1 Einleitung

1.1 Allgemeine Einführung

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Ziel dieser Arbeit war es, durch die klinische und molekulargenetische Charakterisierung von Loricrin-Keratoderma einen Beitrag zur Systematisierung von selten auftretenden Verhornungsstörungen zu leisten.

In den letzten zwanzig Jahren führte die genetische Forschung auf dem Gebiet der Verhornungsstörungen zu neuen Erkenntnissen über die Ursachen genetisch bedingter Hauterkrankungen, die Klassifikation der Krankheiten sowie die Funktion beteiligter epidermaler Proteine. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit dem Gen des Proteins Loricrin, welches im „cornified envelope“ der Keratinozyten exprimiert wird28 90.

1.2 Die Epidermis

Die Haut besteht aus drei Schichten. Die äußerste Schicht, die Epidermis (Oberhaut), besteht aus verhorntem Plattenepithel. Die Dermis (Lederhaut) ist aus straffem und faserreichem Bindegewebe aufgebaut, in dem die Nerven und die versorgenden Gefäße verlaufen. Die Subkutis stellt das Fettgewebspolster das.

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Die Epidermis fungiert in erster Linie als Grenzschicht des menschlichen Körpers zur Umwelt. Besonders hervorzuheben sind ihre chemische, mechanische und immunologische Barrierefunktion. Zusätzlich ist sie ein Sinnesorgan und dient der Temperaturregelung 17 38.

1.2.1 Aufbau und Bildung der Epidermis

Über 90% der Epidermis besteht aus Keratinozyten. Diese wandern innerhalb eines dreiwöchigen Differenzierungsprozesses vom Stratum basale an die Oberfläche. Dabei durchlaufen die Keratinozyten folgende epidermale Schichten bei ihrer terminalen Differenzierung von basal nach apikal:

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Abb. 1: Keratinisierung der Epidermis 71

Das einlagige Stratum basale sitzt der Basalmembran auf, und die basophilen, kubischen Keratinozyten sind mit ihrer Längsachse vertikal zur Hautoberfläche angeordnet.

Im Stratum spinosum (Stachelzellschicht) richten sich die nun polygonalen Keratinozyten horizontal aus. Durch Ausbildung von Desmosomen an ihren Fortsätzen formen die Keratinozyten außerdem ein stabiles Netzwerk. Zusätzlich treten im oberen Stratum spinosum Odland-Körperchen auf (Abb. 1).

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Diese Odland-Körperchen werden im Stratum granulosum (Körnerzellschicht) in den Interzellularraum ausgeschleust und bilden einen wichtigen Bestandteil der lipidhaltigen Barriere zwischen den Hornzellen. Außerdem werden im Stratum granulosum die stark basophilen Keratohyalinkörper sichtbar, welche die Vorläufer der Keratinmatrix darstellen. Im oberen Stratum granulosum kommt es zu tief greifenden Veränderungen der Keratinozyten. Die Zellkerne und Zellorganellen verschwinden, es folgt eine Dehydrierung, und die Plasmamembran wird durch das „cornified envelope“ (Proteinhülle) ersetzt. Dieser Verhornungsprozess führt zu starren und immobilen Zellen, die fest aneinander fixiert sind (Abb. 1).

Diese Veränderungen sind im Stratum corneum (Hornschicht) abgeschlossen. Hier heißen die jetzt kernlosen Zellen Korneozyten (Hornzellen) und sind plättchenartig ineinander verzahnt. Im Zellinnern bestehen die Korneozyten aus Keratinfilamenten in einer amorphen Proteinmatrix. Ummantelt werden diese Zellen vom rigiden „cornified envelope“ (Abb. 1)10 17 38

