3 Ergebnisse

3.1 Feinkartierung

3.1.1 Bereits vorhandene Forschungsergebnisse

▼ 37 

Im Vorfeld dieser Arbeit hatte bereits eine genomweite Kartierung mehrerer Familien mit der Verdachtsdiagnose autosomal dominante lamelläre Ichthyose (ADLI) stattgefunden. Das betraf die Familien MDC-804, B-4555, B-4565, B-4571 und B-5601. Die Familie MDC-804 stammte aus dem Institut für Medizinische Genetik, Charité – Universitätsmedizin Berlin. Die anderen vier Familien stammten aus der Klinik und Poliklinik für Hautkrankheiten, Universität Münster.

Die folgenden klinischen Befunde wurden dem dermatologischen Befund der Familie MDC-804 entnommen. Der Vererbungsmodus dieser Familie verlief nach vorliegendem Stammbaum eindeutig autosomal dominant. Die Hautbefunde zeigten eine generalisierte leichte Ichthyose mit zonierter, sehr starker Lichenifikation. Die Handinnenflächen und Fußsohlen wiesen eine deutliche Hyperkeratose auf. Darüber hinaus gaben alle Patienten an, als Kollodiumbaby geboren worden zu sein. Eine autosomal dominante lamelläre Ichthyose wurde erstmalig von Traupe und Mitarbeitern bei der hier auch untersuchten Familie B-4601 beschrieben84.

Die im Vorfeld dieser Arbeit erfolgte Genotypisierung der Familie MDC-804 hatte genomweit im Bereich des Markers bei D1S498 den maximalen Lod-Wert von 2,8 (θ =0) ergeben. Der erwartete Lod-Wert betrug 2,603. Die Genotypisierung sowie die Lod-Wert-Berechnung wurden nicht durch die Autorin selbst vorgenommen77.

3.1.2 Haplotypisierung und Feinkartierung

▼ 38 

Die vorausgegangene Lod-Wert-Berechnung diente als Grundlage zur Einengung der Kandidatengenregion. Mithilfe der Marker D1S200 bis D1S431 im Bereich von 100cM wurden manuell Haplotypen der zuvor beschriebenen Familie MDC-804 erstellt, um Rekombinationsereignisse zu definieren. Aus den erstellten Haplotypen ergaben sich informative Rekombinationsereignisse. Diese lagen in Centromer-Richtung bei Patientin 20 zwischen den Markern D1S221 und D1S502. In Telomer-Richtung befanden sie sich bei Patient 14 zwischen D1S506 und D1S484. Das ergab einen Bereich von 27,44 cM.

Die Datenbankrecherche ergab weitere drei Marker in dem Abschnitt zwischen D1S506 und D1S484. Mit diesen drei Markern wurde eine Feinkartierung bei 13 Mitgliedern der Familie MDC-804 vorgenommen. D1S2771 ließ sich ohne Probleme mit dem Standardprotokoll der Touchdown-PCR amplifizieren. Für die Marker D1S2635 und D1S1653 musste erst anhand einer Temperaturgradienten-PCR die optimale Annealing-Temperatur bestimmt werden, welche bei 55°C lag. Anschließend konnten dann diese Marker ebenfalls mit dem Standardprotokoll der Touchdown-PCR amplifiziert werden. Die Ergebnisse zeigten eine detailliertere Feinkartierung der Familie MDC-804.

Bei Patient 14 standen DNA-Proben der Eltern nicht zur Verfügung, da diese bereits verstorben waren. Bei seinem Halbbruder (Patient 9), seiner Schwester (Patientin 16) sowie seiner Tochter (Patientin 18) ergaben sich für die Marker D1S1653 und D1S2635 heterozygote Genotypen (Abb. 4). Der Vergleich der Genotypen der Geschwister (Patient 9, 14 und Patientin 16) untereinander deckte bei Patient 14 eine Rekombination auf. Der rekombinierte Haplotyp wurde an seine Tochter (Patientin 18) weitervererbt (Abb. 4). Dadurch konnte in der Region zwischen D1S1653 und D1S2635 bei Patient 14 auf ein Rekombinationsereignis geschlossen werden. Damit war die informative Aussage der Feinkartierung erschöpft, da keine weiteren Marker zur Verfügung standen. Der neu eingegrenzte Bereich betrug somit 23,38 cM19.

