitten: 21 bp, 89 bp, 179 bp während die Amplifikate der Träger des CYP3A4*3 Allels eine Schnittstelle weniger besaßen und nach der Inkubation mit der Endonuklease in 110 bp und 179 bp große Fragmente gespalten waren.

4.6.4 Analyse des CYP3A5*1 Genotyps

Die DNA wurde mit Hilfe der Primer 3A5*3_F und 3A5*3_R (Anlagerung bei 59 °C, 2.5mM MgCl2) vervielfältigt und die Amplifikate (279 bp) mit BseNI gespalten. Es wurden nur die Amplifikate der Träger des Basenaustausches im Intron 3 geschnitten, wobei Fragmente 25 bp und 254 bp entstanden.

4.6.5 Analyse des CYP2C19*2 Genotyps

Die Mutation wurde mittels PCR-RFLP bestimmt, wobei für die PCR die Primer mep f und mep r mit einer Anlagerungstemperatur bei 58 °C benutzt wurden. Die nachfolgende DNA-Spaltung wurde mit dem Enzym SmaI nach Anleitung des Hersteller durchgeführt. Das amplifizierte 169-bp-Fragment wurde bei den Wildtyp-Trägern einmal geschnitten, was im Agarosegel ein Bandenmuster von 49 bp und 120 bp ergab.

4.7  Bestimmung der Konzentration von Alprazolam im Plasma

Die Konzentration von Alprazolam wurde mittels HPLC entsprechend der nach Schmider et. al [187] beschriebenen Methode im Plasma bestimmt3. Die ALZ Clearance (Cloral) verhält sich indirekt proportional zu den 10-h-Plasma-Konzentrationen und wurde aus diesem Wert berechnet.

4.8 Statistische Auswertung

Die Daten wurden in Excel-Tabellen gespeichert und zum Teil auch mit diesem Programm ausgewertet. Statistische Prozeduren wurden mit Hilfe des Programms „SPSS“ (Vers. 10) durchgeführt. Neben der explorativen Datenanalyse und den Korrelationsberechnungen nach Spearman wurden der nicht-parametrische Test nach Wilcoxon sowie der Mann-Whitney-Test für nicht-parametrische und unabhängige Vergleiche von zwei Gruppen durchgeführt. Außerdem wurde der nicht-parametrische Kruskal-Wallis-Test zur “Varianzanalyse” für Rangdaten angewandt, um die induktiven Effekte der Testsubstanzen zu zeigen. Die statistische Signifikanz wurde bei p ≤ 0.05 festgesetzt.

Für die Expressionsuntersuchungen in der Zellkultur wurden die Standardfehler der Mittelwerte (SEMs) ermittelt. Diese werden durch den Quotienten aus der Standardabweichung und der Wurzel der Anzahl der Messungen (SD/√n) definiert.

Die analytische Varianz ist durch den Quadrat der Standardabweichung (SD2) definiert und wurde für die Dreifachmessungen der CYP3A4 mRNA im Blut bestimmt.

Für die Untersuchungen aus der Alprazolamstudie wurde die Güte der Tests in einem Diskriminanzverfahren mit maximaler Korrektklassifikationswahrscheinlichkeit unter Normalverteilungsannahme überprüft. Der optimale Trennwert (cutoff value) wurde anhand folgender Formel bestimmt [202]:

,

wobei X1 dem Mittelwert der Messungen unter Kontrollbedingungen entsprach und X2 dem Mittelwert der induzierten Proben. Diese Formel konnte verwendet werden, da angenommen wurde, dass für beide Fälle (Kontrolle/Induktion) gleiche Wahrscheinlichkeit galt. Für dieselben [Seite 39↓]Proben wurden auch die diagnostische Spezifität und Sensitivität bestimmt.

Die diagnostische Sensitivität wurde an der grafischen Darstellung mit zu Hilfenahme des Trennwertes ermittelt und stellte den Anteil derjenigen Proben in % dar, die unter Kontrollbedingungen kleiner als der Trennwert waren und somit richtig positiv im Sinne von nicht-induziert.

Die diagnostische Spezifität wird ebenfalls in % dargestellt und entspricht dem Anteil der Proben, die nach der Induktion größer als der ermittelte Trennwert waren und somit richtig negativ im Vergleich zu nicht-induziert, d.h. induziert.


Fußnoten und Endnoten

1 Die Studie wurde unter der Leitung von Frau Dr. Julia Kirchheiner durchgeführt.

2 Die Verfahren zur Genotypisierung von CYP3A4 und CYP3A5 wurden von Herrn Mark Goldammer entwickelt.

3 Die HPLC Messungen wurden im Analytiklabor unter Leitung von Herr Dr. Steffen Bauer durchgeführt.



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