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5  Ergebnisse

5.1 Induktion der CYP1A1 und CYP1B1 mRNA durch antiretrovirale Mittel

Die durch die Aktivierung des Aryl-Kohlenwasserstoff-Rezeptor ausgelöste Initiation der Transkription wurde am Beispiel der beiden Gene CYP1A1 und CYP1B1 in vitro untersucht. Hierfür wurde eine Zellkultur mit verschiedenen Konzentrationen der antiretroviralen Mittel inkubiert und die mRNA der beiden Enzyme quantitativ bestimmt.

Die humane Zelllinie HeLa des urikalen Adenokarzinoms wächst adhärent und wurde in früheren Untersuchungen als geeignetes in vitro System zur Expressionsuntersuchung bestimmt [55]. Die hier verwendeten HeLa-Zellen wiesen eine Verdopplungszeit von ca. 24 Stunden auf. Nach 18 Stunden Inkubation mit Arzneimitteln zeigten die Zellen keine morphologischen Veränderungen unter dem inversen Phasenkontrast-Mikroskop. In der vorliegenden Arbeit wurde an der HeLa-Zelllinie der Einfluss der Virustatika auf die Expression der mRNA von CYP1A1 und CYP1B1 untersucht. Hierfür wurden zwei quantitative kompetitive RT-PCR Verfahren verwendet.

Vor den Inkubationen mit Arzneimitteln wurden zwischen 13 und 52 Molekülen CYP1A1 mRNA/ng Gesamt-RNA mit einem Mittelwert von 23 (SD: ± 11) gemessen. Die Basalexpression von CYP1B1 mRNA lag in einem Bereich von 1.2 x 103 bis 1.1 x 104 Molekülen/ng RNA mit einem Mittelwert von 3.3 x 103 (± 2.3 x 103).

Tabelle 13: Die Effekte der getesteten antiretroviralen Mittel auf die CYP1A1 und CYP1B1 mRNA Expression

Substanz

Getestete Konzentration [µM]

Td [µmol]

Ausmaß der Induktion bei Td

Konzentration bei max. Induktion

Maximale Induktion

CYP1A1

CYP1B1

CYP1A1

CYP1B1

CYP1A1

CYP1B1

Abacavir

23.9 – 238.5

44.7

1.0

1.0

23.9

23.9

1.2

1.1

Didanosin

21.2 – 211.7

42.3

0.9

1.0

211.7

211.7

1.0

1.2

Lamivudin

0.4 – 436.2

32.7

1.0

1.0

261.7

261.7

2.0

5.4*

Stavudin

0.4 – 446.0

17.8

0.7

1.0

0

446.0

1.0

1.1

Zalcitabin

0.3 – 250.0

0.3

1.0

5.1

250.0

25.0

2.8*

6.0*

Zidovudin

0.4 – 374.2

93.6

1.3

1.8

3.7

374.2

1.6

2.6*

Efavirenz

10.2 – 101.6

19.1

1.1

1.2

40.6

40.6

1.2

1.3

Nevirapin

75.2 – 300.8

75.2

1.5

3.6

300.8

225.6

2.1

4.5*

Amprenavir

63.3 – 632.9

237.3

1.3

1.0

632.9

632.9

1.4

1.5

Indinavir

52.1 – 521.3

195.5

2.3

1.8

521.3

521.3

2.6*

2.8*

Kaletra1

25.4 – 254.5

63.6

1.7

1.7

101.8

101.8

1.9

2.1*

Nelfinavir

0.5 – 964.0

169.5

2.8

2.9

482.0

482.0

4.1*

3.4*

Ritonavir

44.4 – 443.8

83.2

2.1

5.3

88.8

177.5

2.1*

7.2*

Saquinavir2

0.5 – 477.1

268.3

n.d.

n.d.

47.7

47.7

4.2*

9.9*

Angaben des Faktors der Induktion bei der Tagesdosis (Td) wurden aus den Kurven­verläufen geschätzt, wobei Kontrollwerte ohne Testsubstanz gleich 1.0 gesetzt wurden und die übrigen Werte darauf bezogen.

1 Bei Kaletra beziehen sich die Konzentrationsangaben auf die Mischung Lopinavir/Ritonavir (4:1)
2 Saquinavir war bei 477.1 µM zytotoxisch, die letzte ausgewertete Konzentration lag bei 47.7 µM
* Signifikanter Anstieg nach dem Kruskal-Wallis-Test mit p < 0.05

Die Zellen wurden mit 14 antiretroviralen Mitteln in verschiedenen Konzentrationen inkubiert (Tabelle 13). Lamivudin wurde in acht verschiedenen Konzentrationen eingesetzt, Nelfinavir mit sechs und alle anderen Substanzen mit vier verschiedenen Wirkstoffkonzentrationen. Für alle Substanzen wurde eine Tagesdosis geschätzt, die nach der Berücksichtigung des möglichen Verteilungsvolumens auf die Gegebenheiten in der Zellkultur berechnet wurden. In den meisten Fällen lag die niedrigste eingesetzte Konzentration weit unterhalb der therapeutischen Plasmaspiegel während die höchste Konzentration entweder durch die Löslichkeit oder eventuelle Toxizität limitiert wurde. Saquinavir war bei der Konzentration von 477.1 µM zytotoxisch, die letzte [Seite 41↓]auswertbare Konzentration betrug 47.7 µM und lag unterhalb der Tagesdosis. Zellen, die mit Kaletra und Nelfinavir inkubiert wurden, wiesen bei den höchsten Konzentrationen geringere RNA-Ausbeuten auf (15.9 bzw. 25.0 % der Ausbeute von RNA unter Kontrollbedingungen), was auf beginnende zytotoxische Effekte hindeutet. Alle RNA-Proben wurden vor dem Einsatz auf eine konstante Konzentration normiert. Einige Medikamente, wie z. B. Lamivudin, Kaletra, Ritonavir und Efavirenz, verursachten bei höheren Konzentrationen eine Abnahme der mRNA Menge, was zum Teil ebenfalls auf toxische Effekte zurückgeführt werden kann (Abbildung 19 - Abbildung 23). Inkubationen mit Lamivudin führten sowohl bei CYP1A1 als auch bei CYP1B1 zunächst zu einem Anstieg der mRNA Mengen, ab der 261.7-µM-Konzentration nahm die gemessene Konzentration ab.

Abbildung 19: CYP1A1 mRNA Expression nach Inkubation mit 6 nukleosidischen Reverse Transkriptase Inhibitoren

Es sind Mittelwerte der Einzelmessungen mit den Standardfehlern der Mittelwerte dargestellt. Die Werte der Konzentrationen auf der x-Achse wurden logarithmiert. Auf der y-Achse sind die Quotienten aus mRNA Molekülen mit jeweiliger Induktorkonzentration zum Mittelwert der mRNA Moleküle ohne Testsubstanz aufgetragen, was dem Faktor der Induktion entspricht.

In Abbildung 19 sowie Abbildung 20 sind die konzentrationsabhängigen Effekte der Inkubationen [Seite 42↓]mit Nukleosidischen Reverse Transkriptase Inhibitoren gezeigt. In dieser Gruppe war Zalcitabin die einzige Substanz, welche die Expression von CYP1A1 und CYP1B1 mRNA um den Faktor 2.8 (p = 0.010; Kruskal-Wallis-Test) bzw. 6.0 (p = 0.024) statistisch signifikant erhöhte (Tabelle 13). Bei der therapeutisch eingesetzten Konzentration von 0.3 µM Zalcitabin war nur die CYP1B1 mRNA um den Faktor von 5.1 erhöht. Die Inkubation der HeLa-Zellen mit Stavudin, Didanosin, Abacavir, Zidovudin und Lamivudin brachte keinen statistisch signifikanten Anstieg der CYP1A1 mRNA Konzentrationen. Die CYP1B1 mRNA Expression stieg während der Inkubationen mit Lamivudin und Zidovudin um den Faktor 5.4 (p = 0.048) bzw. 2.6 (p = 0.010) statistisch signifikant an. Lamivudin wies bei der Tagesdosis keinen induzierenden Effekt auf während Zidovudin auch bei der therapeutisch eingesetzten Dosis von 93.6 µM ein moderater Induktor ist (Faktor 1.8).

