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6  Diskussion

Die Messungen der CYP-P-450-Aktivität sind entscheidend für die Einschätzung der Wirkungsdauer und Bioverfügbarkeit der Pharmaka sowie zur Verhinderung der Nebenwirkungen. In den letzten Jahren sind verschiedene in vitro Techniken entwickelt worden, um die Aktivität der Cytochrom-P450-Enzyme zu bestimmen [203]. Es werden humane oder tierische Lebern, Hefen, Bakterien oder Insekten für die Untersuchungen herangezogen. Die Bestimmung der Metabolite oder der durch die HPLC ermittelten Abnahme der Testsubstanz lässt Rückschlüsse auf die Enzymaktivität ziehen. Zum anderen können Untersuchungen auf der mRNA Ebene durchgeführt werden. Diese liefern Aussagen über den Expressionsstatus der untersuchten Gene, der meist mit der Aktivität des Genproduktes direkt korreliert.

6.1 RNA Analytik mittels RT-PCR

In der vorliegenden Arbeit wurden mehrere PCR-basierende Verfahren zur Bestimmung des Expressionsstatus einiger Gene, die am Metabolismus bzw. Transport der Arzneistoffe maßgeblich beteiligt sind, entwickelt.

Eine Besondere Herausforderung stellte die Etablierung einer quantitativen RT-PCR Methode zur Bestimmung der CYP3A4 mRNA Konzentration in mononukleären Zellen der peripheren Blutbahn dar. Nach zahlreichen erfolglosen Versuchen mit unterschiedlichen Primerpaaren und verschiedenen Detektionsverfahren (Flachbett-Elektrophorese, Polyakrylamidgel-Elektrophorese, Kapillarelektrophorese mit Fluoreszenzdetektion) wurde das Verfahren der PCR in Echtzeit herangezogen und stellte die optimale Lösung dar.

Die Technologie der RT-PCR in Echtzeit ermöglicht korrektes und sensitives Quantifizieren auch sehr geringer Anzahlen mRNA Kopien. Es wurde von einer Sensitivitätsgrenze von 10 Kopien cDNA berichtet [204, 205, 206]. Bei geringer Ausgangsmenge an gesuchter mRNA können bereits geringe Abweichungen von den gewählten Reaktionsbedingungen, ob während der RNA Extraktion oder der Reversen Transkription zu starken Differenzen und Verfälschungen in den Ergebnissen der PCR führen, da sie während des letzten Schrittes millionenfach amplifiziert werden. Die hergestellte externe Standard-RNA kann als Kontrolle der beiden RT-PCR Schritte genutzt werden, da sie parallel zu der nativen RNA transkribiert und später vervielfältigt wird. Aufgrund der Sequenz- und Primeridentität waren die Reaktionsbedingungen für Standard und CYP3A4 mRNA gleich.

Außerdem ergibt sich für die quantitative RT-PCR in Echtzeit ein weiterer entscheidender Vorteil, denn während man bei der herkömmlichen PCR mit anschließender Detektion mittels Elektrophorese für jede Reaktion zunächst ermitteln muss, wann die Amplifikation im exponentiellen Bereich verläuft und bei welchem Zyklus sie diesen verlässt, erübrigt sich diese Frage in dem Echtzeit-Verfahren. Für eine verlässliche Ergebnissammlung ist es notwendig, die im exponentiellen Abschnitt der Reaktion vorzunehmen, wenn sich das Produkt in jedem Zyklus verdoppelt. Um die Konzentration der eingesetzten Matrize bestimmen zu können, bietet die Echtzeit-Technologie die Möglichkeit diese mit den Fluoreszenzsignalen, die während der PCR entstehen zu korrelieren. Die LightCycler Software stellt hierzu zwei Prinzipien zur Verfügung. Zum einen kann man den Schwellenwert der Fluoreszenz definieren, also den Zyklus, in dem die Signale die Basislinie verlassen. Da die Sensitivität der Echtzeit-Geräte bei etwa 100 Kopien liegt, nimmt diese Methode an, dass alle Proben dieselbe, relativ hohe DNA Konzentration haben und verlangt eine manuelle Definition der exponentiellen Phase der Vervielfältigung. In der vorliegenden Arbeit wurde die Methode der zweiten Ableitung gewählt. Hier wird die Form der Kurve ausgewertet, genauer der Scheitelpunkt an dem die Kurve den Hintergrund verlässt.

Die Wahl der geeigneten Primer stellte den kritischen Punkt des Verfahrens dar. Da inzwischen vier Mitglieder der Subfamilie mit großer Sequenzhomologie bekannt sind: CYP3A4, CYP3A5, CYP3A7 und CYP3A43 [93, 96, 97], mussten Primer gefunden werden, die zum einen spezifisch für die zu untersuchte mRNA waren und sich zum anderen sehr effizient in der PCR verhielten. Zu diesem Zweck wurden mehrere Möglichkeiten untersucht und die besten Ergebnisse zeigten die beiden gewählten Oligonukleotide. Da die Primer das Intron 12 des CYP3A4 Gens umspannen, konnte eine Unterscheidung zwischen cDNA und genomischer DNA gesichert werden.

Mehrere Autoren haben bereits versucht, CYP3A4 mRNA in Leukozyten nachzuweisen und kamen zu teilweise widersprüchlichen Ergebnissen (Tabelle 21). Die Arbeitsgruppen um Janardan und Hukkanen [101, 108] konnten mit herkömmlichen Methoden in konventionellen PCR-Maschinen [Seite 66↓]und Detektion in Agarosegelen keine CYP3A4 mRNA in Leukozyten nachweisen, während Nakamoto und seine Kollegen [103] über ein relatives Quantifizieren zur β-Aktin mRNA CYP3A4 detektiert haben. Allerdings befanden sich beide Primer im selben Exon, wodurch mögliche Kontaminationen mit genomischer DNA von der mRNA nicht zu unterscheiden wären. Minimale Mengen an CYP3A4 wurden von Krovat et al. beschrieben [104], die eine quantitative kompetitive RT-PCR in konventionellen PCR-Maschinen gewählt haben. Die gemessenen Mengen befanden sich am Detektionslimit des Verfahrens. Vor kurzem wurde ein Bericht veröffentlicht, in dem erwähnt wurde, dass keine CYP3A4 mRNA detektiert werden konnte, obwohl ein Echtzeit-PCR-Gerät benutzt wurde [97]. In dem Fall könnte man die Hypothese aufstellen, dass es an der Degradierung der mRNA im 5‘ Bereich liegen könnte, denn die gewählten Primer flankierten ein Fragment eben in dieser Region. Generell beginnt der kontrollierte Abbau der mRNA vermittelt durch Sequenzelemente in der nicht-translatierten Region (UTR) am 5‘- bzw. am 3‘-Ende [207]. Theoretisch wäre es möglich, dass die Primer, die für den 5‘-Bereich spezifisch sind kein Produkt bzw. sehr wenig liefern können, weil dort die mRNA bereits degradiert ist.

Tabelle 21: Literaturvergleich der Primer zur Detektion von CYP3A4 mRNA in Leukozyten.

RT
Primer

Position der Primer
in EMBL X12387

Genom. DNA
Exon

Methode

Quantifizierung

mRNA Menge
Leukozyten Leber

Lit.