1.2.2 Das „cornified envelope“

Das „cornified envelope“ (CE) ist eine 15 nm dicke, dichte und sehr schwer lösliche Struktur an der inneren Seite der Zellmembran der Korneozyten. Es bildet damit eine protektive Barriere gegen die Umwelt 27 und besteht aus mehreren Proteinen, wie z. B. Involucrin, Filaggrin, Loricrin, „small proline rich proteins“ (SPR), Repetin und Proteinen der S100-Familie 42 72 73. Die Gene dieser Proteine liegen alle in dem Cluster des epidermalen Differenzierungskomplexes (EDC), der sich im Bereich Chromosom 1q21 befindet 27 39 51 73 87. Das CE entwickelt sich während der Keratinisierung, welche eine spezielle Form des programmierten Zelltodes darstellt 32 34. Es wird vermutet, dass ansteigende Ca-Konzentrationen eine Vernetzung von Involucrin-Molekülen untereinander auslösen, die an die innere Zellmembran gebunden werden und somit das Grundgerüst bilden. In einem zweiten Schritt werden vor allem Loricrin und SRPs, aber auch andere Proteine, wie Repetin, durch Transglutaminasen über Disulfidbrücken und N-(γ-glutamyl)-Lysin- Isodipeptidbindungen mit dem Grundgerüst verbunden. Keratinintermediärfilamente und Filaggrin bilden Komplexe, die auch mit dem CE vernetzt werden und so die Hauptmasse der terminal differenzierten Keratinozyten darstellen39.

1.2.3 Loricrin

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Das Loricrin-Gen (LOR) [Latein: „lorica“ – Rüstung, Panzer23] hat mit 78-91% den größten Guanin- und Cytosingehalt (GC-Gehalt) aller bekannten menschlichen Gene 28 39. Es ist in 1q21 lokalisiert51. LOR ist 2,4kb lang und besteht wahrscheinlich aus zwei Exonen. Der RNA-Bereich liegt im zweiten Exon und weist eine Länge von 1,2 kb auf58. Die kodierende Sequenz beträgt 960bp.

weist mehrere Sequenzvariationen auf, die im Protein Loricrin meist zu Insertion von vier Aminosäuren in den (Glycin/Serin/Cystein)n-Schleifen führen. Diese Variationen scheinen keinen Krankheitswert zu haben, da sie nicht die Funktion des Proteins beeinträchtigen 90.

Loricrin hat eine Größe von 26 kDa, ist basisch und hochgradig unlöslich 26. Es besteht aus vielen Wiederholungen von aliphatischen (Glycin/Serin/Cystein)n-Schleifen („loops“), die von glutamin- und serinreichen Abschnitten unterbrochen werden. Die übrigen Aminosäuren sind Tyrosin, Phenylalanin oder Isoleucin 28. Loricrin ist der Hauptbestandteil des CE und wird erstmalig im Stratum granulosum exprimiert90.

1.3 Lamelläre Ichthyose

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Die in dieser Arbeit in einer Familie vorliegende Erkrankung wurde anfangs als autosomal dominante lamelläre Ichthyose diagnostiziert. Aus diesem Grunde wird hier die lamelläre Ichthyose kurz charakterisiert.

Die lamelläre Ichthyose [Griechisch: „ichthys“ – Fisch54] stellt eine heterogene Gruppe dar, die zahlreiche Typen von non-bullösen und isolierten kongenitalen Ichthyosen umfasst. In den achtziger und neunziger Jahren wurde eine Unterteilung der Ichthyosen in lamelläre Ichthyose und die non-bullöse ichthyosiforme Erythrodermie vorgeschlagen. Da diese klinische Unterteilung jedoch nicht mit den Genotypen zu korrelieren scheint und viele Zwischenformen der klinischen Unterteilung existieren, werden zum heutigen Zeitpunkt die Begriffe lamelläre Ichthyose oder kongenitale Ichthyose synonym für alle non-bullösen und isolierten kongenitalen Ichthyosen verwendet 2.

Bei den am häufigsten auftretenden autosomal rezessiven Formen wurden Mutationen im Transglutaminase-1-Gen (TGM1) auf Chromosom 14 29 69, in den Lipoxygenase-Genen (ALOX12B und ALOX E3) auf Chromosom 17 36, im ABCA12-Gen auf Chromosom 2 47 und in Ichthyin auf Chromosom 5 48 gefunden. Für die selten vorkommenden autosomal dominanten Formen sind bisher noch keine Genloci bekannt 68 81 84 89.