Abbildung 20: Nukleosidischen Reverse Transkriptase Inhibitoren und die Expression von CYP1B1 mRNA

Es sind Mittelwerte der Einzelmessungen mit den Standardfehlern der Mittelwerte dargestellt. Die Werte der Konzentrationen auf der x-Achse wurden logarithmiert. Auf der y-Achse sind die Quotienten aus mRNA Molekülen mit jeweiliger Induktorkonzentration zum Mittelwert der mRNA Moleküle ohne Testsubstanz aufgetragen, was dem Faktor der Induktion entspricht.


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Abbildung 21: Effekte von Efavirenz und Nevirapin auf mRNA Expression von CYP1A1 und CYP1B1

Es sind Mittelwerte der Einzelmessungen mit den Standardfehlern der Mittelwerte dargestellt. Die Werte der Konzentrationen auf der x-Achse wurden logarithmiert. Auf der y-Achse sind die Quotienten aus mRNA Molekülen mit jeweiliger Induktorkonzentration zum Mittelwert der mRNA Moleküle ohne Testsubstanz aufgetragen, was dem Faktor der Induktion entspricht.

Nevirapin und Efavirenz, Nicht-Nukleosidische Inhibitoren der Reversen Transkriptase, wiesen unterschiedliche Induktionseffekte auf (Abbildung 21). Während Inkubationen mit verschiedenen Konzentrationen von Efavirenz keinen signifikanten Anstieg der CYP1A1 und CYP1B1 mRNA verursachte (mit p-Werten von 0.953 bzw. 0.757), erhöhte sich die Menge der CYP1B1 mRNA nach Inkubationen mit Nevirapin von 2717 (± 25) auf 12254 (± 1) Moleküle/ng RNA bei einer Konzentration von 225.6 µM mit einem maximalen Induktionseffekt von 4.5 (p = 0.022). Nach Inkubation mit 300.8 µM Nevirapin stieg die Konzentration der CYP1B1 mRNA weniger stark an, nämlich auf 7673 Kopien/ng RNA (± 3703). Die Konzentration der CYP1A1 mRNA nahm während Inkubation mit 300.8 µM Nevirapin von 15 (± 8.4) auf 32 (± 7.1) Moleküle/ng RNA zu, was einem Faktor von 2.1 entspricht (der Anstieg war nach dem Kruskal-Wallis-Test für alle Gruppen statistisch nicht signifikant; p = 0.064). Nach einem Vergleich der Kontrollgruppe mit Resultaten aus der 300.8-µM Gruppe zeichnete sich eine induktive Tendenz ab (p = 0.05). Bei der errechneten Tagesdosis war lediglich CYP1B1 mRNA mit einem Faktor von 3.6 induziert.

Von den sechs getesteten Proteaseinhibitoren hatten die neueren Wirkstoffe Amprenavir und Kaletra keinen bzw. relativ schwachen Einfluss auf die mRNA Expression von CYP1A1 und CYP1B1 (Abbildung 22und Abbildung 23). CYP1B1 mRNA Konzentration stieg von 2967 (± 479) Moleküle/ng RNA auf 5798 (± 297) Moleküle während der Inkubation mit 101.8 µM Kaletra, was einem Faktor von 2.1 (p = 0.003) entspricht. Bei einer Tagesdosis von 63.6 µM wurde eine schwache Induktion mit einem Faktor von 1.7 für CYP1A1 und CYP1B1 geschätzt. Inkubationen mit Indinavir verursachten einen 2.6-fachen Anstieg der CYP1A1 mRNA und 2.8-fachen der CYP1B1 mRNA (p = 0.001 bzw. 0.029). Nelfinavir, Ritonavir and Saquinavir waren sehr starke Induktoren der mRNA Expression von CYP1A1 und CYP1B1 (Tabelle 9). Es reichten bereits sehr niedrige Konzentrationen von Saquinavir (0.5 µM) um einen Induktionseffekt auf die beiden CYP1-Gene auszulösen. Die Menge, die über 500-fach niedriger als die geschätzte Tagesdosis lag, induzierte die Expression der CYP1A1 mRNA in den HeLa-Zellen um den Faktor 2.4 und die [Seite 44↓]CYP1B1 mRNA sogar um das 9.4-fache.

Abbildung 22: CYP1A1 mRNA Expression unter Einwirkung von Proteaseinhibitoren

Es sind Mittelwerte der Einzelmessungen mit den Standardfehlern der Mittelwerte dargestellt. Die Werte der Konzentrationen auf der x-Achse wurden logarithmiert. Auf der y-Achse sind die Quotienten aus mRNA Molekülen mit jeweiliger Induktorkonzentration zum Mittelwert der mRNA Moleküle ohne Testsubstanz aufgetragen, was dem Faktor der Induktion entspricht.


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Abbildung 23: CYP1B1 mRNA Konzentrationen nach 18-stündigen Inkubationen mit Proteaseinhibitoren

Es sind Mittelwerte der Einzelmessungen mit den Standardfehlern der Mittelwerte dargestellt. Die Werte der Konzentrationen auf der x-Achse wurden logarithmiert. Auf der y-Achse sind die Quotienten aus mRNA Molekülen mit jeweiliger Induktorkonzentration zum Mittelwert der mRNA Moleküle ohne Testsubstanz aufgetragen, was dem Faktor der Induktion entspricht.

Generell lässt sich zusammenfassen, dass die antiretroviralen Substanzen über ein induktives Potential auf die AhR vermittelte Initiation der Transkription haben, wobei die älteren Proteaseinhibitoren besonders hervorzuheben sind. Daneben wirken Nevirapin sowie Zalcitabin aktivierend. Die Expression der CYP1B1 mRNA wurde durch die Medikamente stärker beeinflusst als die Synthese der CYP1A1 mRNA.


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5.2  Induktion der CYP3A4 und MDR1 mRNA durch antiretrovirale Mittel

In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob die antiretroviralen Mittel die PXR-vermittelte Steigerung der Transkription auslösen und somit den eigenen Stoffwechsel und den der anderen Medikamente beschleunigen können. Der Pregnan-X-Rezeptor aktiviert unter anderem die Expression des Enzyms CYP3A4 und des Transporters MDR1.

Die basale Expression von CYP3A4 und MDR1 mRNA wurde in verschiedenen humanen Zelltypen bestimmt (Tabelle 14). Entsprechend den physiologischen Bedingungen wurde CYP3A4 mRNA am stärksten im Lebergewebe exprimiert, während die MDR1 mRNA in hohen Mengen in Zellen dermalen Ursprungs bestimmt wurde. In den Caco-2 Zellen konnte keine CYP3A4 mRNA detektiert werden. Die Synthese der CYP3A4 mRNA erwies sich in den HeLa-Zellen und einigen HepG2 Chargen (Daten nicht dargestellt) als minimal. Die MDR1 mRNA wurde in allen getesteten Zellsystemen exprimiert. Für die Inkubationen mit den Arzneimitteln wurden die Zelllinien COLO-320 sowie eine bisher unpassagierte HepG2 Charge gewählt.