▼ 39 

Abb. 4: Stammbaum mit Haplotypen der Familie MDC-804

3.1.3 Kandidatengensuche

Die Suche nach Kandidatengenen wurde im Bereich zwischen D1S221 und D1S2635 vorgenommen. Zwischen den Markern D1S498 und D1S305 befindet sich die Region des epidermalen Differenzierungskomplexes (EDC). In dieser Region liegen viele wichtige Gene, die für den Aufbau des „cornified envelopes“ CE verantwortlich sind. Daher ist dieser Bereich unter funktionellen Gesichtspunkten eine sehr interessante Kandidatenregion für Hautkrankheiten. Genetische und physikalische Karten sind für diesen Bereich schon 1996 erstellt worden51. Zur Kontrolle wurden diese Ergebnisse mit den Daten des Humangenomprojektes in der NCBI-Datenbank mit der Reihenfolge des Contigs NT_004487 verglichen. Dieser Vergleich lieferte für die damals schon bekannten Gene identische Ergebnisse.

Zusätzlich sind besonders in der -Gengruppe, aber auch in der Gruppe der - Gene zwischen 1996 und 2004 neue Untergruppen im Rahmen des Humanen Genomprojektes identifiziert worden. Diese waren in dem NCBI-Contig aufgereiht und konnten somit in die Aufzählungsreihenfolge übernommen werden.

▼ 40 

Centromer

Telomer

▼ 41 

Als Kandidatengene wurden zuerst FLG, IVL und LOR näher betrachtet. Diese drei Gene liefern wichtige Proteine für den Aufbau des CE und stellen somit funktionell für Verhornungsstörungen interessante Gene dar. Eine weitere NCBI-Datenbankrecherche ergab, dass bisher nur in LOR Mutationen bekannt waren. Insofern stellte LOR sowohl in positioneller als auch in funktioneller Hinsicht ein gutes Kandidatengen mit bereits bekannten Mutationen dar. Folglich wurde LOR als erstes Kandidatengen sequenziert.

3.2 Sequenzierung und Mutationsnachweis

3.2.1 Sequenzreaktion

Im Folgenden wurde zuerst eine PCR zur Amplifikation der LOR-Sequenz etabliert und das Produkt anschließend sequenziert. Zur Amplifikation wurde ein Primerpaar entworfen, welches die gesamte kodierende Sequenz von LOR flankiert. Allerdings gestaltete sich die anschließende Etablierung der PCR-Bedingungen schwierig, da LOR durch den CG-Reichtum nur sehr schwer zu amplifizieren war. Deshalb erfolgte probeweise der Einsatz der im Folgenden beschriebenen Methoden und Materialien. Ein Touchdown-Programm, wie es bei der Feinkartierung angewandt worden war, führte zu keiner Amplifikation. Eine Temperaturgradienten-PCR legte eine Annealing-Temperatur von 58°C nahe. Das „Triple-Master™-PCR-System“ mit besonderer Zusammensetzung des Reaktionspuffers für CG-reiche Sequenzen zeigte nur unspezifische Banden. Zu einem weiter verwendbaren Ergebnis führten die Verlängerungen des Annealingschritts und des Elongationsschritts sowie die Zugabe von 5% DMSO. Dieses Produkt wurde für die Etablierung der Sequenzierung eingesetzt.

Die Auswahl der Primer für die Sequenzierung bereitete Probleme, da Loricrin aus sehr vielen Glycin-Aminosäuren besteht und LOR viele repetitive Sequenzen aufweist. Gesucht wurden Bereiche, die in ihrer Zusammensetzung möglichst einzigartige Sequenzen aufweisen, damit die Primer spezifisch an genau dieser Stelle und nicht mehrfach im Gen binden. In der Praxis zeigte sich, dass die Primer LOR_B_F und LOR_D_F keine verwendbaren Ergebnisse lieferten. Die Ergebnisse mit den Primern LOR_R und LOR_C_F ließen sich nicht immer gut reproduzieren. Daher wurden als neue Primer LOR_3_F und LOR_7_R eingesetzt (Abb. 5). Mit diesen und dem Primer LOR_A_F wurde die Sequenzreaktion schließlich etabliert. Auch hier ließ sich das Standardprotokoll wegen des CG-Reichtums nicht anwenden. Weder eine Erhöhung der Annealing- oder Denaturierungstemperatur, noch die Verdopplung der Big-Dye-Konzentration führten zu einem befriedigenden Ergebnis. Auch die Verlängerung der Anzahl der Zyklen erwies sich als nicht sinnvoll. Aussagekräftige Sequenzen erbrachte schließlich nur eine vorgeschaltete Denaturierung von 5 min bei 98°C vor Ablauf der Sequenzreaktion.

▼ 42 

Abb. 5: Verwendete Primer

3.2.2 Auswertung

In der anschließenden Sequenzierung der DNA aller 13 Mitglieder der Familie MDC-804 fand sich bei allen betroffenen Patienten eine heterozygote Insertion von einer Base Guanin an Position 730 in LOR (Abb. 6 und Abb. 7).