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Viele Patienten mit lamellärer Ichthyose werden als Kollodiumbaby geboren. Das bedeutet, dass Neugeborene von einer zusätzlichen kollodiumartigen Membran umgeben sind. Außerdem weisen die meisten Neugeborenen eine Erythrodermie auf, welche im Schweregrad variiert. Diese Erythrodermie kann persistieren, sich während der kindlichen Entwicklung bessern oder vollständig zurückbilden. Insbesondere die charakteristische Schuppung weist ein weites klinisches Spektrum auf. Sie reicht von einer leichten Ausprägung, welche weißlich-grau, oberflächlich und semihaftend in Erscheinung tritt, bis hin zu einer schweren Ausprägung mit großen, plattenartigen, dunkelbraun-grauen und fest adhärenten Schuppen. Die palmoplantare Hyperkeratose geht häufig mit Fissuren und digitalen Kontrakturen einher. Die Hidrosis ist beeinträchtigt. Ein weiteres Zeichen ist ein Ectropium, welches im Schweregrad variiert. Bei etwa der Hälfte der Patienten fallen milde Nageldystrophien auf. Die Zähne zeigen bei den rezessiven Formen ein unauffälliges Erscheinungsbild. Weitere Merkmale können Alopecia, kongenitale Hypoplasie des Ohr- und Nasenknorpels oder Juckreiz sein 20 37 82 83. Bei der autosomal dominanten Form wurden zusätzlich Lichenifikationen an den dorsalen Seiten der Hände und schwere Karies beschrieben 81 84.

1.4 Mutilierende Palmoplantarkeratose (Vohwinkel-Syndrom) und Loricrin-Keratoderma

1.4.1  Klinisches Bild

Das klinische Bild dieser mutilierenden Palmoplantarkeratose (PPK) weist gewisse Ähnlichkeiten zur lamellären Ichthyose auf. Eine solche PPK wurde erstmalig 1929 durch Vohwinkel beschrieben 86. Charakteristisch ist eine honigwabenförmige Struktur. Die Fingerknöchel sind prominent verdickt, und besonders auf der Rückseite der Hände befinden sich seesternförmige Hyperkeratosen. Furchenartige Einschnürungen (Pseudoainhums) führen teilweise zu Autoamputationen der Finger und Zehen. Ist zusätzlich eine Schwerhörigkeit vorhanden, wird diese PPK als echtes Vohwinkel-Syndrom (OMIM 124500) bezeichnet. Dieses Syndrom wird durch eine Mutation im Connexin-26-Gen (GJB2) verursacht49. Mitte der achtziger Jahre wurde eine Variante dieser PPK ohne das Merkmal der Schwerhörigkeit jedoch mit generalisierter, leichter Ichthyose beschrieben (OMIM 604117)11. Sie wird klinisch als Vohwinkel-Syndrom Typ Camisa bezeichnet. Diese Variante beruht auf einer Mutation im Loricrin-Gen (LOR) 50und ist aus genetischer Sicht der Loricrin-Keratoderma zugehörig 76. Der Begriff Loricrin-Keratoderma wurde erstmalig 1999 von Takahashi und Mitarbeitern 76 geprägt und im Folgenden in der Literatur aufgegriffen.

1.4.2 Mutationen in LOR

In der Literatur wurden bisher sieben Familien mit drei verschiedenen Mutationen in dem Gen LOR beschrieben. Die häufigste Mutation 730insG, die zur Veränderung Val231fsX106 auf Produktebene führt, lag in Familien aus Grossbritannien 41 50 60 und Japan 76 vor. Eine weitere Familie mit dieser Mutation erhielt die Diagnose lamelläre Ichthyose (non-bullöse ichthyosiforme Erythrodermie) 53. In einer Familie aus Nordirland wurde die Mutation 662insT, die zur Veränderung Ser209fsX128 auf Produktebene führt, mit dem Phänotyp Vohwinkel-Syndrom Typ Camisa gefunden 4. Bei einer Familie aus Japan mit der Mutation 709insC, die zur Veränderung Glu224fsX113 auf Produktebene führt, wurde die Diagnose progressive symmetrische Erythrokeratodermie gestellt30.

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Alle drei aufgeführten Insertionen sind Frameshift-Mutationen und führen zu einem verspäteten Stoppkodon. Damit ist das resultierende Protein Loricrin in allen Fällen um 22 Aminosäuren länger. Anstelle eines glutamin- und serinreichen Endes ist das modifizierte Ende durch einen Reichtum an Arginin und Leucin gekennzeichnet 50. Das veränderte Loricrin weist eine nukleäre Kernzielsequenz („nuclear targetting sequence“) auf 41 75. Daraus folgt, dass es nicht in das CE integriert, sondern in den Zellkern transportiert wird 31 41 50 75.