Tabelle 14: Expression von CYP3A4 und MDR1 in verschiedenen humanen Zelltypen

Zelltyp

Moleküle CYP3A4

mRNA/ng RNA

Moleküle MDR1

mRNA/ng RNA

Caco-2, Kolonkarzinom

0

(n=2)

1340

(n=2)

COLO-320, Kolonkarzinom

25.4

(n=6)

19400

(n=6)

HeLa, Zervixkarzinom

3.1

(n=3)

32.0

(n=3)

HepG2, Hepatokarzinom

122.0

(n=6)

54.7

(n=6)

Lymphozyten

26.1

(n=7)

83.9

(n=5)

Lebergewebe (Operationspräparat)

300000

(n=3)

27.2

(n=2)

Die basale Expression der CYP3A4 mRNA nahm mit steigernder Passagierungszahl der HepG2-Zellen stetig ab (Abbildung 24). Nach sechs Passagen wurden durchschnittlich 290 Kopien der CYP3A4 mRNA/ng RNA gemessen. Nach der 10. Passage waren es 3.3 Kopien/ng RNA und ab Passage 11 pendelte sich die Menge der CYP3A4 mRNA auf etwa 2 Kopien/ng RNA ein. Dieser Effekt betraf nicht die Expression von β-Mikroglobulin oder MDR1 mRNA.

Abbildung 24: Einfluss der Passagenzahl auf die CYP3A4 mRNA Expression

Es sind die Mittelwerte der Einzelmessungen (n = 3) dargestellt.

Um die Zelllinien auf ihre Eignung als in vitro System zur Untersuchung der CYP3A4- und MDR1- Induktion zu überprüfen, wurden COLO-320 und HepG2-Zellen mit vier verschiedenen Rifampicin Konzentrationen in Doppelbestimmung inkubiert (Abbildung 25).

In den COLO-320 Zellen war die CYP3A4 mRNA nach 20 Stunden Inkubation mit 19.4 µM [Seite 47↓]Rifampicin mit einem Faktor von 2.2 (p = 0.035 für den Unterschied aller Gruppen nach Kruskal-Wallis) maximal induziert. Die CYP3A4 mRNA Expression nahm nach 40 und 72 Stunden im Vergleich zu Ausgangskonzentration der mRNA vor Induktion sehr stark ab (Abbildung 25), sie sank nach 72h konzentrations­abhängig von 164 auf 24 (SD: ±3) Moleküle/ng RNA. Die Abnahme der mRNA Konzentration war statistisch signifikant (Kruskal-Wallis-Test für alle fünf Gruppen: p = 0.032). Eine Induktion der CYP3A4 mRNA war nicht mehr zu beobachten. Kontrollansätze mit ß-Mikroglobulin zeigten, dass auch diese mRNA bedingt durch Langzeitbehandlung mit höheren Wirkstoff­konzentration leicht abnahm. Die MDR1 mRNA Expression stieg nach 20h unter der höchsten Konzentration von 194.4 µM von 2.7 x 104 (± 1.3 x 103) auf 4.4 x 104 (± 6.3 x 103) Moleküle/ng RNA um den Faktor 1.6 statistisch signifikant an (p = 0.031). In der COLO Zelllinie bewirkte eine 40 und 72-stündige Inkubation mit Rifampicin nur sehr geringe Veränderungen in der Expression der MDR1 mRNA, allerdings keine Abnahme der Expression.

In den HEPG2 Zellen nahm die CYP3A4 mRNA Konzentration (Abbildung 25) nach Inkubationen mit 38.9 µM Rifampicin maximal um den Faktor 2.6 (p = 0.038) zu. Die Expression der MDR1 mRNA wurde durch 194.4-µM Rifampicin 1.5-fach (p = 0.035) erhöht. In den HepG2-Zellen wurde die MDR1 mRNA nach Behandlung mit 194.4 µM Rifampicin auch am 2. und 3. Tag um den Faktor 1.3 bzw. 1.5 erhöht. In Folge dieser Ergebnisse wurden die Zelllinien COLO-320 sowie HepG2 20 Stunden mit verschiedenen Konzentrationen der antiretroviralen Mittel inkubiert.

Abbildung 25: Konzentrationsabhängige Veränderungen in der mRNA Expression von CYP3A4 und MDR1 nach mehrtägiger Behandlung mit Rifampicin

Es sind Mittelwerte der Einzelmessungen mit den Standardfehlern der Mittelwerte dargestellt. Auf der y-Achse sind die Quotienten aus mRNA Molekülen mit jeweiliger Induktorkonzentration zum Mittelwert der mRNA Moleküle ohne Testsubstanz aufgetragen, was dem Faktor der Induktion entspricht.

Die Entwicklung der CYP3A4 mRNA Expression unter Einwirkung der Nukleosidischen Reverse Transkriptase Inhibitoren ist in Abbildung 26 dargestellt. Aus dem Verläufen wird sichtbar, dass die Expression zwar einigen Schwankungen unterliegt, dass jedoch nur Zalcitabin in beiden Zellsystemen die Synthese der CYP3A4 mRNA induziert hatte. In den COLO-Zellen stieg die CYP3A4 mRNA Konzentration von 41 (± 21) auf 58 (± 24) Moleküle mRNA/ng RNA unter [Seite 48↓]Einwirkung von 1.9 µM Zalcitabin um das 1.4-fache (p = 0.822) an. Der Effekt war in der HepG2-Zellkultur etwas stärker ausgeprägt (Faktor: 2.0), jedoch beim Vergleich aller Gruppen auch nicht signifikant (p = 0.642). Zalcitabin erhöhte die CYP3A4 mRNA Konzentration bei der errechneten Tagesdosis von 0.3 µM um den Faktor von 2.0 in den HepG2-Zellen. Inkubationen mit den anderen NRTIs, Abacavir, Stavudin, Didanosin, Lamivudin und Zidovudin, brachten ebenfalls keine signifikanten Veränderungen der CYP3A4 mRNA Expression. Die Expression der MDR1 mRNA wurde von keinem der Nukleosidischen Reverse Transkriptase Inhibitoren signifikant verändert (Abbildung 27) und unterlag lediglich leichten Schwankungen, die in den COLO-Zellen stärker ausgeprägt waren als in den HepG2-Zellen.

Abbildung 26: CYP3A4 mRNA Expression in HepG2 und COLO-320 Zellkultur unter Einwirkung der Nukleosidischen Reverse Transkriptase Inhibitoren.

Es sind die Mittelwerte der Einzelmessungen mit den Standardfehlern der Mittelwerte dargestellt. Die Werte der Konzentrationen wurden logarithmiert. Auf der y-Achse sind die Quotienten aus mRNA Molekülen mit jeweiliger Induktorkonzentration zum Mittelwert der mRNA Moleküle ohne Testsubstanz aufgetragen, was dem Faktor der Induktion entspricht. Die geringen Konzentrationen von Zalcitabin waren durch die niedrige Tagesdosis bedingt.


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Abbildung 27: MDR1 mRNA Expression in HepG2 und COLO-320 Zellkultur unter Einwirkung der Nukleosidischen Reverse Transkriptase Inhibitoren.

Es sind die Mittelwerte der Einzelmessungen mit den Standardfehlern der Mittelwerte dargestellt. Die Werte der Konzentrationen wurden logarithmiert. Auf der y-Achse sind die Quotienten aus mRNA Molekülen mit jeweiliger Induktorkonzentration zum Mittelwert der mRNA Moleküle ohne Testsubstanz aufgetragen, was dem Faktor der Induktion entspricht. Die geringen Konzentrationen von Zalcitabin waren durch die niedrige Tagesdosis bedingt.

In der COLO Zelllinie zeigten die untersuchten Nicht-Nukleosidischen Reverse Transkriptase Inhibitoren keine signifikanten induktiven Effekte (Abbildung 28) auf die Expression der MDR1 mRNA auf. Die CYP3A4 mRNA Konzentrationen in den COLO-Zellen stiegen nach Inkubationen mit 20.3 µM Efavirenz signifikant um den 1.7 (p = 0.040) Faktor an. Bei höheren Konzentrationen blieb die Expression nahezu konstant bei durchschnittlich 19 CYP3A4 mRNA Moleküle/ng RNA; unbehandelte Zellen exprimierten 11 (± 2) Moleküle/ng RNA. Die Zellen dermalen Ursprungs zeigten eine 1.9-fache Erhöhung der CYP3A4 mRNA Konzentration nach Inkubationen mit Delavirdin, die statistisch nicht signifikant (Vergleich aller Gruppen; p = 0.148) war.