Abb. 6: Mutation 730insG

▼ 43 

Abb. 7: Wildtyp

Diese Mutation wurde mehrfach bei der Diagnose Vohwinkel-Syndrom Typ Camisa beschrieben (Abschnitt 1.4.1) 41 50 60 76.

3.3 Mutationsausschluss bei der autosomal dominanten lamellären Ichthyose (ADLI) in Bezug auf LOR

Um festzustellen, ob es sich bei dem Vohwinkel-Syndrom Typ Camisa und der ADLI um allelische Krankheiten handelt, wurden weitere vier Familien mit Verdachtsdiagnose ADLI auf Mutationen in LOR untersucht. In allen Familien wurden keine Mutationen in der kodierenden Sequenz von LOR gefunden.

▼ 44 

Nur bei der Familie B-4601 (Abb. 11) konnte sicher von einem autosomal dominanten Vererbungsmodus mit vollständiger Penetranz ausgegangen werden. In den Familien B-4555 (Abb. 8), B-4571 (Abb. 9) und B-4565 (Abb. 10) war eine autosomal dominante Vererbung unter Annahme unvollständiger Penetranz, allerdings als möglich anzusehen.

Abb. 8: Stammbaum Familie B-4555

Abb. 9: Stammbaum Familie B-4571

▼ 45 

Abb. 10: Stammbaum Familie B-4565

Abb. 11: Stammbaum Familie B-4601

3.4 Klinische Diagnostik

Es wurden drei Familienmitglieder der Familie MDC-804 von der Autorin selbst dermatologisch mituntersucht.

▼ 46 

Die Befunde sind im Folgenden dargestellt:

Patientin 16

Die Patientin gab an, als Kollodiumbaby geboren worden zu sein. Die Ichthyose war lamellär, mild ausgebildet und besonders großflächig am Rücken sichtbar. Des Weiteren zeigte sich eine leichte Verdickung der Haut über den Fingerknöcheln (prominente Fingerknöchel). Die palmoplantare Hyperkeratose (PPK) erschien honigwabenförmig und beschränkte sich hauptsächlich auf Handinnenflächen und Fußsohlen. Die PPK war stärker palmar als plantar ausgeprägt. Hand- und Fußrücken zeigten sich unauffällig ohne seesternförmige Hyperkeratosen. Weder an den Fingern noch an den Zehen waren Einschnürungen oder Autoamputationen sichtbar. Mit zunehmendem Alter entwickelte sich bei der Patientin eine Vitiligo. Die Haare, die Zähne und die Nägel waren unauffällig. Es gab keinen Anhalt für Schwerhörigkeit.

▼ 47 

Patientin 18

Auch Patientin 18, die Nichte von Patientin 18, berichtete, als Kollodiumbaby geboren worden zu sein. Die Ausprägung der lamellären Ichthyose erschien stärker als bei Patientin 16. Deutliche, hyperpigmentierte Lichenifikationen (Abb. 13) waren besonders am Hals, den Handgelenken, in der Leistengegend, den Ellenbeugen, den Kniekehlen und den Achselhöhlen sichtbar. Die Haut über den Fingerknöcheln wies Verdickungen auf (prominente Fingerknöchel). Ein honigwabenförmiges Aussehen kennzeichnete die Hyperkeratose, welche sowohl palmar als auch plantar deutlich sichtbar war und sich nicht auf Hand- oder Fußrücken ausbreitete (Abb. 12). Auf Hand- und Fußrücken fanden sich keine seesternförmigen Hyperkeratosen. Genauso wie bei Patientin 16 fehlten Einschnürungen oder Autoamputationen an Fingern oder Zehen. Zusätzlich hatte die Patientin eine starke Neurodermitis mit besonders an den Extremitäten sichtbaren Excoriationen. Die Haare, die Zähne und die Nägel waren unauffällig. Es gab keinen Anhalt für Schwerhörigkeit.

Patientin 20

▼ 48 

Bei der ebenfalls als Kollodiumbaby geborenen Patientin 20, Tochter von Patientin 18, zeigte sich eine milde Ausprägung der Ichthyose. Die Lichenifikationen erschienen im Bereich der Handgelenke und Kniekehlen hyperpigmentiert. Außerdem waren Lichenifikationen in der Achselhöhle, den Ellenbeugen und periumbillical sichtbar. Die Haut über den Fingerknöcheln wies eine deutliche Verdickung auf (prominente Fingerknöchel) (Abb. 14). Auch schien die Palmoplantarkeratose palmar stärker ausgeprägt als plantar. Wie bei Patientin 18 zeigte die PPK sich honigwabenförmig und auf Handinnenflächen und Fußsohlen begrenzt. Einschnürungen oder Amputationen waren nicht auffindbar. Die Patientin hatte, wie auch ihre Mutter (Patientin 18) Neurodermitis. Leichte Excoriationen befanden sich im Unterarmbereich. Die Haare, die Zähne und die Nägel waren unauffällig. Es gab keinen Anhalt für Schwerhörigkeit.

