4 Diskussion

4.1 Genetische und klinische Diagnose

▼ 66 (fortgesetzt)

Ein Hauptziel dieser Arbeit war die Feinkartierung der Familie MDC-804 mit der Verdachtsdiagnose ADLI und anschließender Kandidatengensuche. Ein etwas unerwarteter Mutationsfund im Loricrin-Gen führte zu einer Reevaluation der klinischen Befunde der Familie MDC-804 und zur Diagnose Loricrin-Keratoderma.

4.1.1 Kandidatengensuche

Bei der Familie MDC-804 wurde ursprünglich die Verdachtsdiagnose ADLI gestellt. In der genomweiten Kartierung ergab sich bei der Familie ein maximaler Lod-Wert von 2,8 für den Marker bei D1S498. Erst ein Lod-Wert über 3,0 gilt als signifikant. Jedoch wurde hier der maximale Wert für die Familiengröße von 13 Mitgliedern erreicht, da der zu erwartende Lod-Wert („elod“) nur bei 2,6 lag. Die Haplotypisierung der Familie mit anschließender Feinkartierung im kritischen Bereich engte die Kandidatengenregion auf 23,38 cM ein. Die Größe der Familie erwies sich als ausreichend, um eine eindeutige Zuordnung der einzelnen Haplotypen vorzunehmen.

▼ 67 

Interessanterweise befand sich in der Kandidatengenregion der epidermale Differenzierungskomplex (EDC). Für diesen Bereich wurden genetische und physikalische Karten schon miteinander verglichen 51. Diese Ergebnisse stimmten auch mit den Daten der NCBI-Datenbank und somit mit den Ergebnissen des Humangenomprojektes überein. Somit konnte auf eigenständige Vergleiche verzichtet werden. Im Rahmen des Humangenomprojektes waren zwischen 1996 und 2004 neue Gene der SPR- und S100A-Gruppe gefunden worden, die noch nicht bei Marenholz und Mitarbeitern51 verzeichnet waren. Die Reihenfolge der SPR- und S100A-Untergruppen wurde vorerst nicht überprüft, da als Kandidatengene vor allem FLG,IVL und LOR in Betracht kamen, deren Proteine eine große Rolle bei dem Aufbau des CE spielen. Da in LOR schon Mutationen beschrieben wurden, bot es sich als erstes Kandidatengen an.

4.1.2 Mutationsfund

Der Fund einer schon beim Vohwinkel-Syndrom Typ Camisa beschriebenen Mutation, 730insG, führte zu der Frage, ob es sich beim Vohwinkel-Syndrom Typ Camisa und der ADLI um alleleische Krankheiten handelte. Diese Frage konnte weitestgehend verneint werden, da in der original von Traupe und Mitarbeitern beschriebenen Familie B-460184 sowie drei anderen Familien (B-4555, B-4565 und B-4571) keine Mutationen im kodierenden Bereich von Loricrin nachgewiesen werden konnten. Allerdings kann nur bei der Familie B-4601 eindeutig von einer autosomal dominanten Vererbung ausgegangen werden. In der Familie B-4571 wurde im Nachhinein eine Mutation im Lipoxygenase-Gen ALOX12B nachgewiesen14. Bei den Familien B-4555 und B-4565 ist eine autosomal dominante Segregation nur unter der Annahme verminderter Penetranz möglich, wie es in der Literatur beschrieben wurde81.

Aufgrund dieser Sachlage entschied sich die Autorin zu einem Vergleich der Merkmale der publizierten Familien mit Mutationen im Loricrin-Gen.