Delavirdin induzierte die CYP3A4 mRNA in den HepG2-Zellen (Abbildung 28) um das 2.2-fache signifikant (p = 0.037). Die Konzentration der MDR1 mRNA stieg unter Einwirkung von Delavirdin in der HepG2-Zellkultur konzentrationsabhängig an und erreichte den gemessenen maximalen Effekt [Seite 50↓]mit dem Faktor 3.4 unter 579 µM. Betrachtet man die Effekte bei der Tagesdosis, lag der Induktionseffekt in den HepG2-Zellen (Tabelle 16) für die CYP3A4 mRNA bei 2.1 und für die MDR1 mRNA bei 1.6. Die MDR1 mRNA Expression sank in den COLO-Zellen unter dem Einfluss von Delavirdin konzentrationsabhängig bis auf das 0.3-fache ab. In den HepG2-Zellen induzierte Efavirenz die CYP3A4 mRNA Expression maximal um den Faktor 3.2 (p = 0.029) nach Inkubationen mit 101.6 µM - die mRNA Menge stieg von der basalen Expression bei durchschnittlich 231 (± 54) Moleküle mRNA/ng RNA auf 705 (± 118) an. Auf die MDR1 mRNA Expression hatte Efavirenz keine aktivierende Wirkung. Inkubationen mit Nevirapin ergaben keine signifikanten Expressionsveränderungen von CYP3A4 oder MDR1.

Abbildung 28: Einfluss der Nicht-Nukleosidischen Reverse Transkriptase Inhibitoren auf die Expression von CYP3A4 und MDR1 mRNA in COLO-320 und HepG2-Zellen.

Es sind die Mittelwerte der Einzelmessungen mit den Standardfehlern der Mittelwerte dargestellt. Die Werte der Konzentrationen wurden logarithmiert. Auf der y-Achse sind die Quotienten aus mRNA Molekülen mit jeweiliger Induktorkonzentration zum Mittelwert der mRNA Moleküle ohne Testsubstanz aufgetragen, was dem Faktor der Induktion entspricht.

Beide Zelltypen wurden mit sechs Proteaseinhibitoren inkubiert. Das Ansprechen der Zellen auf die Stoffe war unterschiedlich und wird im folgenden für jede Substanz einzeln geschildert.


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Amprenavir hatte einen induktiven Effekt auf die Expression der CYP3A4 mRNA (Abbildung 29) in beiden Zelltypen. In den COLO-Zellen stieg die mRNA Konzentration von durchschnittlich 32 (± 10) Moleküle/ng RNA auf 66 (± 23) nach Inkubationen mit 632.9 µM Amprenavir mit einem Faktor von 2.0 (p = 0.038) signifikant an. In den HepG2-Zellen betrug der Induktions­faktor 3.3 (p = 0.024) nach Inkubationen mit 126.6 µM Amprenavir. Bei höheren Konzentrationen war der Effekt schwächer ausgeprägt mit 1.8 bzw. 1.4-fachem Anstieg der CYP3A4 mRNA Konzentration. Bei der errechneten Tagesdosis lag der Faktor der Induktion bei 1.8 in den COLO-Zellen bzw. bei 1.9 in den HepG2-Zellen. Die Konzentration der MDR1 mRNA (Abbildung 30) stieg in den COLO-Zellen konzentrationsabhängig von 4.2 x 104 (± 5.1 x 103) Moleküle/ng RNA auf 5.9 x 104 (± 2.7 x 103) Moleküle um den Faktor 1.4 signifikant an (p = 0.04), der maximale Effekt wurde unter 253 µM Amprenavir erreicht. Bei der höchsten Konzentration von 632.9 µM hat die MDR1 mRNA Menge nahezu den Ausgangswert erreicht und lag bei 4.8 x 104 (±1.2 x 104). Die Veränderungen der MDR1 Expression in der Hepatoma Zellkultur waren moderat und ohne einen signifikanten Anstieg (mit Faktor: 1.3; Vergleich aller Gruppen: p = 0.078).

Abbildung 29: CYP3A4 mRNA Expression unter Einwirkung der Proteaseinhibitoren in der COLO-320- und HepG2-Zellkultur

Es sind die Mittelwerte der Einzelmessungen mit den Standardfehlern der Mittelwerte dargestellt. Die Werte der Konzentrationen wurden logarithmiert. Auf der y-Achse sind die Quotienten aus mRNA Molekülen mit jeweiliger Induktorkonzentration zum Mittelwert der mRNA Moleküle der Kontrollansätze aufgetragen, was dem Faktor der Induktion entspricht.


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Abbildung 30: Veränderungen in der MDR1 mRNA Expression nach Inkubationen mit Proteaseinhibitoren in der COLO-320 und HepG2-Zellkultur

Es sind die Mittelwerte der Einzelmessungen mit den Standardfehlern der Mittelwerte dargestellt. Die Werte der Konzentrationen wurden logarithmiert. Auf der y-Achse sind die Quotienten aus mRNA Molekülen mit jeweiliger Induktorkonzentration zum Mittelwert der mRNA Moleküle ohne Testsubstanz aufgetragen, was dem Faktor der Induktion entspricht.

Indinavir wies in den Versuchen in beiden Zelltypen und für beide Gene induktives Potential auf und erhöhte die CYP3A4 mRNA Konzentration nach Inkubationen mit 104.3 µM um das 1.7-fache (p = 0.045) in den COLO-Zellen und nach den Inkubationen mit 208.5 µM um das 2.2-fache in den HepG2-Zellen (p = 0.034). In den COLO-Zellen war die Expression der MDR1 mRNA nach Inkubationen mit 208.5 µM Indinavir 1.8-fach stärker (p = 0.043) als in den Kontrollansätzen. In den HepG2-Zellen wurde die maximale Induktion nach 521.3 µM erreicht und betrug das 1.5-fache der Ausgangsmenge (p = 0.037), wobei hier kein Induktionseffekt bei der Tagesdosis von 195.5 µM zu verzeichnen war.

Die Inkubationen mit dem Inhalt der Kaletra-Kapseln resultierten nur in den HepG2-Zellen in einer signifikanten Zunahme der CYP3A4 mRNA Konzentration um das 1.7-fache (p = 0.044) von 32 [Seite 53↓](± 9) Molekülen mRNA/ng RNA auf 55 (± 6) bei 6.4 µM. Bei Konzentrationen von 12.7 µM bzw. 25.4 µM war der Induktionseffekt schwächer ausgeprägt und lag bei einem Faktor von 1.4 bzw. 1.2. Die höheren Konzentrationen wiesen im Zytotoxizitätstest zytotoxisches Potential von ≥ 20% in den HepG2-Zellen bzw. > 80% in den COLO-Zellen auf. Die Inkubationen mit 25.4 µM Substanz wiesen in den HepG2-Zellen einen Zytotoxizitätswert von 17.1 % auf.

Inkubationen mit Nelfinavir erhöhten die Konzentrationen von CYP3A4 und MDR1 mRNA in beiden untersuchten Zellsystemen. In der COLO-Zellkultur lag die maximale Induktion der CYP3A4 mRNA Konzentration (Abbildung 29) bei einem Faktor von 2.5 (p = 0.029) bzw. 2.4 (p = 0.026) in den HepG2-Zellen. Bei der Tagesdosis von 169.5 µM wäre ein Induktionseffekt von 2.0 bzw. 2.1 zu erwarten. Nelfinavir induzierte die Expression der MDR1 mRNA (Abbildung 30) maximal um den Faktor 1.6 (p = 0.005) und 2.4 (p = 0.033) in den COLO bzw. HepG2-Zellen. Die Effekte waren auch bei der Tagesdosis sichtbar (Faktor 1.6 bzw. 1.7).