 

 

dT(12-18)

1354

1706

12-13

Konventionell (45 Zyklen)

keine

0

ja

[101, 208]

dT(12-18)

1258

1562

11-13

Konventionell

Relativ zu ß-Aktin

0

ja

[108, 209]

dT(12-18)

867

995

9-10

Konventionell

Kompetitiv zu Standard RNA

8 - 13

4.79 x103
[Kopien/ng]

[104, 210]

Random 9mers

1173

1279

11

Konventionell

Relativ, kompetitiv zu ß-Aktin

Ja

untersucht nicht

[103]

Keine Angaben

749

855

8-9

ABI7700

Relativ, kompetitiv zum house-keeping Gen

0

11-15**

[97]

dT(15)

1375

1522

12-13

LightCycler

Absolute

38

3 x 105

[197]

Wenn man annimmt, dass eine humane Zelle im Durchschnitt 10 bis 30pg Gesamt-RNA enthält, was einer mRNA Molekülzahl von 0.2 bis 1 x 106 entspricht, würde der Gehalt von 0.5 Kopien CYP3A4 mRNA pro Zelle abgeschätzt. Diese spekulativen Annahmen bedeuten wiederum, dass lediglich jedes zweite Leukozyt CYP3A4 mRNA exprimiert. Die Gruppe um Krovat fand bereits geringe Mengen an CYP3A4 mRNA in Leukozyten [104], was in der vorliegenden Arbeit bestätigt werden konnte. Diese minimale Präsenz könnte man über die Zelldifferenzierung erklären. Es konnte gezeigt werden, dass das CYP3A Protein in B Lymphozyten exprimiert wird und nicht in T Lymphozyten [102].

Methoden zum Quantifizieren von CYP3A4 sind von wachsender Bedeutung, denn viele Arzneimittelwechselwirkungen können auf die Induktion der CYP3A4 Transkription zurückgeführt werden [93, 94, 99]. CYP3A4 ist am Stoffwechsel der Mehrzahl der Medikamenten beteiligt [95] und kann von einer großen Anzahl an Substanzen induziert werden, wie zum Beispiel den Barbituraten, Glukokortikoiden oder Rifampicin. Die Interaktionen betreffen somit vor allem Patienten, die sich einer Mehrfachtherapie unterziehen müssen und eben diese könnten von der Bestimmung des Expressionsstatus des Enzyms profitieren. Konventionelle in vivo Messungen der CYP3A4 Aktivität benötigen den Einsatz einer zusätzlich verabreichten Testsubstanz, über deren Metabolite die Aktivität des verstoffwechselnden Systems geprüft werden kann. In standardisierten HPLC Verfahren haben sich Alprazolam und Midazolam als Testsubstanzen bewährt [187, 211].

6.2 Untersuchungen zur Genexpression in Zellkulturen

Da die primären Hepatozyten des Menschen nur schwer zugänglich sind und nicht vermehrt werden können, weicht man in der Praxis gerne auf die immortalisierten Zellkultursysteme aus. In dem Fall muss jedoch der Eignungsgrad der gewählten Zelllinie geprüft werden. Die Zellkulturen [Seite 67↓]stellen ein künstliches Modellsystem zu Expressionsuntersuchungen dar, die Ergebnisse können nicht direkt auf biochemische Verhältnisse im Organismus übertragen werden, was auch an den Unterschieden in den Expressionsmustern zwischen den einzelnen Zelllinien zu sehen ist.

In der Arbeit von Krovat et al. wurden verschiedene humane Zelllinien in Hinsicht auf ihre Induzierbarkeit untersucht [104]. Es wurde demonstriert, dass beispielweise das CYP3A4 in der HepG2 Zelllinie in größeren Mengen vorhanden ist, während die Zelllinien HeLa, HL60 und THP kaum CYP3A4 mRNA exprimierten. Die CYP1A2 mRNA konnte nur in HepG2-Zellen nachgewiesen werden, während die CYP1A1 mRNA in mehreren Zelllinien exprimiert wurde. Die Gruppe um Engman hat verschiedene Zelltypen intestinalen Ursprungs untersucht [212]. Auch hier wurde die MDR1 mRNA in allen untersuchten Zellen in großen Mengen gefunden, während die CYP3A4 und CYP3A5 mRNAs entweder sehr schwach oder gar nicht exprimiert wurden. Erst eine Vorbehandlung mit dem Induktor Vitamin D3 führte zu starker CYP3A4 Expression. Die Zelllinie HepG2 wurde bereits mehrfach zu Expressionsuntersuchungen herangezogen [120, 213, 214, 215, 216, 217, 218]. Die HeLa-Zellen wurden bereit als geeignetes in vitro System für Untersuchungen zur Induktion der CYP1A1 Expression durch Medikamente charakterisiert [55] und deshalb auch in den hier vorgestellten Experimenten genutzt.

In der vorliegenden Arbeit wurden mehrere Zelllinien auf ihre Eignung für die Induktionstests mit der CYP3A4 und MDR1 mRNA untersucht (Tabelle 14). Obwohl die Zellkultur ein in vitro System maligner Zellen darstellt, konnte man an der Höhe der mRNA Konzentrationen von CYP3A4 und MDR1 gut die ursprüngliche Herkunft des Gewebes erkennen. Es ist bekannt, dass CYP3A4 hauptsächlich in der Leber exprimiert wird [219] während MDR1 in hohen Mengen im Darmgewebe gefunden wurde [176, 220]. Die vorliegenden Ergebnisse belegen die starke Expression von MDR1 in Zellen dermalen Ursprungs und zeigen, dass CYP3A4 zum einen vor allem im Lebergewebe exprimiert wird und zum anderen, dass die Zellkulturen die CYP3A4 mRNA Menge im Vergleich zu nativen Geweben stark reduzieren. Untersuchungen an primären Hepatozyten haben gezeigt, dass CYP3A4 das Cytochrom-P450 darstellt, welches am schnellsten in der Zellkultur in seiner Expression degradiert wird [221]. Andere Versuche mit primären Hepatozyten zeigten, dass nach fünftägiger Kultivierung die CYP3A4 mRNA Konzentration um das 80 bis 300-fache abnahm [222]. Im Vergleich zu CYP3A4 wurde die MDR1 mRNA in allen untersuchten Zellkulturen in größeren Mengen wiedergefunden.

Die HepG2-Zellen synthetisierten in den ersten Passagen noch relativ hohe Mengen an CYP3A4 mRNA, die Konzentrationen reduzierten sich drastisch mit zunehmender Passagenzahl. Es wurde auch von anderen Cytochrom-P450-Enzymen berichtet, die in Zellen mit hohen Passagenzahlen herunterreguliert waren. Das CYP1B1 Enzym wurde in einer Zellkultur muriner Fibroblasten nach der 7. Passage parallel zur langsameren Proliferation nicht mehr exprimiert, obwohl die jungen Zellen starke CYP1B1 Expression aufwiesen [223]. Untersuchungen an humanen Fibroblasten demonstrierten, dass die Expression einiger Moleküle der intrazellulären Signaltransduktion mit zunehmender Passagenzahl reduziert wurde [224]. Die primären Zellen der epidermalen Keratinozyten der Ratte verlieren die Induzierbarkeit des CYP1A1 Enzyms nach ungefähr 15 Passagen, was durch Wechselwirkungen von mindestens zwei spezifischen Transkriptionsfaktoren erklärt wird [225]. Ein Vergleich von jungen endothelialen Zellen (Passage 3) mit alten demonstrierte, dass die mRNA Synthese zweier Untereinheiten der mitochondrialen Cytochrom-C-Oxidase nach Passage 45 um 46 und 37% reduziert war [226]. Die Regulation der CYP3A4 Expression scheint in den HepG2-Zellen nach ca. 11 Passagen auf ein Minimum reduziert zu sein.