4.1.3 Merkmaldiskussion für Mutationen im Loricrin-Gen

▼ 68 

Bei der Literaturanalyse wurden im Ergebnisteil (siehe Abschnitt 3.5) neun mögliche Merkmale definiert. Die Betrachtung dieser Merkmale erfolgte einerseits für Familien und andererseits für einzelne Individuen aus diesen Familien. Der erhöhte Anteil von Frauen ist auf die geringe Zahl der detailliert beschriebenen Individuen und somit nur bedingt repräsentativen Fallgruppe zurückzuführen. Bei Betrachtung großer Stammbäume mit Betroffenen ergibt sich in aufeinanderfolgenden Generationen eine gleiche Verteilung von Männern und Frauen. Außerdem wurden Vater-Sohn-Vererbungen beobachtet50. Daher kann von einem autosomal dominanten Vererbungsmodus ausgegangen werden.

Der Literaturvergleich ergab, dass alle Patienten eine honigwabenförmige Palmoplantarkeratose und generalisierte Ichthyose hatten. Beide Merkmale variierten im Schweregrad, so dass ein Patient aufgrund sehr guter Handpflege fast gar keine PPK aufwies 55.

Die Pseudoainhums gelten beim Vohwinkel-Syndrom Typ Camisa als Leitmerkmal. Bei Betrachtung der Familienauswertung traten in allen Familien (100%) Pseudoainhums auf. Nur bei der Auswertung der einzelnen Patienten verringerte sich der Gesamtteil auf 89,5%. Dabei ist wichtig zu bemerken, dass in der von Camisa beschriebenen Familie auch eine der drei Patientinnen keine Pseudoainhums aufwies11. Die aus den Pseudoainhums resultierenden Autoamputationen traten nur in drei Familien, davon in zwei Familien gehäuft, und daher nur bei 10,5% der Individuen auf. Daher können weder Autoamputationen noch Pseudoainhums als Leitmerkmal aufgefasst werden.

▼ 69 

Unter Einbeziehung aller Patienten wurden nur 28,6% als Kollodiumbaby geboren. Im Vergleich dazu waren es aber 100% bei der relativen Auswertung, welches an der häufig nicht getätigten Angabe des Merkmals lag. Ein Erklärungsansatz hierfür könnte sein, dass Ereignisse, die im Zusammenhang mit der Geburt der Patienten stehen, häufig nicht erfasst sind.

Das Merkmal Kollodiumbaby sollte daher als fakultativ berücksichtigt werden. Dies könnte dazu führen, dass in Zukunft häufiger Angaben zur Geburt als Kollodiumbaby gemacht werden, und damit die Häufigkeit dieses Merkmals reevaluiert würde.

Das Merkmal prominente Fingerknöchel wurde nur bei einer Familie beobachtet und floss in die Einzelauswertung mit sieben Individuen ein. Dies erklärt den erhöhten Wert in der Individuenauswertung, da die meisten anderen Familien nur mit ein bis drei Patienten in die Einzelauswertung eingingen. Allerdings ist der Einwand zu berücksichtigen, dass dieses Merkmal leicht übersehen werden kann. Daher kann nicht davon ausgegangen werden, dass alle Familien, die unter keine Angabe gewertet wurden, keine prominenten Fingerknöchel aufwiesen. Auch auf dieses Merkmal sollte deshalb in Zukunft genauer geachtet werden.

▼ 70 

Seesternförmige Hyperkeratosen sind für das echte Vohwinkel-Syndrom typisch und nur in der Publikation von Maestrini und Mitarbeitern50 beschrieben. Diese Arbeit wurde wegen der Familiengröße nicht in die Individuenauswertung aufgenommen, weil die Merkmale einerseits nur allgemein beschrieben wurden und andererseits die Familiengröße die Statistik verfälschen würde. Da die seesternförmigen Hyperkeratosen ein auffälliges Merkmal sind, kann davon ausgegangen werden, dass das Merkmal tatsächlich nicht vorhanden war, wenn keine Angabe getätigt wurde. Daher zählen seesternförmige Hyperkeratosen nicht zu den typischen Merkmalen des Vohwinkel-Syndroms Typ Camisa.