Abb. 12: Patientin 18, honigwabenförmige Palmoplantarkeratose ohne Konstrikturen der Finger mit Lichenifikationen über dem Handgelenk

Abb. 13: Patientin 18, Lichenifikationen in der Ellenbeuge

▼ 49 

Abb. 14: Patientin 20, prominente Fingerknöchelverdickungen

3.5 Merkmale im Literaturvergleich

Im Folgenden werden Publikationen verglichen, welche Mutationen im Loricrin-Gen beschreiben. Dadurch sollte der eigene Mutationsbefund besser eingeordnet und eine mögliche Genotyp/Phänotyp-Beziehung untersucht werden.

Verglichene Publikationen:

▼ 50 

Armstrong4

Ishida-Yamamoto30

Korge41

▼ 51 

Maestrini50

Matsumoto53

O’Driscoll60

▼ 52 

Takahashi76

Von der Autorin wurden anhand der in den Publikationen aufgeführten Merkmale entsprechend der Häufigkeit des Auftretens neun Merkmale festgelegt:

▼ 53 

Für alle sieben publizierten Familien lagen auswertbare Ergebnisse vor. Ein Merkmal wurde als vorhanden gewertet, wenn es bei mindestens einem Familienmitglied beschrieben wurde. Durch die Auswertung ergaben sich für diese sieben Familien unter der Betrachtung von neun untersuchten Merkmalen 63 Einzelereignisse. Hierbei wurden 30-mal Merkmale beschrieben (47,6%), 13-mal wurde das Vorhandensein von einzelnen Merkmalen verneint (20,6%) und in 20 Fällen wurden keine oder ungenaue Angaben gemacht (31,8%).

In einer tabellarischen Auswertung wurden prozentuale Angaben erstellt (Tabelle 2).

Als gesamt wurde die Häufigkeit definiert, mit welcher das jeweilige Merkmal bei allen sieben Familien vorkam.

▼ 54 

Als anteilig wurde die Häufigkeit definiert, mit welcher das jeweilige Merkmal in den Familien vorkam, für die eine Angabe erhältlich war.

Tabelle 2: Merkmalauswertung für publizierte Familien

 

vorhanden

Nicht

vorhanden

keine

Angabe

gesamt

anteilig

Wabenförmige, diffuse PPK

7

0

0

100%

100%

Ichthyose

7

0

0

100%

100%

Pseudoainhums

7

0

0

100%

100%

Autoamputationen

2

5

0

28,6%

28,6%

Kollodiumbaby

2

0

5

28,6%

100%

Prominente Fingerknöchel

1

0

6

14,3%

100%

Seesternförmige Hyperkeratosen

1

2

4

14,3%

33,3%

Hyperkeratosen Knie, Ellenbogen

2

0

5

28,6%

100%

Schwerhörigkeit

1

6

0

14,3%

14,3%

30

13

20

  
 

47,6%

20,6%

31,8%

  

Aus den Publikationen wurden noch folgende assoziierte Merkmale bei jeweils einer Familie entnommen:

▼ 55 

Eine Einzelauswertung in Bezug auf die betroffenen Personen der publizierten Familien gestaltete sich als kompliziert. Besonders in der Publikation von Maestrini und Mitarbeitern 50 wurden klinische Merkmale nur zusammenfassend für den gesamten Stammbaum beschrieben, woraus sich nicht auf die Merkmale von Einzelpersonen schließen ließ. Daher wurde diese Publikation in die Einzelauswertung nicht mit einbezogen. Die Angaben der Publikation von Korge und Mitarbeitern41 ließen sich durch persönliche Nachfrage 55 weitgehend vervollständigen und damit integrieren.

Zur Auswertung eigneten sich Merkmale von 19 Personen (13 Frauen und 6 Männer) aus sechs Familien, die anhand der neun untersuchten Merkmale 171 Einzelereignisse lieferten. Hierbei wurden 76-mal Merkmale beschrieben (44,5%), 45-mal wurde das Vorhandensein von einzelnen Merkmalen verneint (26,3%) und in 50 Fällen wurden keine oder ungenaue Angaben gemacht (29,2%).

▼ 56 

In einer tabellarischen Auswertung wurden prozentuale Angaben erstellt (Tabelle 3). Gesamt und anteilig entsprachen der oben angeführten Definition.