Das Lösungsmittel spielt bei den Inkubationsversuchen eine entscheidende Rolle. Ein Vielfach eingesetztes Lösungsmittel, das Dimethylsulfoxid weist zum einen zytotoxische Effekte auf und zum anderen verursacht es selbst eine leichte Induktion der Gene [227]. In der vorliegenden Arbeit wurden alle Substanzen in Methanol gelöst und die Lösung auf die Zellkulturplatten vorgelegt. Die Zellen und das Medium wurden erst nach dem Verdampfen des Lösungsmittels zugegeben, weil Methanol toxisch ist. Durch die Wahl des Methanols konnten alle Substanzen im gleichen Lösungsmittel verdünnt werden, was einen Vergleich der Messungen vereinfacht.

Die Testsubstanzen wurden in sehr unterschiedlichen Konzentrationen verwendet. Für jede Substanz wurden meistens vier verschiedene Konzentrationen gewählt, wobei versucht wurde auch Konzentrationen aus dem therapeutischen Bereich zu wählen, um sich den Vorgänge in vivo zu nähern. Die antiretroviralen Mittel werden in der Therapie in unterschiedlich starken Tagesdosen eingesetzt, entsprechend variierten die getesteten Konzentrationen. Ein extremes Beispiel stellt Zalcitabin dar, das eine Tagesdosis von 2.25 mg hat. Im Vergleich, Abacavir, das auch zu den nukleosidischen Reverse Transkriptase Inhibitoren gehört, wird in einer täglichen [Seite 68↓]Dosis von 600 mg verabreicht. Um die Tagesdosen auf das Modelsystem Zellkultur übertragen zu können, muss das Verteilungsvolumen berücksichtigt werden. Der Mensch hat durchschnittlich etwa 20 l extrazelluläre Flüssigkeit, die Zellen waren in 2 ml inkubiert, also wurden die Mengen entsprechend umgerechnet. Es wurde nicht das apperente Verteilungsvolumen jeder Substanz (Tabelle 22) herangezogen, da dieses mit systemischen Begebenheiten zusammenhängt (es ergibt sich aus der Gesamtmenge des injizierten Arzneistoffes dividiert durch die Konzentration im Gesamtplasma), die in der Zellkultur nicht nachgestellt werden können. Durch die Testreihen aus vier verschiedenen Konzentrationen sollte sichergestellt werden, dass ein eventuell vorhandenes Induktionspotential erfasst werden kann.

Die intrazellulären Konzentrationen in vivo können sich von den in vitro gemessenen aufgrund von ungleichen Verhältnissen in der Bioverfügbarkeit unterschieden. In den hier verwendeten Verfahren wurden Serum-Konzentrationen von 5 bzw. 10% genutzt. Die meisten der antiretroviralen Mittel gehen mit Plasmaproteinen (Albumin, α1-Glykoproteine) hydrophobe Wechselwirkungen in einem sehr starken Ausmaß (Tabelle 22) ein. Delavirdin, Efavirenz sowie die Proteaseinhibitoren mit Ausnahme von Indinavir binden mit mehr als 90 % an die Plasmaproteine. Diese Effekte können in einem in vitro System nicht berücksichtigt werden. Saquinavir hat eine Bioverfügbarkeit von 4 %, die zum einen durch eine unvollständige Resorption und zum anderen durch hohen first-pass Metabolismus bedingt ist. Beide pharmakokinetischen Eigenschaften treffen auf Bedingungen in Zellkultur nicht zu, was wiederum die zytotoxischen Effekte des Medikamentes bei der Tagesdosis erklärt. Hier ist auch anzunehmen, dass die beobachteten Induktionseffekte in vivo unbedeutend sind. Zum anderen können die intrazellulären Konzentrationen der Medikamente in vivo beträchtlich höher ausfallen aufgrund der intrazellulären Akkumulation der zumeist lipophilen Komponenten.

Tabelle 22: Einige Parameter zur Pharmakokinetik der untersuchten antiretroviralen Mittel

Substanz

HWZ [h]

Bioverfügbarkeit [%]

Pb [%]

Vd [l/kg]

Abacavir

1.5

83

49

0.8

Didanosin

1.5

42

<5

1.08

Lamivudin

5 – 7

80 – 85

<36

1.3

Stavudin

1.3 – 1.4

86

< 5

0.66

Zalcitabin

2

> 80

<4

0.53

Zidovudin

1.1

60 – 70

34 – 38

1.6

Delavirdin

6

Nicht ermittelt

98

0.7

Efavirenz

45

Nicht ermittelt

> 99

2.4

Nevirapin

25 – 30

~ 93

~ 60

1.21

Amprenavir

7 – 10

Nicht ermittelt

90

6.1

Indinavir

2

~65

60

0.4 – 1.74

Lopinavir

5 – 6

Nicht ermittelt

98 – 99

Nicht ermittelt

Nelfinavir

3 – 5

70 – 80

≥98

2 – 7

Ritonavir

3 – 5

Nicht ermittelt

97

0.3 – 0.6

Saquinavir

7 – 12

4

97 – 98

9.9

HWZ: Halbwertszeit, bezieht sich auf die Mehrfachdosis
Pb: Bindung an die Plasmaproteine
Vd: apparentes Verteilungsvolumen
Quelle: http://www.hiv-druginteractions.org/

Die AhR vermittelte Induktion wurde in 14 antiretroviralen Mitteln untersucht. Wie in Abbildung 39 zusammengefasst, lassen sich die getesteten Substanzen in bezug auf ihre Effekte grob in drei Gruppen unterteilen: von Nicht-Induktoren, wie Stavudin, Didanosin, Abacavir und Efavirenz, über schwach effiziente Induktoren, z. B. Amprenavir und Zidovudin, zu den stark potenten Induktoren, wie Indinavir, Zalcitabin, Nelfinavir and Saquinavir. Darüber hinaus ist die unterschiedliche Ansprechbarkeit der beiden untersuchten mRNAs auf die Inkubationen mit den Medikamenten [Seite 69↓]hervorzuheben. In manchen Fällen, wie z.B. nach Inkubationen mit Abacavir, Amprenavir, Kaletra und Indinavir, stimmten die Veränderungen in der Expression der CYP1A1 mRNA mit denen von CYP1B1 mRNA überein. In den übrigen Testreihen (Abbildung 39) entstanden Diskrepanzen zwischen CYP1A1 und CYP1B1 in der Induzierbarkeit. Die statistisch signifikante Induktion der CYP1B1 mRNA fiel in acht Fällen stärker aus als die der CYP1A1 mRNA. Generell lässt sich aus den dargelegten Resultaten schließen, dass die AhR regulierte Gen-Batterie einer Induktion durch die älteren Proteaseinhibitoren und Zalcitabin unterliegt, das Ausmaß muss jedoch genspezifisch individuell geprüft werden.

Abbildung 39: Der maximale Induktionseffekt der antiretroviralen Mittel auf die mRNA Expression von CYP1A1 und CYP1B1.

Die statistisch signifikanten Veränderungen in der Expression sind mit einem Stern (*) gekennzeichnet.