Hyperkeratosen der Knie oder Ellenbögen waren in 28,6% der Familien erkennbar. Bei der von Korge und Mitarbeitern41 beschrieben Familie konnte auch durch persönliche Nachfrage nicht in Erfahrung gebracht werden, wie viele Patienten dieses Merkmal aufwiesen. Deshalb mussten bei der Individuenauswertung alle Personen dieser Familie unter der Rubrik keine Angabe aufgeführt werden. Die andere Familie, die Hyperkeratosen an Knien oder Ellenbögen aufwies, ist in der Individuenauswertung wiederum mit sieben Individuen vertreten. Die restlichen Familien fließen nur mit ein bis drei Individuen in die Auswertung ein. Der Wert der Rubrik vorhanden ist einerseits durch ungenaue Angaben bei Korge und Mitarbeitern41 fälschlich erniedrigt, andererseits durch die hohe Individuenzahl bei der anderen Familie erhöht. Trotzdem kann im Mittel der Wert der Rubrik vorhanden als repräsentativ genutzt werden. Hyperkeratosen an Knien oder Ellenbögen können somit als fakultatives Merkmal angesehen werden.

Schwerhörigkeit wurde nur bei einer Person aus einer Familie, die nur ein betroffenes Individuum aufwies, beobachtet. Da Schwerhörigkeit das zweite Hauptmerkmal des echten Vohwinkel-Syndroms und somit den Hauptunterschied zur Camisa-Variante darstellt, ist hier wohl eher davon auszugehen, dass es sich um eine zufällige Assoziation handelt.

4.1.4 Klinische Einordnung der Familie MDC-804

▼ 71 

Die Merkmale der lamellären Ichthyose sind in der Einleitung in Abschnitt 1.3 beschrieben worden. Die möglichen Merkmale des Vohwinkel-Syndroms Typ Camisa wurden im vorherigen Abschnitt erörtert.

Es folgt ein Vergleich der Merkmale der ADLI und des Vohwinkel-Syndroms Typ Camisa mit den Merkmalen der Familie MDC-804.

Vergleich der Merkmale der ADLI

▼ 72 

Die untersuchten Patientinnen der Familie MDC-804 wiesen eine sehr leichte lamelläre Ichthyose mit PPK auf. Außerdem wurden sie als Kollodiumbaby geboren. Diese Merkmale stimmen mit denen einer milden ADLI überein. Allerdings sind bei ADLI die Lichenifikationen eher dorsal gelegen84, während sie bei den Patientinnen der Familie MDC-804 an den Flexorenseiten lokalisiert waren. Da diese besonders bei Patientinnen 18 und 20 sichtbar waren, ist nicht auszuschließen, dass auch die Neurodermitis, die beide zusätzlich aufwiesen, Ursache für die Lichenifikationen ist. Über starken nicht-neurodermitis-assoziierten Juckreiz klagte nur der von Professor Traupe untersuchte Patient 09. Außerdem ist bei ADLI die PPK, die sich bei den Patientinnen palmar prominenter darstellte, mehr plantar als palmar ausgebildet.

Vergleich der Merkmale des Vohwinkel-Syndroms Typ Camisa

Bei der Zweituntersuchung der Familie MDC-804, bei der gezielt die Merkmale des Vohwinkel-Syndroms berücksichtigt wurden, waren besonders bei der Patientin 18 die honigwabenförmige PPK und bei Patientin 20 die prominenten Fingerknöchel zu erkennen. Demgegenüber fehlten bei allen Familienmitgliedern die Konstriktionen der Finger, die bislang als Leitmerkmal für das Vohwinkel-Syndrom galten. Zusammenfassend wies die Familie folgende vier der im Literaturvergleich (Abschnitt 3.5) definierten Merkmale auf:

▼ 73 

Die genetische Diagnose Loricrin-Keratoderma ist demnach auch in klinischer Hinsicht nachvollziehbar.