1.4.3 Mausmodelle

Nach Identifikation des Loricrin-Gens und den Mutationsfunden in LOR wurden seit 1993 verschiedene Mausmodelle entwickelt, die im Folgenden näher beschrieben werden:

Eine Überexpression von Loricrin führte bei Versuchsmäusen zu keinem abnormalen Phänotyp 91. Heterozygote LOR+/- „knock-out“-Mäuse, denen ein -Allel fehlte, waren im Phänotyp nicht vom Wildtyp zu unterscheiden. Homozygote LOR-/- „knock-out“-Mäuse, denen beide LOR-Allele fehlten, waren bei Geburt klein und hatten eine glänzende und durchsichtige Haut mit Zeichen der Erythrodermie. Die Größenzunahme entwickelte sich postnatal normal, und die Symptome verschwanden nach vier bis fünf Tagen40.

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Etwa zeitgleich wurde Mäusen, die zwei Wildtyp-LOR-Allele besaßen, ein zusätzliches, mutiertes LOR-Allel eingeschleust. Die entstandenen transgenen Mäuse waren in der ersten Generation heterozygot in Bezug auf das zusätzliche mutierte -Allel. Diese Mäuse zeigten bei Geburt eine glänzende Haut. Sie entwickelten innerhalb der ersten drei Tage eine feine, über den ganzen Körper verteilte Schuppung (Ichthyose). Allerdings verschwanden diese Merkmale wieder und tauchten auch während der weiteren Entwicklung nicht erneut auf. Die in der zweiten Generation homozygoten transgenen Mäuse wiesen dagegen eine schwere neonatale Erythrokeratodermie mit roter, glänzender Haut auf. Nach fünf Tagen verdickte sich die Epidermis im Gesäßgebiet und an der Basis des Schwanzes. Die Pfoteninnenseiten und Fußsohlen zeigten eine non-epidermolytische Hyperkeratose. Am siebten Tag entstanden Konstriktionen an der Basis des Schwanzes. Distal davon bildete sich eine ödematöse Auftreibung. Es kam nicht zu Autoamputationen. Ab dem elften Tag kam es auch bei diesen Mäusen zur Rückbildung aller Merkmale 75.

In einem weiteren Experiment wurden die homozygot transgenen Mäuse mit LOR-/- „knock-out“-Mäusen gepaart. Die daraus entstandene Tochtergeneration zeigte nur einen leichten Anstieg im Schweregrad der Merkmale im Vergleich zu den homozygot transgenen Mäusen. Durch die Paarung innerhalb dieser F1-Generation entstanden homozygot transgene, homozygot LOR-/- „knock-out“-Mäuse (Abb. 2). Diese Mäuse zeigten überraschender Weise einen sehr viel schwereren Phänotyp als die homozygot transgenen Mäuse 75. Diese Befunde werden im Zusammenhang mit den Ergebnissen dieser Arbeit später ausführlich diskutiert (Abschnitt 4.4).

Abb. 2: Paarung transgener Mäuse mit -/- „knock-out“-Mäusen

1.5 Palmoplantarkeratosen – ausgewählte Formen

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Die im Folgenden beschriebenen Palmoplantarkeratosen (PPK) werden in den Abschnitten 4.1.3 und 4.1.5 dieser Arbeit wieder aufgegriffen.

Palmoplantarkeratosen (PPK) stellen eine heterogene Gruppe von Hautkrankheiten dar, die sich hauptsächlich an Füßen und Händen manifestieren und genetisch bedingt oder exogen verursacht sein können. Besonders die genetisch bedingten Formen werden nach klinischem Aussehen, Vererbungsmodus, Ätiologie, assoziierten Merkmalen und seit einigen Jahren auch nach genetischen Befunden unterschieden. Die hier beschriebenen Formen sind als diffuse hereditäre Palmoplantarkeratosen klassifiziert 20 63.

1.5.1 Epidermolytische und nicht- epidermolytische Palmoplantarkeratose (Vörner-Unna-Thost)

Die epidermolytische und nicht-epidermolytische Palmoplantarkeratose (OMIM 144200) stellt die häufigste Form der Palmoplantarkeratosen dar. Sie wurde 1880 von Thost 78, 1883 von Unna 85 und 1901 von Vörner 88 beschrieben. Nach heutiger Auffassung handelt es sich bei allen drei Beschreibungen um den gleichen PPK-Typ 43. Der Vererbungsmodus erfolgt autosomal dominant. Mutationen wurden hauptsächlich im Gen des Keratins 9 (KRT9) auf Chromosom 17 gefunden 43 66 80. Die Palmoplantarkeratose manifestiert sich innerhalb der ersten Lebensmonate mit diffuser, gelblicher palmoplantarer Hyperkeratose und rotem Randsaum, der an den Rändern scharf abschneidet. Sie ist nicht transgredient [Lat: „transgredi“ – überschreiten, passieren 23] und somit auf Handflächen und Fußsohlen beschränkt. Typische Komplikationen sind Fissuren, Hyperhidrose und sekundäre Infektionen mit Dermatophyten.