Die Daten in Abbildung 39 zeigen, dass die AhR vermittelte Induktion von CYP1A1 nicht direkt auf die anderen AhR-regulierten Gene, wie das CYP1B1, übertragen werden kann. Neben dem Aryl-Kohlenwasserstoff-Rezeptor sind offensichtlich noch andere Signale in die Expression der beiden Gene eingebunden. Diese Ergebnisse unterstützen frühere Aussagen, nach denen beide Gene über verschiedene Regulationsmuster verfügen [86, 228, 229, 230, 231]. In einer vom Chorion-Karzinom abgeleiteter Zelllinie wurde eine bis zu 9000-fache Induktion der CYP1A1 mRNA nach Behandlung mit Dioxin gemessen, während die CYP1B1 mRNA Expression unverändert blieb [86]. In Epithelzellen der Brust sowie Tumorzelllinien wurde beobachtet, dass die Induzierbarkeit von CYP1A1 sich auf Zellen mit Epithel-Morphologie beschränkte während die CYP1B1 Induzierbarkeit auch in Zellen des Mesenchyms festgestellt wurde [228]. TCDD induzierte CYP1A1 und CYP1B1 mRNAs in der A549 Adenokarzinoma Zellkultur 56-fach bzw. 2.5-fach. Genistein und Staurosporin hemmten die TCDD-bedingte Induktion von CYP1A1, aber nicht die von CYP1B1 [230]. Im Gegensatz zum Cyp1a1 der Maus, werden Cyp1b1 mRNA und Protein in Zellen glatter Gefäßmuskulatur unter konstitutiven Bedingungen sowie nach Induktion exprimiert, unabhängig vom AhR-Phänotyp und Entwicklungsstadium [231]. Die Autoren machen unterschiedliche Faktoren für die veränderte Regulation von CYP1A1 und CYP1B1 verantwortlich. Der Verlust der Expression des Östrogen-Rezeptors wurde mit einer schwächeren Dioxin bedingten Induktion der [Seite 70↓]CYP1A1 Expression assoziiert, während die basale Expression von CYP1B1 und seine Induzierbarkeit verstärkt waren [229]. Kerzee und Mitarbeiter konnten nachweisen, dass der AhR Phänotyp und das Mitose-Stadium für die unterschiedlichen Expressionsmuster von muriner Cyp1a1 und Cyp1b1 mRNA verantwortlich sind [231]. In den vorgestellten Versuchen war die Induktion des CYP1B1 Gens durchschnittlich stärker ausgeprägt als die von CYP1A1. Dies könnte auch in der extrem kurzen Halbwertszeit der CYP1A1 mRNA von 2.4 h begründet liegen [83], durch die eine kürzere Induktionswirkung verursacht sein kann als bei länger stabilen mRNAs der anderen Cytochrom-P450-Enzyme, wie des CYP2E1 von mehr als 24 h.

Da Kaletra eine Mischung aus Lopinavir und Ritonavir ist (eine Kapsel beinhaltet 133 mg Lopinavir, ca. 33 mg Ritonavir sowie einige Resorptions-unterstützende Mittel), ist auch diese Substanz bei den Induktionseffekten zu berücksichtigen. In der klinischen Praxis wird die pharmakologische Wirkung des Präparates nur auf Lopinavir zurückgeführt, da die Ritonavir-Moleküle das CYP3A4 Enzym inhibieren [232]. Diese „Aufgabenteilung“ lässt sich nicht auf die Bedingungen in der Zellkultur übertragen, denn die Aktivität der Enzyme wurde nicht untersucht. Kaletra wies sich als ein eher schwacher Induktor der beiden untersuchten Gene aus, woraus man schließen kann, dass die beobachteten Effekte auf den Anteil von Ritonavir zurückzuführen sein könnten.

Es ist bisher unbekannt, inwiefern CYP1A1 und CYP1B1 in den Stoffwechsel der antiretroviralen Medikamente involviert sind. Da CYP1A1 und CYP1A2 am 5‘ Terminus über ein gemeinsames regulatives Segment verfügen [65], kann man annehmen, dass sich die Resultate der CYP1A1 mRNA Messungen der Induktionsversuche auf die Expression der CYP1A2 mRNA übertragen lassen. Dieses Enzym spielt in der Leber mit einem relativen Cytochrom-Gehalt von 12 % eine größere Rolle als CYP1A1, das lediglich 1 % der hepatischen Cytochrom-P450-Enzyme bildet. CYP1A2 nimmt am Stoffwechsel einer Vielzahl von Xenobiotika teil, unter anderem Koffein, Clozapin, Imipramin, Verapamil, Theophyllin und Phenacetin [233]. Überträgt man die Induktion von CYP1A1 auf das CYP1A2, so gewinnt die Koadministration der Psychopharmaka Amitriptilin, Clomipramin, Clozapin und Imipramin an Bedeutung, denn die Elimination dieser Wirkstoffe wäre durch die Induktion beschleunigt [234]. Die meisten der Medikamente sind auch Substrate anderer Cytochrom-P450-Enzyme [233]. Hinzu kommt, dass einige der antiretroviralen Mittel, wie Abacavir, Amprenavir, Efavirenz, Indinavir, Nevirapin und Zidovudin, im Phase II Metabolismus über die UDP-Enzyme glukuronidiert werden [9, 16, 24, 26]. Die UGT Gene können durch den AhR-Signalweg aktiviert werden, was wiederum in einer beschleunigte Elimination der betroffenen Wirkstoffe resultieren würde.

Die Induktion von CYP1A1 und CYP1B1 wird vor allem mit erhöhtem Krebsrisiko, verursacht durch Adduktbildung an der DNA, in Zusammenhang gebracht [61, 235]. Die durch die antiretrovirale Medikamente verursachte Induktion kann durch Zigarettenrauchen verstärkt werden, was auch das Krebsrisiko zusätzlich erhöht. Es wurde berichtet, dass erfolgreiche AIDS Therapie nach den HAART Richtlinien die Lebenserwartung der Patienten verbessert, gleichzeitig aber mit erhöhtem Risiko von Non-Hodkin’s Lymphoma und anderen mit HIV assoziierten Tumoren zu rechnen ist [236]. CYP1A1 und CYP1B1 werden vor allem in extrahepatischen Geweben exprimiert [68, 84] und die durch die Arzneimittel bedingte Induktion in diesen Geweben könnte die Entwicklung der mit HIV assoziierten Tumoren als zusätzlicher Faktor verursachen.

Die Induzierbarkeit der CYP1A1 mRNA hängt auch von den jeweiligen Genotypen ab. Untersuchungen an rekombinanten CYP1A1 Enzymen haben ergeben, dass die drei Varianten CYP1A1*1, *2 und *4 unterschiedliche enzymatische Aktivität in der Produktion des Diol-Metaboliten aus dem Benzo(a)pyren und dem mutagenen Diol-Epoxid-2 aus Benzo(a)pyren-7,8-dihydrodiol aufweisen [237], wobei das Allel CYP1A1*4 die stärkste enzymatische Aktivität in der Produktion der Diole hatte. Neben den Polymorphismen im CYP1A1 können funktionelle Veränderungen aller beteiligten Gene der AhR-Gen-Batterie für die Induktion entscheidend sein. Es ist bereits seit längerem bekannt, dass AHR polymorph auftritt [238]. Es wurde von zwei Mutationen im AHR berichtet, die in einem Ungleichgewicht aneinander gekoppelt sind. Es handelt sich hierbei um den Aminosäureaustausch von Valin zu Isoleucin am Kodon 570 (V570I) sowie von Prolin zu Serin am Kodon 571 (P571S). Die Kombination beider Allele tritt relativ selten auf und scheint vor allem die Afrikanische Population zu betreffen [239]. Interessant ist die Tatsache, dass im Fall dieses Genotypen eine Induktion von CYP1A1 nicht mehr stattfindet, was wiederum Konsequenzen für die kanzerogenen Effekte der polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffe hat. Auch andere auf diesem Weg regulierte Gene werden polymorph exprimiert und dadurch in ihrer Funktionalität beeinträchtigt. Hierzu gehören CYP1B1, CYP1A2 , GSTs und die schon erwähnten UGT-Gene [240, 241]. Da hier die Untersuchungen an einem immortalisierten [Seite 71↓]Zellkultursystem durchgeführt wurden, konnten die Polymorphismen nicht berücksichtigt werden.