Analog zu der beschriebenen Familie MDC-804 hatte auch die von Matsumoto und Mitarbeitern publizierte Familie53 mit einer Mutation im Loricrin-Gen die Diagnose lamelläre Ichthyose erhalten. Hier war, anders als bei der Familie MDC-804, eine deutliche Erythrodermie sichtbar. Eine weitere Familie mit Erythrodermie und Mutation im Loricrin-Gen wurde als progressive symmetrische Erythrokeratodermie beschrieben30. Allerdings fand bei beiden erwähnten Familien nach Mutationsfund keine erneute Evaluation der Merkmale statt. Genauso wie Matsumoto und Mitarbeiter53 und Ishida-Yamamoto und Mitarbeiter 30 beschrieben Armstrong und Mitarbeiter eine Familie mit Erythrodermie, hier in Form erythematöser Hyperkeratosen der Beugeseiten der Handgelenke 4. Dies führte allerdings zu keiner andersartigen Diagnose. Diese Bespiele wie auch der diagnostische Werdegang dieser Arbeit weisen auf die besonderen Schwierigkeiten der Diagnosestellung von Loricrin-Keratoderma hin und zeigen, wie wichtig klare Merkmaldefinition und genetische Diagnose sind. Die Merkmale werden im folgenden Abschnitt zusammenfassend definiert. Auf die Schwierigkeiten der Diagnosestellung wird gesondert in Abschnitt 4.2 eingegangen.

4.1.5 Definition der klinischen Merkmale von Loricrin-Keratoderma

▼ 74 

Unter Berücksichtigung der vorangegangenen Abschnitte 4.1.3 und 4.1.4 lassen sich eine honigwabenförmige PPK und eine leichte Ichthyose als Hauptmerkmale für Loricrin-Keratoderma definieren. Diese waren bei allen erkrankten Personen der in der Literatur beschriebenen Familien wie auch bei der Familie MDC-804 vorhanden. Die Wichtigkeit des Merkmals Ichthyose zeigt weiterhin eine andere Familie mit honigwabenförmiger PPK aber ohne Ichthyose, die keine Mutation in LOR aufwies 1. Dagegen sollten die Pseudoainhums nicht mehr als Leitmerkmal, sondern als häufig auftretendes Nebenmerkmal bezeichnet werden, da bei der hier beschriebenen Familie MDC-804 kein einziges Mitglied Pseudoainhums aufwies. Außerdem sind Pseudoainhums auch bei folgenden PPKs beschrieben worden:

Auch bei der autosomal rezessiven lamellären Ichthyose wurden Pseudoainhums beschrieben 3 13 15.

▼ 75 

Zusammenfassend lassen sich folgende Haupt- und Nebenmerkmale für Loricrin-Keratoderma definieren:

Hauptmerkmale:

Honigwabenförmige Palmoplantarkeratose

▼ 76 

Leichte Ichthyose

Nebenmerkmale:

Pseudoainhums (häufig)