Tabelle 3: Merkmalauswertung Individuen der publizierten Familien

 

vorhanden

nicht

vorhanden

keine

Angabe

gesamt

anteilig

Wabenförmige, diffuse PPK

19

0

0

100%

100%

Ichthyose

19

0

0

100%

100%

Pseudoainhums

17

2

0

89,5%

89,5%

Autoamputationen

2

17

0

10,5%

10,5%

Kollodiumbaby

4

0

15

21,1%

100%

Prominente Fingerknöchel

7

0

12

36,8%

100%

Seesternförmige Hyperkeratosen

0

8

11

0%

0%

Hyperkeratosen Knie, Ellenbogen

7

0

12

36,8%

100%

Schwerhörigkeit

1

18

0

5,3%

5,3%

76

45

50

  
 

44,5%

26,3%

29,2%

  

3.6 Diagnostik für Patienten mit der Verdachtsdiagnose Loricrin-Keratoderma

Aus der etablierten Sequenzierung konnte im weiteren Verlauf eine Standarddiagnostik zur Fragestellung Loricrin-Keratoderma entwickelt werden. Es wurden vier Proben mit der Verdachtsdiagnose Vohwinkel-Syndrom Typ Camisa aus verschiedenen Teilen Deutschlands bearbeitet. Ein Problem bestand darin, dass ein Insertionspolymorphismus von Glycin, Glycin, Serin, Glycin in Loricrin in der Bevölkerung vorkommt28. Aufgrund dessen war die Sequenz mit dem Primer LOR_3_F bei einer heterozygoten Insertion des Öfteren nicht bis zum Ende der kodierenden Sequenz auswertbar. Die am Besten zu verwertenden Ergebnisse wurden durch den Einsatz des Rückwärtsprimers LOR_R erzielt. Da auch die Qualität der DNA-Proben unterschiedlich zu sein schien, war der Primer LOR_A_F nicht immer bis zum Anfang des Primers LOR_3_F auswertbar. Weitere Probesequenzierungen ergaben hier sehr gute Resultate mit dem Primer LOR_AC_F. Die zusätzlichen Primer LOR_AC_F und LOR_R ermöglichten somit eine Sequenzierung des gesamten codierenden Bereichs von LOR. Eine Mutation in diesem Bereich konnte in allen untersuchten Fällen ausgeschlossen und in keinem Diagnostikfall eine positive Diagnose gestellt werden.

3.7 RNA-Extraktion

▼ 57 

Ein weiterer Teil der Arbeit bestand in der Extraktion und Amplifikation von LOR-RNA. Die RNA-Extraktion wurde benötigt, um anschließend die daraus gewonnene cDNA mithilfe von Pyrosequenzierung auf Expressionsunterschiede zwischen den Allelen zu untersuchen.

Als Kontrolle der erfolgreichen RNA-Extraktion und DNA-Synthese galt die Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase-PCR, da die RNA des Enzyms Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase (G6P) in fast jeder Zelle vorkommt. Die G6P-Primer wurden so gewählt, dass diese in zwei verschiedenen Exons des G6P-Gens lokalisiert waren und mindestens ein Intron in der zu amplifizierenden Sequenz lag. Dadurch hat das G6P-DNA-PCR-Produkt eine längere Sequenz als das G6P-RNA-PCR-Produkt, da bei der RNA im Splicevorgang die Introns entfernt wurden. Anhand der unterschiedlichen Länge der PCR-Produkte war daher gut erkennbar, ob ein DNA- oder ein RNA-Produkt vorlag. Bei der kodierenden Sequenz von LOR war dies leider nicht möglich, da sich diese Sequenz nicht über ein Intron auf zwei Exons erstreckt und kein Splicen erfolgt. Daher wurde hier als Kontrolle aus denselben RNA-Proben auch eine G6P-PCR durchgeführt, um eine mögliche DNA-Kontamination feststellen zu können. Außerdem wurde in der Kontrollprobe ohne Reverse Transkriptase nach einem Produkt gesucht. Da hier keine RNA in cDNA umgewandelt wird, sprach das Vorhandensein eines Produktes in dieser Probe für eine DNA-Kontamination. Zu Beginn wurde ungewollt auch DNA extrahiert und somit auch amplifiziert (Abb. 15). Aus diesem Grunde fand im Vorfeld der RT-PCR eine Inkubation der RNA-Proben mit DNase zum Verdau der DNA statt.