Der Einfluss der antiretroviralen Mittel auf die PXR vermittelte Regulation der Expression von CYP3A4 und MDR1 wurde in den HepG2 und COLO-320 Zellen untersucht. Das Ausmaß der Induktion von CYP3A4 und MDR1 war in beiden untersuchten Zelltypen divergent. Die maximalen Effekte sind in Abbildung 40 zusammengefasst.

Abbildung 40: Die maximalen Induktionseffekte der untersuchten Substanzen auf die Expression der CYP3A4 und MDR1 mRNA in COLO-320 und HepG2-Zellkultur

* statistisch signifikante Veränderungen im Vergleich zu unbehandelter Probe
A: Induktion der CYP3A4 mRNA
B: Veränderungen in der Expression der MDR1 mRNA

Rifampicin, ein bekannter Induktor dieses Signalweges, diente als Referenzsubstanz. Die CYP3A4 mRNA in den HEPG2 Zellen wurde am stärksten induziert, um das 2.6-fache der Ausgangsmenge nach Inkubationen mit 38.9 µM. Bei höheren Konzentrationen sank der Effekt. Die Arbeitsgruppe um Sumida hat in den HepG2-Zellen eine CYP3A4 mRNA Induktion bedingt durch Rifampicin vom Faktor 8.4 gemessen [120]. Allerdings wurden die Versuche mit 50µmol/l Rifampicin durchgeführt, was dem 1.5-fachen der Tagesdosis entspricht. Die abweichenden Ergebnisse sind durch die Tatsache zu erklären, dass die Versuchansätze der Arbeitsgruppe sich von den hier vorgestellten stark unterschieden. So wurde zum Beispiel serumfreies Medium für die Inkubationsversuche benutzt, was einen höheren Faktor der Induktion bedingen könnte. Mit Reportergen-Konstrukten wurde die Expression des CYP3A4 maximal 3-fach induziert, als eine Promotorsequenz mit -13000 [Seite 72↓]bis +53 b gewählt wurde [123]. Entsprechende Konstrukte vom hPXR Gen zeigten sogar eine 50-fache Verstärkung der Expression, was die Bandbreite der möglichen Effekte abhängig von gewählten Bedingungen verdeutlicht.

Die Proteaseinhibitoren erwiesen sich in beiden Zelltypen als potente Induktoren sowohl von CYP3A4 als auch von MDR1 mRNA. In der Hepatoma Zelllinie induzierten alle sechs untersuchten Proteaseinhibitoren die Expression der CYP3A4 mRNA in folgender Reihenfolge: Amprenavir > Nelfinavir > Ritonavir > Saquinavir > Indinavir > Kaletra. Erstaunlicherweise zeigt sich hier Amprenavir als der stärkste Induktor. Auf die Expression von MDR1 mRNA wirkt diese Substanz wesentlich schwächer und erreicht Effekte von 1.4 in den COLO bzw.1.3 (nicht signifikant) in den HEPG2 Zellen. Diese Ergebnisse bestätigen im Jahr 2000 veröffentlichte in vitro Experimente, die die Proteaseinhibitoren Ritonavir, Amprenavir, Nelfinavir, Saquinavir und Indinavir (die Reihen­folge entspricht dem Ausmaß der Effekte) als Induktoren des MDR1 charakterisiert haben [28]. Die Unterschiede in der Stärke der Induktion sind durch die Wahl des Systems zu erklären. In der vorliegenden Arbeit konnte demonstriert werden, dass verschiedene Zellkulturen unterschiedlich auf die Medikamente ansprechen. Untersuchungen an Ratten haben eine Zunahme der MDR1 und CYP3A Protein Menge nach Behandlungen mit Amprenavir gezeigt [242]. Die Versuche wurden mit 139 und 450 mg/kg/Tag Substanz durchgeführt und die Effekte mittels Western blot im Darm und Lebergewebe beobachtet. Die Dosen entsprechen etwa 270 bzw. 900 µg Substanz, die in den hier vorgestellten Experimenten verwendet wurden. Die COLO-Zellen stammen aus dem Darm und die HepG2 aus der Leber. Die Gruppe um Huang notierte nach einer 14-tägiger Behandlung mit 450 mg/kg/Tag einen Anstieg des intestinalen MDR1 und des CYP3A in der Leber um 59 bzw. 151 %. Diese Effekte würden dem 1.4 bzw. 3.3-fachen maximalen Anstieg der entsprechenden mRNA Menge annähernd nahe kommen. Allerdings liegen die Konzentrationen, bei denen dieses Ergebnis beobachtet wurde deutlich unter den von Huang et al. [242] verwendeten. Dies lässt sich durch den Unterschied der in-vitro zu in-vivo Bedingungen erklären. Die 90 %-ige Bindung des Amprenavir (Tabelle 2) an die Plasmaproteine würde neben anderen Faktoren erklären, warum man höhere Dosen benötigt, um diese Effekte bei systemischer Anwendung zu erreichen. Dieselbe Arbeitsgruppe untersuchte auch das induktive Potential von Nelfinavir auf die Proteinmenge von CYP3A und MDR1 der Ratte. Die intestinale MDR1 sowie hepatische CYP3A Proteinmenge nahm nach 14-tägiger Behandlung der Ratten mit 175 mg/kg/Tag (entspricht etwa 350 µg in den hier vorgestellten Versuchen) um 83 bzw. 85 % zu [242]. Die in vitro Untersuchungen aus dieser Arbeit ergaben eine 1.6 bzw. 2.4-fache Induktion, und unterstützen die Aussage, dass die Zunahme der Proteinmenge auf einer erhöhten Transkriptionsrate der beiden Gene beruht. Es wurde auch berichtet, dass Ritonavir sowohl das P-Glykoprotein als auch das MRP1 Protein und deren Aktivität in Zellkultur induziert [243]. Die Untersuchungen wurden mittels Western blots durchgeführt und zeigten erhöhte Proteinmengen nach Behandlung mit dem Medikament. Die Induktion war konzentrationsabhängig und betrug im Fall von MDR1 das 6-fache der nativen Proteinmenge [243]. In der vorliegenden Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass die erhöhte Proteinmenge auf eine Zunahme der MDR1 mRNA zurückzuführen ist. In den HepG2-Zellen war Ritonavir mehr als zweifach stärkerer Induktor der Synthese der MDR1 mRNA als Rifampicin (Faktor 3.8 vs. 1.6). In der vorliegenden Arbeit konnte auch gezeigt werden, dass Kaletra (Lopinavir:Ritonavir, 4:1) die Expression von CYP3A4 in der Hepatoma Zelllinie signifikant um den Faktor 1.7 erhöht. Die Expression des untersuchten Transporters wurde nicht beeinflusst.

Da die Proteasehemmer sowohl über das MDR1 als auch über das MRP1 aus der Zelle transportiert werden [29, 244] resultiert eine Erhöhung der Aktivität der beiden Proteine in einer beschleunigten Elimination der Proteasehemmer aus den CD4+ T-Zellen [245].

Dexamethason, ein anderer typischer Induktor der durch PXR regulierten Transkription, induziert die Expression der Gene sowohl über den PXR als auch den GR, während Rifampicin bedingte Aktivierung eher über den PXR erfolgt [246]. Da die Proteaseinhibitoren Effekte ähnlich denen des Rifampicin auslösen, ist anzunehmen, dass auch diese Substanzen eine der möglichen Aktivierungen (PXR, GR CAR) favorisieren.