▼ 77 

Autoamputationen

Geburt als Kollodiumbaby

Prominente Fingerknöchel

▼ 78 

Hyperkeratosen an Bereichen wie Knien und Ellenbögen

4.2 Nomenklaturschwierigkeiten

Der Name Vohwinkel-Syndrom Typ Camisa bereitet bei der Abgrenzung zum ursprünglich beschriebenen Vohwinkel-Syndrom, welches behelfsweise echtes („true“) Vohwinkel-Syndrom genannt wird, Schwierigkeiten. Dies kann einer der Gründe dafür sein, dass der genetische Name Loricrin-Keratoderma fast äquivalent für Vohwinkel-Syndrom Typ Camisa verwendet wird. Unter der Bezeichnung Loricrin-Keratoderma wird die Heterogenität der klinischen Diagnosen von Familien mit Mutationen in LOR zusammengefasst. Es handelt sich dabei also um eine genetische Nomenklatur, welche nichts über die klinische Diagnose aussagt. Rückschlüsse, welche Krankheiten von LOR verursacht werden, können nur vorsichtig vorgenommen werden. So wurde zumindest für die symmetrische progressive Erythrodermie LOR als Gen ausgeschlossen 25 45. Auch die Schlussfolgerung, dass LOR für die autosomal dominante Form der lamellären Ichthyose verantwortlich sein soll67, ist aufgrund der Ergebnisse dieser Arbeit eher unwahrscheinlich. Nach Reevaluation der klinischen Merkmale der Familie MDC-804 wurde die Diagnose ADLI revidiert. Die beiden Familien mit fraglicher symmetrischer progressiver Erythrodermie beziehungsweise lamellärer Ichthyose wiesen sowohl eine honigwabenförmige PPK und Ichthyose als auch Pseudoainhums auf. Dem zu Folge ist es auch durchaus denkbar, diese als Subtypen des Phänotyps von Loricrin-Keratoderma zu klassifizieren. Aus diesem Grund ist es wichtig, zusätzlich zu der genetischen eine passende klinische Nomenklatur zu finden.

Alternativ zum Vohwinkel-Syndrom Typ Camisa wird von OMIM die Bezeichnung mutilierende Keratodermie mit Ichthyose angegeben. Das in der Bezeichnung enthaltene Wort mutilierend [Latein: „mutilare“ – verstümmeln23] bezieht sich wahrscheinlich auf die Autoamputationen, welche nur bei 11 % aller Individuen beschrieben wurden. Daher sollte der Begriff mutilierende Keratoderma für die Bezeichnung des Olmsted-Syndroms vorbehalten bleiben, welches eine solche Verstümmelung einschließt. Alternativ wird diese PPK auch als mutilierende Palmoplantarkeratose mit periorifikalen keratotischen Plaques bezeichnet5. Bei dem Olmsted-Syndrom handelt es sich um eine von dem in dieser Arbeit diskutierten Phänotyp abzugrenzende Palmoplantarkeratose, da im Olmsted-Syndrom keine Loricrin-Mutation nachgewiesen werden konnte 61.

▼ 79 

Die Autorin gelangte auf der Basis der dargelegten Untersuchungen zu der Meinung, dass eine deskriptive Nomenklatur dem Eigennamen vorzuziehen ist. Dies sollte auch für den in dieser Arbeit erörterten und mit einer Loricrin-Mutation assoziierten Phänotyp umgesetzt werden. Die Autorin schlägt daher eine Bezeichnung nach den zwei Hauptmerkmalen vor: honigwabenförmige Palmoplantarkeratose mit Ichthyose 18.

4.3 Standarddiagnostik für LOR

4.3.1 PCR und Sequenzierung

Die Hauptprobleme während der PCR-Etablierung bestanden darin, dass LOR zu großen Teilen aus CG-Dinukleotiden besteht und viele repetitive Sequenzen aufweist. Die Suche nach geeigneten Primerpaaren und die Etablierung der jeweils optimalen Reaktionsbedingungen waren daher sehr aufwändig. Dabei wurden vor allen Dingen der Annealing- und der Elongationsschritt erfolgreich verlängert. Das eingesetzte DMSO und Betain vermindern die Ausbildung von Sekundärstrukturen bei CG-reichen Sequenzen und setzen somit die Annealing-Temperatur der Primer herab 8 24. Zusätzlich wurden die Konzentrationen der einzelnen Reagenzien individuell ausgetestet. Die Bedingungen wurden mit DNA etabliert und waren auf cDNA übertragbar.

Zur Sequenzierung wurden mehrere Primer benötigt, da die Sequenzen jeweils nur über kürzere Abschnitte auswertbar waren und teilweise Polymorphismen in Form von Insertionen auftraten, die das Lesen der nachfolgenden Sequenz bei heterozygoten Fällen ausschlossen. Auch für die Sequenzreaktion konnte das Standardprotokoll nicht übernommen werden. Die Einführung eines zusätzlichen Denaturierungsschrittes bei 98 °C vor der Sequenzreaktion lieferte die saubersten Sequenzen.