Abb. 15: DNA Kontamination bei RNA aus Blut
(1) Loricrin-RNA mit Reverser Transkriptase; (2) Loricrin-DNA-Kontamination ohne Reverse Transkriptase; (3) G6P-RNA mit Reverser Transkriptase (4) G6P- DNA-Kontamination ohne Reverse Transkriptase

3.7.1 RNA-Extraktion aus Blut

▼ 58 

Als erster Teilschritt fand die Extraktion von RNA aus Blut statt. In der folgenden G6P-PCR war bei der cDNA-Probe eine deutliche Bande sichtbar. Mit dem Primerpaar LOR_C_F und LOR_R wurde versucht, LOR-cDNA zu amplifizieren. Eine starke DNA-Kontrollbande auf dem Agarose-Gel zeigte eine erfolgreiche Amplifikation an. Allerdings war kein cDNA-Produkt sichtbar (Abb. 16).

Abb. 16: RNA-Extraktion aus Blut
(1-3) Loricrin-RNA mit LOR_C_F und LOR_R; (1) RNA mit Reverser Transkriptase (2) RNA ohne Reverse Transkriptase (3) Kontroll-DNA (4-6) G6P; (4) RNA mit Reverser Transkriptase (5) RNA ohne Reverse Transkriptase (6) Kontroll-DNA

3.7.2 RNA-Extraktion aus Haarwurzeln

Im zweiten Ansatz wurde RNA aus Haarwurzeln gewonnen, da diese Hautanhangsgebilde sind und manchmal auch hautspezifische Gene exprimieren. Bei der folgenden PCR ließ sich ebenfalls eine zufrieden stellende Menge an G6P-cDNA amplifizieren. Das Primerpaar LOR_C_F und LOR_R hingegen ergab nur ein schwaches Produkt (Abb. 17). Daraufhin wurde versucht, mit dem PCR-Produkt eine weitere PCR unter den gleichen Bedingungen mit demselben Primerpaar durchzuführen, um ein stärkeres Produkt zu erhalten. Dies führte zu keiner zunehmenden Amplifikationsmenge. Das zu einem späteren Zeitpunkt eingesetzte Primerpaar LOR_AC_F und LOR_P_Bio führte zu keiner Amplifikation (Abb. 18).

▼ 59 

Abb. 17: RNA-Extraktion aus Haarwurzeln
(1-4) Loricrin-RNA mit LOR_C_F und LOR_R; (1) RNA mit Reverser Transkriptase (2) RNA ohne Reverse Transkriptase (3) Kontroll-DNA (4) Leerwert (5-8) G6P; (5) RNA mit Reverser Transkriptase (6) RNA ohne Reverse Transkriptase (7) Kontroll-DNA (8) Leerwert

Abb. 18: RNA-Extraktion aus Haarwurzeln
(1-4) Loricrin-RNA mit LOR_AC_F und LOR_P_Bio; (1) RNA mit Reverser Transkriptase (2) RNA ohne Reverse Transkriptase (3) Kontroll-DNA (4) Leerwert (5-8) G6P; (5) RNA mit Reverser Transkriptase (6) RNA ohne Reverse Transkriptase (7) Kontroll-DNA (8) Leerwert

3.7.3 RNA-Extraktion aus Haut

Erst nachdem sich Loricrin-RNA weder aus Blut noch aus Haaren in zufrieden stellender Menge amplifizieren ließ, wurde RNA aus Haut extrahiert. Die daraus entstandene cDNA ließ sich sowohl mit den G6P-Primern als auch mit LOR_AC_F und LOR_P_Bio in ausreichendem Maße amplifizieren (Abb. 19). Auf die Verwendung des Primerpaares LOR_C_F und LOR_R konnte verzichtet werden, da die anderen Primer bereits aussagekräftige Ergebnisse lieferten. Außerdem wurde für die folgenden Versuche nur das Produkt des Primerpaares LOR_AC_F und LOR_P_Bio benötigt. Bei der Verwendung des „RNeasy® Lipid Tissue Mini Kits“ konnte auf den DNase-Verdau-Schritt verzichtet werden, da die Ergebnisse gleichermaßen frei von DNA waren (Abb. 20).

▼ 60 

Abb. 19: RNA-Extraktion aus Haut
(1-4) Loricrin-RNA mit LOR_AC_F und LOR_P_Bio; (1) RNA mit Reverser Transkriptase (2) RNA ohne Reverse Transkriptase (3) Kontroll-DNA (4) Leerwert (5-8) G6P; (5) RNA mit Reverser Transkriptase (6) RNA ohne Reverse Transkriptase (7) Kontroll-DNA (8) Leerwert

Abb. 20: RNA-Extraktion aus Haut; G6P
(1) RNA mit Reverser Transkriptase und ohne DNase-Verdau (2) RNA ohne Reverse Transkriptase ohne DNase-Verdau (3) RNA mit Reverser Transkriptase und mit DNase-Verdau (4) RNA ohne Reverse Transkriptase mit DNase-Verdau (5-6) Kontroll-DNA (7) Leerwert