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Eine transgrediente und progrediente [Lat: „progredi“ – fortschreitende (der Zeit, dem Alter nach) 23] Form wurde erstmalig 1952 beschrieben und auch Greithers-Syndrom genannt. Hier finden sich zusätzlich Hyperkeratosen auf Hand- und Fußrückseiten sowie Knien und Ellenbögen 20 44 63.

1.5.2 Palmoplantarkeratose vom Typ Mal de Meleda

Die PKK Mal de Meleda (OMIM 248300) wurde zuerst 1897 bei Bewohnern der Insel Meleda beschrieben. Der Vererbungsmodus ist rezessiv. Diese PPK beruht auf einer Mutation im SLURP-1-Gen auf Chromosom 8 16. Mal de Meleda ist transgredient und verläuft meist progredient. Ein Erythem der Handinnenflächen und Fußsohlen entwickelt sich bereits in der Kindheit. Daraus entsteht anschließend eine diffuse Palmoplantarkeratose mit deutlich erythematösem Grund, die sich auf den Rückseiten von Händen und Füßen ausdehnt. Auch auf Ellenbögen und Knien lassen sich Hyperkeratosen finden. Assoziierte Merkmale sind Hyperhidrose, Brachydaktylie, Nagelanomalien und ein periorales Erythem. Auch kardiovaskuläre Anomalien sind gehäuft zu beobachten 20 44 63 83.

1.5.3 Palmoplantarkeratose mit Periodontopathie (Papillon-Lefèvre-Syndrom)

Die PPK mit Periodontopathie (OMIM 245000) beruht auf Mutationen im Cathepsin-C-Gen (CTSC) auf Chromosom 11 21 79. Der Vererbungsmodus ist rezessiv, und das klinische Bild der PPK ähnelt dem der PPK Mal de Meleda. Während der Kindheitsphase entwickelt sich zuerst ein Erythem der Handinnenflächen und Fußsohlen. Daraufhin entsteht eine diffuse, oft relativ milde PPK. Die PPK breitet sich transgredient auf Hand- und Fußrücken sowie Ellenbögen und Knien aus. Ein wichtiges Merkmal ist die schwere Gingivitis, welche zum Verlust der Milch- und bleibenden Zähne innerhalb der ersten Lebensdekade führt. Rezidivierende kutane und systemische Pyodermien treten gehäuft auf. Weitere Merkmale können eine milde mentale Retardierung oder Hyperhidrose sein 20 44 63.

1.5.4 Mutilierende Palmoplantarkeratose mit periorifikalen keratotischen Plaques (Olmsted-Syndrom)

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Die mutilierende PPK mit periorifikalen keratotischen Plaques wurde erstmalig 1927 beschrieben 62. Die Literatur weist zumeist nur sporadische Fälle aus. Das männliche Geschlecht ist überwiegend betroffen 46. Innerhalb des ersten Lebensjahres entwickelt sich eine symmetrische und scharf begrenzte PPK, die von einem Erythem umgeben ist. Diese PPK führt zu Flexionskontrakturen und tiefen Fissuren, die sehr schmerzhaft für die Betroffenen sind. Es folgen Pseudoainhums und Autoamputationen. Die PPK ist schwer progredient und behindert die Patienten in der gesamten Lebensgestaltung. Das klinische Bild ähnelt dem der PPK der mutilierenden Keratoderma (Vohwinkel-Syndrom) und dem der PPK Mal de Meleda. Ein weiteres Merkmal sind keratotische Papeln, die um Mund, Nase, Genitalien und Anus auftreten. Alopecia universalis und Nagelanomalien treten gehäuft auf. Der Intelligenzquotient ist bei fast allen Patienten normal 20 46 59 63.

1.6 Aspekte der molekularen Humangenetik

Im Folgenden werden einige für diese Arbeit wichtige molekulargenetische Themenbereiche erläutert.