Die CYP3A4 mRNA wurde durch Ritonavir in beiden Zelllinien induziert - mit einem Faktor von 1.7 (p = 0.024) in den COLO- und 2.1 (p = 0.043) in den HepG2-Zellen. Bei der Tagesdosis war die CYP3A4 mRNA nur in den HepG2-Zellen erhöht, mit einem geschätzten Induktionseffekt von 1.5. Die MDR1 mRNA wurde durch Inkubationen mit Ritonavir um das 1.8-fache (p = 0.031) und 3.8-fache (p = 0.026) in den COLO bzw. HepG2-Zellen induziert. Hier stieg die Konzentration der MDR1 mRNA kontinuierlich von 103 (± 13) auf 392 (± 115) Moleküle mRNA/ng RNA an, bei der Tagesdosis lag der Induktionsfaktor bei 2.8.

Die Inkubationen der HepG2-Zellen mit Saquinavir wurden zweimal durchgeführt. Da die erste Testreihe mit häufig passagierten HepG2-Zellen stattfand, konnte dort keine reproduzierbare CYP3A4 mRNA Messung mehr vorgenommen werden. Somit wurden CYP3A4 und MDR1 in zwei unterschiedlichen HepG2-Zellpopulationen durchgeführt. Saquinavir erhöhte die CYP3A4 mRNA Konzentration signifikant um das 1.4-fache (p = 0.028) in den COLO-Zellen und etwas stärker in der Hepatoma Zelllinie, nämlich um das 1.9-fache (p = 0.032) nach Inkubationen mit 23.9 µM. Bei der höheren Konzentration von 47.7 µM nahm die CYP3A4 mRNA Menge wieder ab. Nach Inkubationen mit der Tagesdosis von 268.3 µM waren die HepG2-Zellen tot und vom Gefäßboden gelöst. Saquinavir war auch ein potenter Induktor der MDR1 mRNA Synthese in beiden Zelltypen. Der maximale Effekt wurde jeweils bei der höchsten Konzentration erreicht. In der COLO-Zellkultur stieg die MDR1 mRNA Konzentration nach Inkubationen mit 268.3 µM auf das doppelte an (p = 0.010), in den HepG2-Zellen nach 477.0 µM um das 3.1-fache (p = 0.035). Der Effekt war auch bei der Tagesdosis von 268.3 µM deutlich bei einem geschätzten Induktionsfaktor von 2.0 bzw. 1.8.

In den beiden nachfolgenden Tabellen sind alle getesteten Substanzen mit ihren Konzentrationen sowie den Induktionseffekten auf die CYP3A4 und die MDR1 mRNA aufgeführt. In der Tabelle 15 sind die Ergebnisse aus den Untersuchungen an der COLO-320-Zellkultur zusammengefasst, während Tabelle 16 die Daten aus der HepG2-Zellkultur enthält.


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Tabelle 15: Die getesteten Substanzen und die Expression von CYP3A4 und MDR1 mRNA in COLO-320 Zellkultur

Substanz

Getestete Konzentration [µM]

Td [µmol]

Ausmaß der Induktion an Td

Konzentration bei max. Induktion [µM]

Max. Induktion

 

CYP3A4

MDR1

CYP3A4

MDR1

CYP3A4

MDR1

Rifampicin

19.4 – 194.4

36.5

2.1

1.3

19.4

194.4

2.2*

1.6*

Abacavir

23.9 – 238.5

44.7

1.0

1.4

23.9

47.7

1.1

1.4

Didanosin

21.2 – 211.7

42.3

1.0

1.1

211.7

42.3

1.2

1.1

Lamivudin

21.8 – 218.1

32.7

1.2

1.2

43.6

43.6

1.2

1.2

Stavudin

8.9 – 89.2

17.8

1.2

1.1

89.2

35.7

1.2

1.1

Zalcitabin

0.5 – 4.7

0.3

1.0

1.0

1.9

4.7

1.4

1.1

Zidovudin

59.9 – 598.7

93.6

1.0

1.1

119.7

598.7

1.1

1.3

Delavirdin

57.9 – 579.0

108.6

1.7

0.8

115.8

0

1.9

1.0

Efavirenz

10.2 – 101.6

19.1

1.7

1.0

101.6

10.2

1.7*

1.0

Nevirapin

60.2 – 601.5

75.2

0.8

1.1

0

120.3

1.0

1.1

Amprenavir

63.3 – 632.9

237.3

1.8

1.4

632.9

253.1

2.0*

1.4*

Indinavir

52.1 – 521.3

195.5

0.7

1.8

104.3

208.5

1.7*

1.8*

Kaletra1

6.4 – 25.4

63.6

n.d.

n.d.

6.4

0

1.4

1.0

Nelfinavir

48.2 – 482.0

169.5

2.0

1.6

96.4

192.8

2.5*

1.6*

Ritonavir

44.4 – 443.8

83.2

1.0

11

177.5

44.4

1.7*

1.8*

Saquinavir

11.9 – 268.3

268.3

0.7

2.0

11.9

268.3

1.4*

2.0*

1 Bei Kaletra beziehen sich die Konzentrationsangaben auf die Mischung Lopinavir/Ritonavir (4:1). Konzentrationen höher als die Tagesdosis waren für die Zellen zytotoxisch (n.d. = nicht detektiert).
* Signifikanter Anstieg nach dem Kruskal-Wallis-Test mit p < 0.05

Tabelle 16: Die getesteten Substanzen und die Expression von CYP3A4 und MDR1 mRNA in HepG2-Zellkultur

Substanz

Getestete Konzentration [µM]

Td [µM]

Ausmaß der Induktion an Td

Konzentration bei max. Induktion [µM]

Max. Induktion

 

CYP3A4

MDR1

CYP3A4

MDR1

CYP3A4

MDR1

Rifampicin

19.4 – 194.4

36.5

2.5

1.3

38.9

194.4

2.6*

1.6*

Abacavir

23.9 – 238.5

44.7

1.1

1.0

23.9

23.9

1.5

1.0

Didanosin

21.2 – 211.7

42.3

1.2

0.9

42.3

84.7

1.2

1.2

Lamivudin

21.8 – 218.1

32.7

1.0

0.9

218.1

218.1

1.2

1.3

Stavudin

8.9 – 89.2

17.8

0.8

0.9

8.9

89.2

1.2

1.0

Zalcitabin

0.5 – 4.73

0.3

2.0

1.0

0.5

4.7

2.0

1.3

Zidovudin

59.9 – 598.7

93.6

1.3

1.5

119.7

598.7

1.4

1.6

Delavirdin

57.9 – 579.0

108.6

2.1

1.8

57.9

579.0

2.2*

3.4*

Efavirenz

10.2 – 101.6

19.1

1.5

0.8

101.6

0

3.2*

1.0

Nevirapin

60.2 – 601.5

75.2

1.0

1.0

240.6

60.2

1.4

1.0

Amprenavir

63.3 – 632.9

237.3

1.9

1.3

126.6

253.1

3.3*

1.3

Indinavir

52.1 – 521.3

195.5

2.1

1.1

208.5

521.3

2.1*

1.5*

Kaletra1

6.4 – 25.4

63.6

n.d.

n.d.

6.4

0

1.7*

1.0

Nelfinavir

48.2 – 482.0

169.5

2.1

1.2

192.8

482.0

2.4*

1.8*

Ritonavir

44.4 – 443.8

83.2

1.5

2.8

44.4

443.8

2.1*

3.8*

Saquinavir

11.9 – 477.0

268.3

n.d.