3.8 Expressionsanalyse auf RNA-Ebene

3.8.1 SNP-Suche

Zur Expressionsanalyse auf RNA-Ebene fand die Pyrosequenzierungsmethode Anwendung. Zu Beginn wurden die LOR-Sequenzen aller Mitglieder der Familie MDC-804 manuell nach Einzelnukleotid-Polymorphismen („Single Nucleotide Polymorphism“; SNP) durchsucht. Dabei ergaben sich im kodierenden Bereich zwei polymorphe Positionen, an denen betroffene Familienmitglieder heterozygot waren. Beim Abgleich mit der NCBI-Datenbank wurden diese polymorphen Positionen als SNP rs6661601 und rs1143390 identifiziert. Beide SNPs liegen im kodierenden Bereich von LOR. Die Allelfrequenzen wurden in der NCBI-Datenbank nicht angegeben. Bei dem SNP rs1143390 kommt es durch den Basenaustausch zu keiner Veränderung der Aminosäure Glycin. Der SNP rs6661601 wiederum führt zu einem Aminosäurenaustausch von Serin zu Glycin. Diese ausgetauschte Aminosäure wird von 12 Glycin-Aminosäuren flankiert. Wie schon in Abschnitt 1.2.3 erwähnt führen einzelne Veränderungen von Aminosäuren in den Glycin-„Loops“ zu keinen funktionellen Veränderungen 28. Daher ist auch an dieser Stelle von keiner funktionellen Veränderung des Proteins Loricrin auszugehen.

▼ 61 

Anschließend erfolgte eine manuelle Haplotypisierung (Abb. 21) der Familie MDC-804. Patientin 20 war in Bezug auf rs6661601 heterozygot mit den Basen Guanin/Adenin. Aus der Haplotypisierung war ersichtlich, dass die Base Guanin mit der Mutation assoziiert war, da sowohl die Mutter (Patientin 18) als auch die Großtante (Patientin 16) für diesen SNP homozygot Guanin aufwiesen. Außerdem zeigte der gesunde Vater (Patient 19) für rs6661601 eine Homozygotie in Bezug auf Adenin. Für rs1143390 waren Patientin 18 und 16 heterozygot Cytosin/Adenin. Hier war die Assoziation von Cytosin mit der Mutation aus der Haplotypisierung erkennbar. Patient 14 konnte aufgrund seiner Homozygotie nur Cytosin an seine Tochter (Patientin 18) vererben. Patientin 16 konnte nur Adenin an ihren gesunden Sohn (Patient 22) vererben, da dieser homozygot für Adenin war. Es hat somit eine Weitervererbung von Adenin mit dem Wildtyp-Allel stattgefunden. Im Weiteren wurde der SNP rs1143390 verwendet, da sich Patientin 16 zu einer Hautspende bereit erklärte.

3.8.2 Pyrosequenzierung

Im folgenden Verlauf fand die Etablierung der PCR für die Pyrosequenzierung statt. Auch diese Replikation gestaltete sich problematisch. Der zuerst verwandte Primer LOR_P_F war nur ein Basenpaar länger als der Primer LOR_C. Jedoch wies LOR_P_F laut Vorschlag des Computerprogramms Primer 3 eine passendere Annealing-Temperatur zum Rückwärtsprimer LOR_P_Bio auf. Deshalb wurde zur PCR anfänglich das Primerpaar LOR_P_F und LOR_P_Bio verwendet. Diese Primer amplifizierten ein Produkt von 233 Basenpaaren. Mit der Zugabe von DMSO ließ sich kein sichtbares Produkt amplifizieren. Betain-Monohydrat hingegen wirkte sich förderlich auf die Amplifikation aus.

▼ 62 

Es erfolgte eine Verlängerung des Annealing- und des Extensionsschritts des PCR-Programms. Bei den Temperaturen von 57°C bis 65°C in Abständen von jeweils 1°C wurden die folgenden Konzentrationsgradienten untereinander ausgetestet:

Selbst unter den dabei als optimal ermittelten Bedingungen bei einer Annealing-Temperatur von 58°C, 25 nmol MgCl2, 1,25 nmol dATP, dCTP, dGTP, dTTP und 5 nmol von jedem Primer ergaben sich unsaubere und nicht genau auswertbare Pyrosequenzierungsergebnisse. Eine einfache Aufreinigung des PCR-Produktes mit „Millipore Amicon®Microcon®-PCR Centrifugal Filter Devices“ zeigte keine besseren Ergebnisse. Bei der Aufreinigung aus Agarose-Gelen waren die Ergebnisse zwar sauber, aber so schwach, dass nur mit vierfachem Ansatz verwertbare Ergebnisse erzielt werden konnten. Hier konnte auch nicht das später verwandte Aufreinigungskit von Millipore benutzt werden, da sich das Endvolumen als zu groß und zu wenig konzentriert für die Weiterverarbeitung erwies. Bei der Aufreinigung mit Glasmilch („Gene Clean III Kit“) ergab sich ein zu hoher Produktverlust. Nur mit dem „Spin DNA Extraction Kit“ von Invisorb konnte aufgrund der Aufreinigung über eine Säule das Endvolumen verringert und die Endkonzentration erhöht werden. Dadurch war ein großer Einsatz von DNA und cDNA nötig. Aus diesem Grunde wurden neue Primer entworfen. Dieser neue Vorwärtsprimer wies eine zusätzliche Base Thymin auf, welche in der eigentlichen Sequenz nicht vorkam. Das Thymin wurde in der PCR mit amplifiziert und sollte dadurch die Bildung von Sekundärstrukturen des Produktes verringern.

▼ 63 

Das neu eingesetzte Primerpaar LOR_AR_F und LOR_AC_R stellte sich als nicht spezifisch genug heraus, da durchweg zwei Produkte verschiedener Länge amplifiziert wurden. Daraufhin fand eine Amplifikation von LOR_P_F mit LOR_AC_R und LOR_AC_F mit LOR_P_Bio statt. Letzteres Primerpaar führte dann zu einem spezifischen Produkt. Dieses Produkt hatte eine Länge von 353 Basenpaaren. Auch hier wurden die oben aufgeführten Temperaturen und Konzentrationsgradienten ausgetestet. Die Enddaten sind dem Teil Methoden (Abschnitt 2.2.1.7) zu entnehmen. Eine Gelaufreinigung mit „Millipore Ultrafree®-DA“ erwies sich als immer noch notwendig, um saubere Leerwerte nicht nur in der PCR-Kontrolldokumentation auf dem Agarose-Gel, sondern auch nach der Pyrosequenzierung zu erhalten. Ähnlich gute Ergebnisse wurden ohne Gelaufreinigung durch die Zugabe von 900 ng SSBP vor der Sequenzierung erzielt. Im Weiteren kam das SSBP zum Einsatz, da dieses zu weniger Produktverlust führte und weniger Aufwand verursachte.

Es schlossen sich Versuche zur Verstärkung der Pyrosequenzierungssignale an, indem die Primerkonzentration verdoppelt oder das Zweifache des Produktes eingesetzt wurde. Dieses Vorgehen führte jedoch zu keinen stärkeren Pyrosequenzierungsprodukten.

3.8.3 Auswertung

Wie aus Abb. 20 ersichtlich, erwies sich der DNase-Verdau bei den Produkten der cDNA von Hautproben als nicht notwendig.

▼ 64 

Nach erfolgreicher Etablierung der einzelnen Schritte wurden mehrere Messreihen mit folgenden Proben durchgeführt:

Zur Auswertung wurden nur die fünf Messreihen herangezogen, die eindeutig keine DNA-Spuren in der RNA-Leerprobe nach der Sequenzierung aufwiesen (Abb. 22, Abb. 23 und Abb. 24). Mit Hilfe der PSQ HS 96 A Software Version 1.1 konnten automatisch die prozentualen Anteile der beiden Basen Adenin und Cytosin errechnet werden. Für jede der beiden Basen wurde der Mittelwert der RNA-Messungen von Patientin 16 und der DNA-Messungen der Patientinnen 16 und 18 berechnet. Die DNA-Aufteilung der Allele zeigte im Mittelwert 44,5% für Adenin und 55,5% für Cytosin. Diese Werte waren bei beiden DNA-Proben der Patientinnen 16 und 18 kongruent. Das mit der Mutation assoziierte Cytosin-Allel zeigte bei der RNA der Patientin 16 im Mittelwert eine prozentuale Senkung von 2,8 auf 52,7% auf. Es lag auch jeder RNA-Einzelwert unter dem dazugehörigen DNA-Wert. Der Mittelwert von dem gesunden Allel mit Adenin wies kompensatorisch eine Erhöhung um 2,8 auf 47,3% auf (Abb. 25).

▼ 65 

Abb. 22: Pyrogramm; RNA aus Haut der Patientin 16
mit Reverser Transkriptase

Abb. 24: Pyrogramm; DNA der Patientin 16

▼ 66 

Abb. 25: Prozentuale Verteilung der Allelkonzentrationen A bzw. C in RNA und DNA gebildeter Mittelwert sowie minimaler und maximaler gemessener Anteil bei fünffacher Bestimmung von Patientin 16 (n=1)


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
XDiML DTD Version 4.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
22.06.2006