In vitro Untersuchungen an den Caco-2 Zellen haben eine 3.5-fache Induktion des MDR1 nach Inkubationen mit Nicht-Nukleosidischen Reverse Transkriptase Inhibitoren dokumentiert [22]. Die hier vorgestellten mRNA Messungen in den COLO-320 und HEPG2 Zellen wiesen keine induktiven Effekte von Nevirapin auf. Diese Divergenz könnte durch eine posttranskriptionell oder posttranlationell bedingte Zunahme der Aktivität des Proteins erklärt werden.

Inkubationen mit Efavirenz resultierten in einer verstärkten Synthese der CYP3A4 mRNA sowohl in den HepG2 als auch COLO-320 Zellen mit einem Faktor von 3.2 bzw. 1.7, während die [Seite 73↓]Konzentrationen der MDR1 mRNA unverändert blieben. Diese Ergebnisse unterstützen einen kürzlich erschienenen Bericht aus in vivo Untersuchungen, nach denen Efavirenz das hepatische CYP3A4 induzierte nicht aber das intestinale CYP3A4 und P-Glykoprotein [25]. COLO-320 Zellen sind intestinalen Ursprungs, zeigten in vitro jedoch eine vergleichbare Induktion in der Hepatoma Zellkultur. Bei der Induktion durch Efavirenz sind nach neuen Ergebnissen klinische Folgen zu erwarten, denn die durch Nelfinavir oder Indinavir ausgelöste Inhibition von CYP3A4 durch die Induktion ausgeglichen wurde [247]. Efavirenz hat in vivo eine Halbwertszeit von zwei bis drei Tagen (Tabelle 22), was Konsequenzen in der Dauer der Induktion hat, zum Beispiel wenn Substanzen mit kurzer HWZ verabreicht werden und plötzlich gegensätzliche Effekte auftreten. Störmer et al. berichten auch von 1.75 und 2.35-fachen Induktion bedingt durch Efavirenz bzw. Delavirdin [22]. Die beschriebene Induktion des MDR1 durch Efavirenz steht im Widerspruch zu den in vivo Ergebnissen und den hier vorgestellten Daten. Dagegen bedingten Inkubationen mit Delavirdin durchaus eine signifikante Erhöhung der Expressionsrate von CYP3A4 mRNA (2.2-fach) und eine relativ starke Induktion der MDR1 mRNA (3.3-fach) in der HepG2-Zellkultur .

Eine induktionsbedingte Überexpression des P-Glykoproteins kann in einer schnelleren Elimination der zu transportierenden Medikamente resultieren und die Entwicklung der Virusresistenz begünstigen. In Versuchen mit Nagern wurde bereits veranschaulicht, dass MDR1 die Bioverfügbarkeit der Proteaseinhibitoren beeinträchtigen kann. So zeigten die mdr1 defizienten Mäuse 2 bis 5-fach höhere Plasmakonzentrationen von Indinavir, Nelfinavir und Saquinavir [37]. Wie in anderen Experimenten an einer CD4+ Tumor-Zelllinie gezeigt wurde, nahm die Virusproduktion durch eine Überexpression des MDR1-Transporters ab, was an einer verminderten Fusion der viralen Membran mit der Plasmamembran und den nachfolgenden Schritten lag [248]. Einige Zellen, die hohe Mengen an MDR1 exprimieren, sind resistent gegenüber dem HIV. Insgesamt scheint jedoch die Induktion des Systems für den Krankheitsverlauf eher ungünstig zu sein und sollte vermieden werden. Durch das Abwägen und Kombinieren von induzierenden und hemmenden Substanzen lässt sich die Therapie optimieren.

Eine Hemmung von MDR1 führt zu einer höheren intrazellulären Konzentration der betroffenen Pharmaka, was möglicherweise in der Zukunft therapeutisch genutzt werden kann. Tierversuche mit radioaktiv markierten Proteaseinhibitoren zeigten, dass das Verabreichen eines MDR1 Inhibitors vor der Behandlung mit den PIs, die Penetrationskapazität der antiretroviralen Mittel ins Gehirn erhöhte [249].

Der MDR1 Polymorphismus wurde bereits mit unterschiedlichem Ansprechen auf die HIV-Therapie in Verbindung gebracht. Die stumme Mutation im Exon 26 (C3435T) stellt offensichtlich einen Vorteil für die antiretrovirale Therapie dar, denn die homozygoten Träger des mutierten Allels können eine höhere Zahl CD4+ Zellen aufweisen als die homozygoten Träger des Wildtyp-Allels [180]. Ein Zusammenhang der Mutation mit Induzierbarkeit des Systems wäre zu untersuchen.

Abbildung 41: Einfluss des C3435T Polymorphismus im MDR1 Gen auf die CD4+ Zellzahlen in AIDS-Patienten

Die Abbildung wurde der Arbeit von Fellay et al. entnommen [180].


[Seite 74↓]

Auf die Aktivierung der MDR1 Expression durch Fremdstoffe wurde bereits eingegangen. Das Gen unterliegt jedoch einer Vielzahl an Regulationsmechanismen [250]. Das Gen kann durch verschiedene Stresssignale heraufreguliert werden, wobei der Promotor durch die Transkriptionsfaktoren fos und jun trans-aktiviert wird. Die Proteinkinase C spielt offenbar ebenfalls eine Rolle an der Regulation der MDR1 Genexpression. Hinzu kommen die epigenetischen Faktoren, wie Beeinflussung der Deacetylierung der Histone und DNA Methylierung. Diese zusätzlichen Faktoren konnten in den in vitro Untersuchungen nicht berücksichtigt werden.

Zwischen CYP3A4 und MDR wurden Differenzen in der Ansprechbarkeit auf die Induktoren festgestellt. Es lässt sich dadurch erklären, dass beide Gene durch denselben Signalweg induziert werden. Wie Schuetz et al. zeigten, fiel die Induktion von CYP3A4 durch Rifampicin schwächer aus in Zellen, in denen das MDR1 in Folge einer Medikamentenselektion oder Transfektion mit MDR1 cDNA überexpriemiert wurde, als in der unbehandelten Zelllinie. Entsprechend sprach das CYP3A Protein der mdr1a (-/-) Mäuse stärker auf Rifampicin an als bei den mdr1a (+/+) Mäusen [251]. Sowohl die basale Expression als auch die enzymatische Aktivität von CYP3A waren höher in Mäusen, denen das eine oder beide MDR Allele gefehlt haben als in den Tieren mit dem intakten Gen [252].

Die Enzyminduktion ist ein Vorgang, der in Stimulation der Proteinbiosynthese resultiert und wird erst nach fünf bis zehn Tagen voll wirksam. Nach Absetzen des Induktors dauert die Stimulation entsprechend der Halbwertszeit desselben sowie der Proteine noch mehrere Tage an. In Folge der Enzyminduktion erhöht sich die Metabolisierungsrate der Arzneimittel, was zu einer schnelleren Ausscheidung der Pharmaka führt, die über das stimulierte System verstoffwechselt werden. Für die Therapie kann dieser Effekt gravierende Folgen haben, wobei insbesondere die Krankheiten betroffen sind, in denen man auf eine Mehrfachtherapie angewiesen ist. So muss eine induktions­bedingte Erhöhung der metabolischen Clearance gegebenenfalls durch eine Dosiserhöhung des betroffenen Arzneistoffes ausgeglichen werden. Im besonderen Fall von AIDS muss zusätzlich zur Arzneimittelinteraktionen beachtet werden, dass eine erhöhte Abnahme der Plasmakonzentration des Wirkstoffes in einer schnellen Resistenzentwicklung des Virus resultieren kann.