1.8

23.9

477.0

1.9*

3.1*

1 Bei Kaletra beziehen sich die Konzentrationsangaben auf die Mischung Lopinavir/Ritonavir (4:1). Konzentrationen höher als die Tagesdosis waren für die Zellen zytotoxisch (n.d. = nicht detektiert).
* Signifikanter Anstieg nach dem Kruskal-Wallis-Test mit p < 0.05

Im nächsten Schritt wurden die Effekte von Rifampicin auf die Expression von CYP3A4 bzw. MDR1 mRNA gleich 1 gesetzt und alle anderen Substanzen in Bezug zu dieser Größe ausgewertet (Abbildung 31). Es zeigte sich ein sehr heterogenes Muster an Effekten. Es waren vor allem die Proteaseinhibitoren, die in den induktiven Effekten Rifampicin glichen oder stärker waren.


[Seite 55↓]

Abbildung 31: Der maximale Induktionseffekt der untersuchten Medikamente auf die Expression von CYP3A4 und MDR1 mRNA

A: Das Ausmaß der CYP3A4 mRNA Induktion
B: Die Veränderungen in der Expression der MDR1 mRNA
Der Effekt von Rifampicin wurde gleich 1 gesetzt und galt als Bezugsgröße für die anderen Substanzen.

Die untersuchten Gene für CYP3A4 und MDR1 waren in der COLO-320 Zelllinie um ca. 30% weniger stark induzierbar als dies unter gleichen Bedingungen in den HepG2-Zellen gezeigt werden konnte. Zum anderen reagierten die COLO-Zellen empfindlicher auf höhere, toxische Dosen der Medikamente als die HepG2 Kulturen. In den COLO-Zellen wurden CYP3A4 und MDR1 mRNA durch fünf anti­retrovirale Mittel signifikant induziert; Amprenavir, Indinavir, Nelfinavir, Ritonavir und Saquinavir. In den HepG2-Zellen war das Spektrum der induzierenden Substanzen breiter, wobei Kaletra, Amprenavir und Efavirenz nur die Konzentration von CYP3A4 mRNA statistisch signifikant erhöhten.


[Seite 56↓]

5.3  CYP3A4 mRNA Expression in Leukozyten unter Rifampicin Induktion: Korrelation mit der Pharmakokinetik von Alprazolam unter Berücksichtigung bekannter Polymorphismen

Es wurde eine RT-PCR zur Bestimmung der CYP3A4 mRNA Konzentration im peripheren Blut entwickelt und validiert.

Die CYP3A4 RT-PCR erwies sich als spezifisch für die CYP3A4 mRNA und sensitiv für geringe Ausgangskonzentrationen. Die gewählten Primer CYP3A4F und CYP3A4R waren nur für die CYP3A4 mRNA spezifisch. Sie wurden so ausgesucht, dass sie sich am entscheidenden 3‘ Ende von der Sequenz der stark homologen Gene CYP3A5, CYP3A7 und CYP3A43 unterschieden. Das Ergebnis der Amplifizierung wurde mittels Sequenzierung überprüft; das cDNA Fragment enthielt reine CYP3A4 Sequenz. In Abbildung 32 ist das Ergebnis der Sequenzierung einer RNA-Probe aus den Leukozyten im direkten Vergleich zu den Sequenzen der CYP3A Vertreter dargestellt.

Abbildung 32: Sequenzvergleich eines cDNA Amplifikates aus Leukozyten mit den Vertretern der CYP3A Subfamilie

Es ist ein Vergleich der Sequenzierergebnisse der RT-PCR-Produkte aus zwei Leukozyten­proben (A001 sowie A002) mit den Vertretern der CYP3A-Subfamilie dargestellt: CYP3A4 (X12387), CYP3A5 (J04813), CYP3A7 (D00408) und CYP3A43 (af319634). Die Sequenzen A3۰CYP3A4 und A5۰CYP3A4 stammen aus einer Sequenzierreaktion mit dem Primer CYP3A4F, während die Proben B8۰CYP3A4 und B10۰CYP3A4 das Resultat der Sequenzierung mit dem Primer CYP3A4R darstellen. Die Pfeile oberhalb der Basenabfolgen weisen auf die entscheidenden Unterschiede zwischen den CYP3A-Formen hin, während die horizontalen Pfeile die eingesetzten Primer symbolisieren. In den cDNA-Proben aus Leukozyten ist an drei Stellen der Buchstabe „N“ statt des gewohnten ACGT-Codes vorzufinden, welcher darauf hinweist, dass das Programm an diesen Stellen keine sichere Basenzuordnung vornehmen konnte.

Es wurden Transkripte von 35 Kopien (4.2 atg) bis 3.5 x 105 Kopien (4.2 fg) detektiert. Die Standardkurve weist auf eine gute Korrelation zwischen Kopien der CYP3A4 mRNA und CT hin (r = -0.98). Unter 35 Kopien mRNA pro Ansatz war die Quantifizierung aufgrund des fehlenden exponentiellen Verlaufs der Reaktion unzuverlässig.

In einer Studie an 102 gesunden Probanden wurden die molekularen Grundlagen der [Seite 57↓]interindividuell stark variierenden CYP3A4 Expression untersucht. Es wurden kinetische Parameter erhoben, um die Aktivität des Enzyms zu bestimmen (s. 4.7). Bestimmung der CYP3A4 mRNA sollte Aufschluss über die Induzierbarkeit der mRNA im Blut geben. Beide Parameter wurden mit den Ergebnissen der Genotypisierungen der bekannten Polymorphismen der beteiligten Gene verglichen.

Sechs Leukozytenproben lieferten aus technischen Gründen ungenügende RNA Mengen, so dass nur 96 RNA-Proben ausgewertet werden konnten. Die folgenden Daten beziehen sich auf die 96 Probanden, von denen 61 männlich und 35 weiblich waren. Die Teilnehmer waren zwischen 19 und 64 Jahren alt, wobei der Median 26 Jahre betrug. Das Gewicht belief sich im Median auf 70.5 kg mit einem Bereich von 50 bis 100 kg.

Die RT-PCR Reaktionen aller Proben wurden in Dreifachmessungen durchgeführt. Der Median der analytischen Varianz lag bei 129.90 (SD2), wenn die Messungen einer Probe an verschiedenen Tagen erfolgten. Die Darstellung einer CYP3A4 PCR-Kinetik mit Proben vor und nach der Induktion zeigt Abbildung 33. Die CYP3A4 mRNA weist nach der Rifampicin-Induktion einen höheren CT–Wert auf, denn sie hebt sich schneller aus dem Hintergrund hervor als die mRNA Proben, die am zweiten Tag der Studie gesammelt wurden.

Abbildung 33: CYP3A4 PCR-Kinetik aus drei Leukozytenproben vor und nach der Induktion

Es sind die Verdünnungsreihe der Standard-RNA, von 3.5 x 105 bis 3.5 x 102 Kopien; sowie die Proben vor und nach 5-tägiger RIF Behandlung dargestellt.

Die CYP3A4 mRNA konnte in allen untersuchten Leukozyten-Proben detektiert werden. Unter Kontrollbedingungen (Tag 2) wurden zwischen 10 und 128 Moleküle/ng Gesamt-RNA (Median=28) gemessen (Tabelle 17). Nach fünf Tagen Induktionsperiode erhöhte sich der Median an detektierter CYP3A4 mRNA signifikant auf 50 Moleküle/ng RNA (p < 0.0001; Tag 7).

Zehn Stunden nach Einnahme von 1 mg Alprazolam wurden die Konzentrationen des Medikamentes im Plasma mittels HPLC bestimmt. Sie betrugen im Median 8.1 µg/l zu Beginn der Studie (Tag 2) bzw. 1.7 µg/l nach der Rifampicin-Behandlung (Tag 7), was einer Induktion mit dem Faktor 5.0 (Median) entspricht (Tabelle 17). Die metabolische Clearance von Alprazolam wurde nach der durch Schmider et. al. [182] ermittelten Formel berechnet und die Werte steigerten sich von einem Median von 3.2 l/h unter Kontrollbedingungen auf 16.1 l/h nach fünftägiger Behandlung mit Rifampicin. Nach der zweiwöchigen Auswaschphase ist die Alprazolam Clearance stark gesunken und erreichte fast die Ausgangswerte. Hier betrug der Median 3.5 l/h.