1.6.1 Das Humangenomprojekt

Die Sequenzierung des gesamten humanen Genoms wurde im April 2003 im Rahmen des Humangenomprojektes abgeschlossen. Weitere Teilaspekte des Humanen Genomprojekts waren und sind die Identifizierung aller Gene und das Aufbereiten der Daten in Datenbanken, die allen Wissenschaftlern zugänglich sind. Solch eine Datenbank wird zum Beispiel am National Center for Biotechnology Information (NCBI57) geführt. Durch diese Fortschritte hat sich die Suche nach Genen und Mutationen für genetisch bedingte Krankheiten vereinfacht. Aufwändiges, eigenhändiges Erstellen von genetischen und physikalischen Karten ist häufig nicht mehr notwendig, da alle wichtigen Informationen bereits in Datenbanken zur Verfügung stehen56.

1.6.2 Vom Phänotyp zur pathogenetischen Mutation

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Bei der Suche nach pathogenen Mutationen wird häufig die Methode des positionellen Klonierens verwandt. Dazu ist es wichtig, eine möglichst kleine chromosomale Kandidatenregion zu definieren. Dies geschieht durch eine genomweite Kartierung betroffener Familien mit Mikrosatelliten (Markern) oder Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs). Mikrosatelliten bestehen zumeist aus (CA)n-Wiederholungen, welche bei verschiedenen Individuen in unterschiedlicher Länge vorliegen und nach den Mendelschen Regeln vererbt werden. Die mit Hilfe der genomweiten Kartierung gewonnenen Daten können auf Rekombinationsereignisse untersucht und die Rekombinationsfraktion oder -häufigkeit errechnet werden. Letztere stellt ein Maß für die genetische Distanz zweier Loci untereinander dar. Eine Rekombinationshäufigkeit von 1% definiert die genetische Distanz von 1 Centi-Morgan (cM). Die größte Rekombinationshäufigkeit ist 50%, welche eintritt, wenn zwei Loci auf zwei verschiedenen Chromosomen liegen. Je geringer die Distanz zwischen zwei Loci eines Chromosoms ist, desto seltener treten Rekombinationen zwischen diesen Loci auf. Haplotypen stellen die Anordnung der Allele auf einem Chromosom dar.

Durch Computerprogramme können genomweit Lod-Wert-(„Logarithm of the odds“)-Analysen durchgeführt und Familienstammbäume auf Kopplung untersucht werden. Der Lod-Wert ist eine Funktion der Rekombinationshäufigkeit. Hierbei spricht ein Lod-Wert von mehr als +3 für eine signifikante Kopplung und ein Lod-Wert von weniger als -2 gegen eine Kopplung. Die Werte zwischen -2 und +3 sind statistisch nicht eindeutig. Die hierdurch eingeengte Region kann mit Computerprogrammen auf Rekombinationsereignisse untersucht werden.

Ziel dieser Methoden ist es, eine Kandidatengenregion zu definieren. In dieser Region können durch Datenbankrecherche Kandidatengene definiert werden. Hierbei ist es sinnvoll, eine Prioritätenliste dieser Gene zu erstellen. Dazu werden Informationen über die Genexpression, mögliche Funktion sowie Homologien zu anderen Proteinen über Datenbanken recherchiert. Die Kandidatengene werden dann bei Patienten und deren Familienangehörigen sequenziert und auf Mutationen untersucht 74.

1.6.3 Pyrosequenzierung

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Die Pyrosequenzierung stellt eine Sequenzierungsmethode dar, welche die Kenntnis der Wildtyp-Sequenz voraussetzt. Es werden Einzelnukleotid-Polymorphismen („Single Nucleotide Polymorphism“; SNP) verwendet. Hierbei handelt es sich um einen Austausch einer einzelnen Base, der gehäuft in der Bevölkerung auftritt und keinen Krankheitswert besitzt.

Die Pyrosequenzierung findet in der Genotypisierung Anwendung. Sie weist eine hohe Sensitivität auf, sodass auch eine quantitative Analyse möglich ist. Hierbei werden beispielsweise für einen heterozygoten SNP die prozentualen Anteile der Basen der beiden Allele bestimmt. Werden auf diese Weise quantitativ Daten von DNA und RNA erhoben und verglichen, können somit Unterschiede in der Expression auf RNA-Ebene nachgewiesen werden.