Die MDR1 mRNA war in der COLO-320 Zelllinie weniger stark induzierbar als dies unter gleichen Bedingungen in den HepG2-Zellen gezeigt wurde. Zum anderen reagierten die COLO-Zellen empfindlicher auf höhere, toxische Dosen der Medikamente als die HepG2 Kulturen. Obwohl die Zellen ein immortalisiertes System aufweisen, scheinen die COLO-320 Zellen dem Expressions­muster der Darmzellen zu folgen, während die in der Leber induzierten Gene die Induktion in den HepG2-Zellen steigerten.

Tabelle 23: Inhibierende und aktivierende Eigenschaften der untersuchten antiretroviralen Mittel auf pharmakologisch aktive Proteine

Substanz

Inhibitor

Induktor

Abacavir

  

Didanosin

 

Lamivudin

CYP1B1

Stavudin

 

Zalcitabin

CYP1A1, 1B1

Zidovudin

CYP1B1

Delavirdin

CYP3A4, 2C9, 2D6, 2C19, MDR1

CYP3A4, MDR1

Efavirenz

CYP2C9, 2C19, 3A4, MDR1

CYP3A4

Nevirapin

MDR1

CYP3A4

Amprenavir

CYP3A4

CYP3A4, MDR1

Indinavir

CYP3A4

CYP1A1, 1B1, 3A4, MDR1

Kaletra

 

CYP1B1, 3A4

Nelfinavir

CYP3A4, MDR1

CYP1A1, 1B1, 3A4, MDR1

Ritonavir

CYP3A4, 2D6, 2C9

CYP1A1, 1A4, 1B1, 3A4, GST, MDR1

Saquinavir

CYP3A4, 2C9, MDR1

CYP1A1, 1B1, 3A4, MDR1

Vergleicht man die Induktion von allen untersuchten mRNAs, lassen sich einige Parallelen ziehen. Die Proteaseinhibitoren wirkten in allen vier Genen induzierend, wobei die neueren Substanzen, [Seite 75↓]Amprenavir und Kaletra, bei der AhR vermittelten Induktion keine Rolle spielten. Zalcitabin gehörte zu den stärksten Induktoren von CYP1A1 und CYP1B1 mRNA, hatte keinen signifikanten Einfluss auf die PXR regulierte Expression. In der Tabelle 23 sind die inhibitorischen und aktivierenden Effekte von allen untersuchten antiretroviralen Substanzen ergänzt um die Ergebnisse zusammengefasst.

Die vorgestellten in vitro Untersuchungen stellen ein Model dar, das die Tendenzen des induktiven Verhaltens zeigt. Die Beeinflussung der Expression der Gene in vivo und deren Auswirkungen müssen in weiteren Versuchen überprüft werden und die klinische Relevanz unter Einbeziehung der inhibitorischen Effekte, individueller Koadministrationen sowie genetischer Ausstattung abgewogen werden.

6.3 CYP3A4 mRNA Bestimmung in Leukozyten und Korrelation mit der Pharmakokinetik von Alprazolam

In der vorliegenden Arbeit wurden erstmalig Expressionsuntersuchungen zu CYP3A4 im peripheren Leukozyten an einer großen Anzahl Probanden durchgeführt und in Bezug zu pharmakokinetischen sowie genetischen Parametern gesetzt. Die vorgestellten Untersuchungen zeigen, dass die in den Leukozyten in geringen Mengen vorhandene CYP3A4 mRNA durch bekannte Induktoren wie Rifampicin induziert werden kann. In den 96 getesteten Individuen konnten zwei extreme Gruppen in Bezug auf ihre Induzierbarkeit bestimmt werden. Bei sieben Probanden konnte keine Induktion der CYP3A4 mRNA in Leukozyten nach Rifampicin Behandlung festgestellt werden, während die Enzymaktivität von CYP3A erhöht war. Bei sieben Personen war die CYP3A4 mRNA um mehr als das vierfache induziert. Untersuchungen der Arbeitsgruppe um Sempoux [102] an humanen Neutrophilen und Lymphozyten von acht Probanden haben eine Expression des CYP3A Proteins gezeigt, ohne dass dieses durch eine Behandlung mit 600 mg Rifampicin über 6 Tage induziert war. Japanische Forscher haben in einer anderen Studie mit acht Teilnehmern mittels quantitativen RT-PCR demonstriert, dass die CYP3A4 mRNA in Leukozyten nach einer dreiwöchigen Behandlung mit 600 mg Rifampicin täglich induzierbar war [103]. Das Verhältnis der CYP3A4 mRNA zur ß-Aktin mRNA war interindividuell stark unterschiedlich und die Induktion schwankte in den wenigen Probanden um das 1.2 bis 4.5-fache (Zahlen tendenziell aus der Abbildung entnommen, da keine exakten Angaben im Text).

Verschiedene Gruppen zeigten an humanen Hepatozyten, dass die dort enthaltene CYP3A4 mRNA und/oder das CYP3A Protein durch Rifampicin induzierbar ist, wobei unterschiedliche Dosierungen, Zeiten der Inkubation mit der Substanz sowie Messtechniken gewählt wurden [119, 222, 253, 254]. Der beschriebene Faktor der Induktion bewegte sich zwischen 3 und 6. Berichte aus kultivierten Zelllinien, wie z. B. der Hepatoma Zelllinie HepG2, weisen auf Induktion der CYP3A mRNA mit einem Faktor von 2.7 bzw. 5.0 nach dem Verabreichen von 1 und 50 µmol/l Rifampicin hin [255]. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die in der vorgestellten Arbeit ermittelten Werte der CYP3A4 mRNA Induktion in den Leukozyten unterhalb der zitierten liegen, was für eine schwächere CYP3A4 mRNA Induktion in den Blutzellen im Vergleich zur Leber, dem Hauptmetabolisierungsorgan, sprechen würde.

Für die Ermittlung der CYP3A Aktivität wurde Alprazolam als Testsubstanz eingesetzt. Die Wahl der Testsubstanz ist für die Verlässigkeit der Ergebnisse von entscheidender Bedeutung. Einige der früher populär eingesetzten Substanzen zur Bestimmung der CYP3A Aktivität haben sich als nicht geeignet erwiesen, da sie auch von anderen Cytochrom-P450-Enzymen verstoffwechselt werden, oder durch das MDR1 transportiert werden. Für Alprazolam sind außer CYP3A4 und CYP3A5 keine anderen Cytochrom-P450-Enzyme bekannt, die an der Metabolisierung der Substanz beteiligt sind [183, 184, 185, 186]. Ein Transport durch MDR1 konnte zwar bisher nicht ausgeschlossen werden (es liegen keine Untersuchungen vor), da aber die strukturell verwandte Substanz Midazolam nachgewiesener Maßen nicht über dieses System transportiert wird [256], kann man ähnliches für Alprazolam annehmen. Die kinetischen Parameter für Alprazolam wie AUC und Plasma Spiegel 6, 8, 10 und 24 Stunden nach der oraler Einnahme von 1 mg des Arzneimittels korrelieren streng miteinander, so dass die CYP3A Aktivität über die Bestimmung des 10h-Wertes verlässlich gemessen werden kann [187].