[Seite 58↓]

Tabelle 17: CYP3A4 mRNA in Leukozyten und Alprazolam Kinetik

 

Proben

Mittelwert

SD

Median

Perzentile

Bereich

     

25‰

75‰

Min.

Max.

CYP3A4 mRNA

Tag 2

32

19.6

28

21

37

10

128

[Moleküle/ng RNA]

Tag 7

61

53.1

50*

40

66

9

484

ALZ 10-h Konzentration

Tag 2

8.4

1.9

8.1

7.1

9.5

4.5

14.6

im Plasma [µg/l]

Tag 7

1.8

0.8

1.7*

1.3

2.2

0.4

4.1

 

Tag 22

7.8

1.9

7.6*

6.5

8.8

3.9

12.6

Errechnete ALZ

Tag 2

3.3

0.8

3.2

2.8

3.8

1.8

5.8

Clearance [l/h]

Tag 7

18.4

10.9

16.1*

12.2

20.8

6.4

83.3

 

Tag 22

3.6

0.9

3.5*

3.0

4.1

2.1

6.8

Die Messungen wurden bei 96 gesunden Probanden unter Kontrollbedingungen (Tag 2), nach 5-tägiger RIF Behandlung (450 mg, Tag 7) sowie nach der Auswaschphase (Tag 22) durchgeführt.

Abbildung 34: Individuelle Unterschiede im CYP3A4 mRNA Gehalt und Alprazolam Clearance bei 96 gesunden Probanden vor und nach Rifampicin Behandlung

Die Balken stellen den Median mit den 25 und 75 Perzentile (*p < 0.000, Wilcoxon-Test).


[Seite 59↓]

Nach der fünftägigen Behandlung mit 450 mg Rifampicin wiesen die meisten Probanden höhere CYP3A4 mRNA Konzentrationen in den mononukleären Zellen des peripheren Blutes auf (Abbildung 34). Der Faktor der Induktion variierte zwischen 0.7 und 7.3 mit einem Median von 2.0. Im Bezug auf das Ausmaß der Induktion konnten zwei extreme Gruppen gefunden werden. Sieben Probanden wiesen keine Induktion der CYP3A4 mRNA Spiegel auf. Am Anfang der Studie konnten bei ihnen durchschnittlich 39 CYP3A4 mRNA Moleküle pro 1 ng zellulärer RNA detektiert werden (Median = 31) mit Einzelwerten zwischen 16 und 68 mRNA Molekülen/ng Gesamt-RNA, während nach fünf Tagen Induktion die gemittelten Kopienzahlen 37 (Median = 29) betrugen. Auf der anderen Seite zeigten sieben Probanden CYP3A4 mRNA Konzentrationen, die um einen Faktor von 4.0 bis 7.3 durch Rifampicin induziert wurden. Hier lag der Median bei 4.0. 82 Probanden wiesen eine moderate Induktion der CYP3A4 mRNA durch Rifampicin auf. Hier bewegte sich die Anzahl der mRNA Kopien pro 1 ng zellulärer RNA zwischen 11 und 128 zu Beginn der Studie, und der Median lag bei 28 Kopien/ng RNA. Nach der RIF Behandlung stieg die Molekülzahl auf 57 an, der Median war bei 50. Der Faktor der Induktion betrug im Median 2.0.

Abbildung 35: Logarithmisch transformierte Häufigkeitsverteilung der CYP3A4 mRNA Kopien in Leukozyten von 96 Probanden vor und nach Behandlung mit Rifampicin

Die Häufigkeitsverteilung der beiden untersuchten CYP3A4 Genotypen mit Hilfe der kleinen Symbole eingetragen.

Die Histogramme in Abbildung 35 legen den Schluss nahe, dass die logarithmisch transformierten [Seite 60↓]Werte der CYP3A4 mRNA Moleküle sich nicht wesentlich von einer Normalverteilung unterscheiden. Es konnte keine Korrelation zwischen den mRNA Mengen vom Beginn der Studie und dem Ausmaß der Induktion gemessen werden. Die nicht induzierte Gruppe zeigte zum Teil überlappende Werte der mRNA Mengen mit den Werten nach Induktion.

Für die mRNA Messungen unter Kontrollbedingungen und nach Rifampicin Behandlung wurde ein optimierter Trennwert (cutoff value) von 46.68 Molekülen/ng RNA (log: 1.67) mit der in 4.7 vorgestellten Formel errechnet. Der Anteil der Werte, die am Tag 2 kleiner waren als der Trennwert, stellten in % die diagnostische Spezifität dar. Die diagnostische Sensitivität erklärt sich durch den prozentuellen Anteil der Werte nach Induktion, die größer als der Trennwert waren. Die diagnostische Spezifität und Sensitivität der CYP3A4 mRNA Messung sind in Tabelle 18 aufgetragen. Diese Parameter stellen Indikatoren für die Güte des analytischen Verfahrens dar.

Tabelle 18: Die ermittelten Parameter für die Testgüte der beiden verwendeten analytischen Verfahren.

Messung

Optimierter Trennwert

Diagnostische Spezifität

Diagnostische Sensitivität

CYP3A4 mRNA

46.68 Moleküle/ng RNA

86.5 %

58.3 %

Alprazolam Clearance

10.86 l/h

100 %

84.4 %

Die Histogramme in Abbildung 36 zeigen die Häufigkeitsverteilung der logarithmisch transformierten Alprazolam Clearance-Werte. Aus der Abbildung wird ersichtlich, dass sich die Häufigkeitsverteilung der Werte nicht wesentlich von einer Normalverteilung unterscheidet. Außerdem ist erkennbar, dass die Kontroll-Werte mit den Werten nach Rifampicin Behandlung nicht überlappen. Für die Alprazolam Clearance unter Kontrollbedingungen und nach Behandlung mit Rifampicin wurde ein optimierter Trennwert von 10.86 l/h (log: 1.04) berechnet. Ausgehend von dem Trennwert wurden die Parameter für die diagnostische Spezifität und Sensitivität des Tests (Tabelle 18) zur Detektion der CYP3A4 Induktion berechnet.


[Seite 61↓]

Abbildung 36: Häufigkeitsverteilung der Werte für die Alprazolam-Clearance

Es ist auch die Häufigkeitsverteilung der untersuchten Genotypen von CYP3A4, CYP3A5 und CYP2C19 aufgetragen.


[Seite 62↓]

Abbildung 37: Korrelation der CYP3A4 mRNA Mengen in Leukozyten mit der Alprazolam Clearance vor und nach fünftägiger Rifampicin Behandlung bei 96 Probanden

(Spearmans Korrelationskoeffizient für Tag 2: r = -0.224; p = 0.028; r2 = 0.050; Tag 7: r = -0.189; p = 0.033; r2 = 0.036)

Die Messungen auf der mRNA Ebene unter Kontrollbedingungen korrelierten nicht mit den Messungen der Alprazolam-Clearance (Abbildung 37). Stattdessen ist eine minimale inverse Korrelation sichtbar. Eine Adjustierung der Werte der Alprazolam-Konzentration auf das Körpergewicht brachte keine Verbesserung der Signifikanz. Nach Behandlung mit Rifampicin war ebenfalls keine Korrelation der beiden Messreihen sichtbar (Abbildung 37). Der Faktor der Zunahme der CYP3A4 mRNA korrelierte nicht mit errechneten Clearance von Alprazolam bei 96 gesunden Probanden nach der fünftägigen Behandlung mit Rifampicin (Korrelationskoeffizient nach Spearman r = -0.155, p = 0.066, n.s.; Bestimmtheitsmaß r2 = 0.024).