Die Pyrosequenzierungsmethode beruht auf folgenden Reaktionen (Abb. 3):

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Abb. 3: Das Prinzip der Pyrosequenzierung

Ein Sequenzprimer hybridisiert an einen DNA-Einzelstrang, der zuvor mittels PCR amplifiziert und vom komplementären Strang getrennt wurde. Diese Einzelstränge und die Primer werden mit den Enzymen DNA-Polymerase, ATP-Sulfurylase, Luciferase und Apyrase sowie den Substraten Adenosin-5’-Phosphosulfat (APS) und Luciferin inkubiert. Die dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) werden einzeln in vorgegebener Reihenfolge hinzu gegeben. Das erste dNTP wird durch die Polymerase an den Primerstrang eingebaut, wenn es sich als komplementär zum DNA-Einzelstrang erweist. Hierbei erfolgt eine Freisetzung von Pyrophosphat (PPi). Die Menge Pyrophosphat ist equimolar zu den eingebauten Nukleotiden.

Im nächsten Schritt erfolgt eine quantitative Umwandlung von Pyrophosphat und APS durch die ATP-Sulfurylase in ATP, welches die Umwandlung von Luciferin zu Oxyluciferin mit Hilfe der Luciferase induziert. Dieser Vorgang produziert sichtbares Licht, welches von einer Kamera registriert und in einen „peak“ (Signal) im Pyrogramm umgewandelt und dargestellt wird. Das erzeugte Licht ist proportional zur ATP-Menge und somit auch proportional zur Anzahl der eingebauten Nukleotide. Die Apyrase baut kontinuierlich die nicht eingebauten Nukleotide ab. Wenn der Abbau vollständig erfolgt ist, wird das nächste dNTP hinzu gegeben, sodass langsam der Aufbau des komplementären DNA-Strangs erfolgt 65.

1.7 Zielsetzung

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Die Hauptziele dieser Arbeit bestanden darin, (1) die ursächliche Mutation in einer Familie mit der ursprünglichen Verdachtsdiagnose autosomal dominante lamelläre Ichthyose (MDC-804) zu suchen, (2) eine Standarddiagnostik zu etablieren sowie (3) eine Expressionsanalyse mit Pyrosequenzierung durchzuführen.

Zu (1)

Im Vorfeld dieser Arbeit hatte bereits eine genomweite Kartierung für fünf Familien (MDC-804, B-4555, B-4565, B-4571 und B-4601) mit autosomal dominanter lamellärer Ichthyose stattgefunden. Daher sollte zu Beginn dieser Arbeit mit Hilfe dieser bereits vorliegenden Daten eine Haplotypisierung in der Familie MDC-804 manuell durchgeführt werden. Danach war eine Feinkartierung geplant, um die Kandidatengenregion weiter einzuengen. Wie in Abschnitt 1.6.2 beschrieben, sollte eine Datenbankrecherche vorgenommen werden, um geeignete Kandidatengene zu definieren.

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Diese Kandidatengene sollten in der Familie MDC-804 auf Mutationen untersucht werden. Nach Mutationsfund war angedacht, auch die anderen vier Familien auf Mutationen in dem entsprechenden Gen zu überprüfen. Danach sollten die klinischen Merkmale des Krankheitsbildes anhand der untersuchten Familien zusammengefasst und in einen Bezug zu gefundenen Mutationen gesetzt werden.

Zu (2)

Ein zweites Ziel dieser Arbeit bestand in der Etablierung einer Standarddiagnostik für das Gen, in welchem Mutationen gefunden wurden. Dazu sollte die Untersuchung von DNA- und RNA-Material miteinander verglichen werden. Ein weiterer Schritt bestand darin, dieses Verfahren bei Proben von verschiedenen weiteren Patienten diagnostisch anzuwenden und damit zu etablieren.

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Zu (3)

Der dritte Abschnitt bestand aus einer Expressionsanalyse auf RNA-Ebene. Hierbei sollte die noch relativ neue Pyrosequenzierungsmethode Anwendung finden. Dafür war es notwendig, in mindestens einer betroffenen Person einen passenden heterozygoten SNP ausfindig zu machen. In dem Bereich dieses SNPs sollten cDNA und DNA quantitativ sequenziert werden, um etwaige Expressionsunterschiede auf RNA-Ebene aufzudecken. Hierzu sollte RNA zur cDNA-Gewinnung extrahiert werden. Darüber hinaus sollten diese Ergebnisse in den Stand der Forschung eingebunden werden.


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22.06.2006