CYP3A4 ist am Stoffwechsel von Östrogenen und Androgenen beteiligt. Es ist unter anderem an der metabolischen Aktivierung von Östron zum potentiell kanzerogenen 16α-Östron beteiligt [257]. Hunt et al. berichteten, dass das CYP3A Enzym eine 24 % stärkere Aktivität in Lebergeweben von Frauen hat [258]. Die Versuche wurden in vitro an 43 Gewebeproben durchgeführt. Die hier vorgestellten Daten aus 96 Patienten zur CYP3A4 mRNA Expression sowie Alprazolam [Seite 76↓]Pharmakokinetik korrelierten nicht mit dem Geschlecht. Die Diskrepanz lässt sich durch die Probenanzahl sowie interindividuelle Unterschiede erklären. Zum anderen zeigte eine Phänotypisierung von CYP3A4 und CYP2D6 mittels Bestimmung der Metabolite von Dextromethorphan im Urin keine Unterschiede in der Aktivität der beiden Enzyme bei 10 Männern und 23 Frauen [259]. Es ist demnach anzunehmen, dass es keine geschlechtsspezifische Expression und Aktivität von CYP3A4 gibt.

Das Ausmaß der Induktion der CYP3A4 mRNA in Leukozyten korrelierte nicht mit den kinetischen Parametern für Alprazolam-Konzentration und Clearance, welche einen Induktionsfaktor von 5.5 aufwiesen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das Ausmaß der Zunahme der Clearance von Alprazolam nicht aus den Veränderungen in dem CYP3A4 mRNA Gehalt in Leukozyten vorausgesagt werden kann. Dies kann auf verschiedene Ursachen und Mechanismen zurückgeführt werden. Es ist denkbar, dass die Regulation dieser speziellen mRNA im Blut anders verläuft als in der Leber, wo die Metabolisierung der Fremdstoffe stattfindet. Einige der für die transkriptionelle Aktivierung notwendigen Faktoren sind vorwiegend in der Leber lokalisiert. Es wurde berichtet, dass der Pregnan-X-Rezeptor der Ratte hauptsächlich in der Leber und dem Gastrointestinaltrakt exprimiert wird [131] und es gibt kaum Hinweise auf den Expressionsstatus des PXR in den Blutzellen. Kürzlich wurden die Aussagen zur gewebespezifischen Expression von PXR durch die Aussage ergänzt, dass der Rezeptor viel stärker im menschlichen Darm exprimiert wird als in einigen anderen Organen wie Niere oder Prostata [219]. Eine schwache Syntheserate des Rezeptors in den Leukozyten könnte für die zum Teil geringen Induktionsfaktoren der CYP3A4 mRNA von ≤ 2 verantwortlich sein.

Rifampicin induziert mehrere Gene, die alle über den PXR reguliert werden. Kürzlich wurde von der Induktion einiger korrespondierender mRNAs in Leukozyten berichtet [260]. In der Arbeit von Asghar et al. wurde eine durch 7-tägige Einwirkung von Rifampicin (600 mg täglich) veränderte Expression der mRNAs von MDR1, CYP2E1, CYP3A5, CYP3A7, CYP4A11 und CYP4B1 beschrieben während die CYP3A4 mRNA sowohl vor als auch nach Behandlung mit Rifampicin nicht detektiert werden konnte.

Vor kurzem wurde das Phänomen des Trans-Spleißens der CYP3A Moleküle in der Leber beschrieben [261]. Das erste Exon des CYP3A43 Gens kann mit den Exons 2 bis 13 des CYP3A4 oder CYP3A5 gespleißt werden. Da die gewählten Primer eher in der 3’ Region positioniert waren, kann nicht geklärt werden, ob diese schimärische mRNA auch detektiert wurde oder nicht. Allerdings bildet die CYP3A43/CYP3A4 intergenetische Kombination lediglich 0.15% der CYP3A43 mRNA in der Leber. Demnach wäre der in den Messungen evtl. verursachter Fehler durch Beimischungen dieser Version sehr gering.

Sowohl in der CYP3A4 mRNA Expression als auch in der CYP3A Aktivität konnte eine relativ hohe Variabilität festgestellt werden. Diese könnte durch die genetischen Polymorphismen erklärt werden. Es wurden inzwischen einige funktionelle Polymorphismen beschrieben, die eine veränderte katalytische Aktivität des Enzyms verursachen [112, 262]. Drei Mutationen wurden im Promotorbereich des Gens gefunden: CYP3A4*1B, CYP3A4*1C, CYP3A4*1D [114, 263]. Das Allel CYP3A4*1B ist in der kaukasischen Population relativ selten und tritt nur mit einer Häufigkeit von ca. 4% auf, im Vergleich dazu tragen 65% der Individuen afrikanischer Abstammung dieses Allel [262]. Die Rifampicin bedingte Induktion gemessen durch die Alprazolam-Konzentration unterschied sich nicht in den 4 heterozygoten Trägern des Allels CYP3A4*1B von den homozygoten Trägern des Wildtyp-Allels CYP3A4*1A (Tabelle 20). Demnach hat diese Variante keinen Einfluss auf die Aktivität des CYP3A Enzyms. In der Literatur ist die Auswirkung dieser Mutation umstritten. Während einige Autoren von einer Abnahme der Enzymaktivität in vivo berichten [114, 264, 265], wurde in vitro gar eine Zunahme der Aktivität beschrieben [266, 267]. Manche Wissenschaftler haben keinen Einfluss des Allels CYP3A4*1B auf die CYP3A Aktivität messen können [111, 263, 268], was mit den hier vorgestellten Ergebnissen übereinstimmt.

Der Basenaustausch im Exon 12 (1334 T>C) des CYP3A4 wird als Allel CYP3A4*3 bezeichnet [262] und resultiert im Wechsel der Aminosäure am Kodon 445 von Methionin zu Threonin, was die Hämbindende Region des CYP3A4 Proteins verändert [262]. Die Häufigkeit des Allels liegt bei 1.1% in der kaukasischen Population [269]. Von den 96 untersuchten Probanden war nur ein heterozygoter Träger dieser Variante und gehörte zur Gruppe mit höchsten Alprazolam Konzentrationen im Plasma, was auf eine schwächere Funktionalität des Enzyms verursacht durch diese Mutation hindeutet.

Die am häufigsten vorkommende Mutation in der kaukasischen Population liegt im Intron 10 des [Seite 77↓]CYP3A4 Gens und wurde bei ca. 17% gefunden [112]. Dieses Allel verändert die Enzymaktivität nachgewiesenermaßen nicht. Die CYP3A Enzymaktivität kann unter Umständen auch auf veränderte CYP3A5 Aktivität zurückgeführt werden, da dieses Isoenzym die α-Hydroxylierung von Alprazolam katalysiert [184]. Das Protein wurde in verschiedenen Studien bei 10–74% der Lebern von Kaukasiern detektiert [105, 270, 271, 272]. Neuere Erkenntnisse weisen darauf hin, dass das CYP3A5*1 Allel mit Häufigkeitsverteilung von rund 5% in der kaukasischen Population [106] für die Funktionalität des Enzyms notwendig ist, da das durch Träger des am häufigsten vertretenen Allels CYP3A5*3 exprimierte kürzere Potein keine Aktivität besitzt. In der vorgestellten Studie wurden 6 heterozygote Träger der Variante CYP3A5*1 gefunden, die keine statistisch signifikanten Unterschiede in der Pharmakokinetik von Alprazolam aufwiesen (1.3% Unterschied in dem Median der Alprazolam Konzentration).

Während andere Autoren berichteten, CYP2C19 sei nicht in den Stoffwechsel von Alprazolam involviert [186], kann man aus den vorgestellten Ergebnissen auf einen geringfügigen Einfluss des Allels CYP2C19*2 auf die Pharmakokinetik von Alprazolam und somit eine Beteiligung des CYP2C19 Enzyms schließen.

Um die Variabilität der Aktivität vollständig klären zu können, werden weitere Untersuchungen notwendig sein.


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20.10.2004