Des weiteren wurde ein möglicher Einfluss des Geschlechts auf die Expression von CYP3A4 mRNA in der peripheren Blutbahn, die Aktivität des Enzyms sowie die Induzierbarkeit untersucht. In Tabelle 19 sind die Ergebnisse der Korrelationsversuche nach Spearman aufgelistet und belegen, dass es keinen Zusammenhang zwischen dem Geschlecht und der Expression/Aktivität von CYP3A4 gibt. In den Stängel-Blatt-Diagrammen in Abbildung 38 ist die Korrelation des Ausmaßes der Induktion der CYP3A4 Expression und des Alprazolamstoffwechsels mit dem [Seite 63↓]Geschlecht verdeutlicht.

Tabelle 19: Korrelation des Geschlechts mit der CYP3A4 mRNA Expression und Alprazolam Konzentration

 

Median

Korrelation mit Geschlecht

Männlich (n = 61)

Weiblich (n = 35)

Alprazolam Konzentration Tag2
[µg/l]

8.09

8.58

r = -0.027
p = 0.797

Alprazolam Konzentration Tag7
[µg/l]

1.65

1.68

r = -0.031
p = 0.765

Induktion der Aktivität

5.49

4.73

r = 0.014
p = 0.892

mRNA Konzentration Tag2
[Moleküle/ng RNA]

28.01

28.86

r = 0.096
p = 0.354

mRNA Konzentration Tag7
[Moleküle/ng RNA]

54.21

49.46

r = 0.135
p = 0.189

Induktion der Expression

1.79

1.56

r = 0.043
p = 0.681

Abbildung 38: Stängel-Blatt-Diagramme zur Korrelation der Induktion von CYP3A4 mit dem Geschlecht

A: Korrelation des Faktors der CYP3A4 mRNA Induktion mit dem Geschlecht.
B: Korrelation des Faktors der Induktion der Alprazolam-Elimination (gemessen durch Alprazolam Konzentration) mit dem Geschlecht.

Um pharmakogenetische Einflüsse auf den Stoffwechsel von Alprazolam und die CYP3A4 mRNA Konzentration in den Leukozyten zu überprüfen, wurden die in den letzten Jahren als relevant beschriebenen erblichen Polymorphismen in den Genen CYP3A4 und CYP3A5 untersucht. Das CYP3A4*1B Allel wurde von Rebbeck et al [115] beschrieben und stellt eine Promotorvariante (-392 A>G) dar. In der kaukasischen Population wurde das Allel mit einer Frequenz von 3.6 % gefunden [187]. Das CYP3A4*1B Allel [107, 110] lag in 4 Individuen heterozygot vor (s. Tabelle 8). Es gab keine Unterschiede in der Pharmakokinetik von Alprazolam oder CYP3A4 mRNA Gehalt im Vergleich zu den Trägern des CYP3A4*1A Wildtyp-Allels. Um den möglichen Einfluss auf die Induzierbarkeit zu bewerten, wurde das Verhältnis der Alprazolam Konzentrationen ohne Rifampicin zu den Werten nach Induktion bestimmt. Der Median betrug 4.8 in den Trägern des Wildtyp-Promotor-Allels und 3.7 in den 4 Probanden, die das CYP3A4*1B Allel trugen, der Unterschied war statistisch nicht signifikant, was durch die Häufigkeitsverteilung der Allele in [Seite 64↓] Abbildung 36 verdeutlicht wurde.

Tabelle 20: Verteilung der untersuchten Genotypen mit den Alprazolam Konzentrationen und CYP3A4 mRNA Gehalt

Genotyp

n

Alprazolam 10 h Konzentration
[µg/l] Median (Bereich)

CYP3A4 mRNA
[Moleküle/ng RNA]

Vor Rifampicin Induktion

Alle

96

8.1 (4.5-14.6)

28.3 (10.2-128.0)

CYP3A4*1B

4

6.8 (5.7-9.7)

30.1 (26.6-41.3)

CYP3A4*3

1

6.6

49.3

CYP3A5*1

6

8.0 (6.1-11.7)

30.0 (25.2-47.4)

CYP2C19*1/*1

70

7.9 (4.5-13.2)

28.2 (10.2-112.8)

CYP2C19*1/*2

22

9.0 (5.9-14.6)*

28.7 (13.0-128)

CYP2C19*2/*2

3

8.8 (6.8-8.8)

44.2 (15.5-67.9)

Nach Rifampicin Induktion

Alle

96

1.7 (0.4-4.1)

50.0 (9.2-483.6)

CYP3A4*1B

4

1.8 (1.2-2.7)

51.0 (25.6-75.7)

CYP3A4*3

1

1.12

43.9

CYP3A5*1

6

1.5 (1.0-2.5)

60.8 (25.6-75.7)

CYP2C19*1/*1

70

1.7 (0.3-4.1)

51.2 (9.2-218.4)

CYP2C19*1/*2

22

1.5 (0.6-3.4)

48.4 (24.1-483.6)

CYP2C19*2/*2

3

1.6 (1.5-2.2)

59.4 (26.7-66.0)

* statistisch signifikant nach Vergleich mit CYP2C19*1/*1 (p=0.038)

Das Allel CYP3A4*3 wurde von Sata et al. [199] beschrieben und verursacht einen Aminosäureaustausch (Met445Thr). Es handelt sich hierbei um eine Punktmutation im Exon 12 (1334 T>C). Das Allel CYP3A4*3 wurde in einer einzigen Probe heterozygot vorgefunden. Die Alprazolam Konzentration dieses Probanden lag über dem 85. Perzentile (P79: 11.6 µg/l), während der CYP3A4 mRNA Gehalt nach Behandlung mit Rifampicin abnahm (Tabelle 20).

Die CYP3A5*1-Variante des CYP3A5 Gens wurde ebenfalls untersucht und in 6 Probanden in heterozygoter Form gefunden (Tabelle 20). Inzwischen ist bekannt, dass nur die Träger mindestens eines CYP3A5*1 Allels ein intaktes CYP3A5 Protein exprimieren [200]. Die Allelhäufigkeit liegt bei rund 5 % in der kaukasischen Population [102]. Der Median der 10-h Konzentration von Alprazolam in Probanden mit einem aktiven CYP3A5 Allel unterschied sich nicht von den anderen Individuen (8.0 µg/l gegen 8.1 µg/l).

Das CYP2C19*2 Allel wurde von De Morais et al. beschriebenen [201] und stellt eine Punktmutation im Exon 5 dar (681 G>T), die in einer Verlagerung der Spleißstelle resultiert. Durch die Verschiebung des Leserahmens entsteht ein verfrühtes Stop-Codon, was ein verkürztes Protein ohne Häm-Bindungsstelle zu Folge hat. Sollte eine Beteiligung von CYP2C19 am Alprazolam-Stoffwechsel vorliegen, wäre dies an erhöhten Alprazolam-Konzentrationen bei Trägern der Mutation zu erkennen. Diese häufigste und funktionell defekte Mutation des CYP2C19 zeigte eine Häufigkeitsverteilung von 3.1 % homozygoter Träger (Genotyp CYP2C19*2/*2), 22.9 % Heterozygoter (CYP2C19*1/*2) sowie 72.9 % Träger des Wildtyp-Allels CYP2C19*1/*1, was mit den für die Kaukasier bereits beschriebenen Daten übereinstimmt [202, 203]. Die Konzentrationen von Alprazolam in heterozygoten Trägern lag zwischen 10 und 20 % höher als in homozygoten Trägern des Wildtyp-Allels am Tag 1 und 22 (p = 0.038). Die Mediane der 3 Langsammetabolisierer unterschieden sich nicht signifikant von den anderen Teilnehmern (Tabelle 20). Die unterschiedlichen CYP2C19 Genotypen hatten keinen Einfluss auf das Ausmaß der Rifampicin Induktion.


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20.10.2004