▼ 80 

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Sequenzierung von LOR bei Verdacht auf honigwabenförmige Palmoplantarkeratose mit Ichthyose oder Loricrin-Keratoderma als Standarddiagnostik angewandt werden konnte.

4.3.2 RNA-Isolation

Zuerst wurde die RNA-Isolation aus Blut durchgeführt. Die RNA des Enzyms Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase (G6P) ist in fast jeder Zelle vorhanden und kann daher gut als Kontrolle der Extraktion von RNA verwendet werden. Die Analyse ergab für die RNA der G6P eine ausreichende Menge zur Weiterverarbeitung. Für das Protein Loricrin konnten nur sehr geringe Mengen an RNA gewonnen werden. Dies ist darauf zurückzuführen, dass Loricrin ein gewebespezifisches Protein ist und demnach kaum in Blutbestandteilen exprimiert wird.

Anschließend erfolgte die Extraktion von RNA aus Haarwurzeln, da das CE in der äußeren Wurzelscheide der Haarwurzel sowie dem Isthmus, der Haarkutikula und dem Kanal nachgewiesen wurde 22. Auch hier konnte RNA der G6P gut extrahiert werden. Obwohl Loricrin Teil des CE ist, konnten wieder nur sehr geringe Mengen RNA gewonnen werden. Daher ist davon auszugehen, dass Haarwurzelzellen nur wenig Loricrin exprimieren.

▼ 81 

Als dritter Schritt erfolgte die Isolation von RNA aus Haut. Dabei war es möglich, sowohl RNA der G6P als auch Loricrin-RNA in ausreichenden Mengen zu isolieren. Dies lieferte einen weiteren Hinweis dafür, dass Loricrin hauptsächlich in der Haut exprimiert wird. Ein Nachteil dieser Methode ist es, dass die Hautprobengewinnung eine invasive Maßnahme darstellt.

Bei der Extraktion von RNA mittels „RNeasy® Protect Mini Kit“ aus Haarwurzeln und aus Haut wurde ungewollt ebenfalls DNA isoliert. Um ein reines RNA-Produkt zu erhalten, war jeweils eine Inkubation mit DNase zur Reinigung notwendig. Nur bei der Extraktion von RNA aus Haut mit dem „RNeasy® Lipid Tissue Mini Kit“ war auch ohne DNase-Verdau keine DNA-Kontamination vorhanden. Die systematischen Unterschiede in der ungewollten Isolierung von DNA wurden im Rahmen dieser Arbeit nicht weiter verfolgt.

Die Analyse von Loricrin-RNA durch RT-PCR und Sequenzierung war noch schwieriger als die Analyse auf der Basis von DNA. Aufgrund dessen empfiehlt es sich, zur Standarddiagnostik DNA einzusetzen. Besteht der Wunsch, auf RNA-Ebene Untersuchungen durchzuführen, sollte Loricrin-RNA aus Hautproben extrahiert werden.

4.3.3 Pyrosequenzierung

▼ 82 

Die Pyrosequenzierung wurde in der vorliegenden Arbeit zur Quantifizierung der Expression der beiden Allele des Gens LOR benutzt. Bei der Etablierung traten zwei große Probleme auf. Auf der einen Seite musste genügend PCR-Produkt zur Weiterverarbeitung vorhanden sein. Auf der anderen Seite durften nur wenige Störfaktoren, wie z. B. Biotin-markierte Primer, im PCR-Produkt übrig bleiben, um saubere Signale zu erhalten.

Der anfänglich verwandte Primer LOR_P_F bindet in dem Bereich des Pyrosequenzierungsprimers LOR_SNP. Dies erwies sich als ungünstig, da die Pyrogramme zu schwache Signale zeigten.

Da der Sequenzprimer für die Pyrosequenzierung direkt vor dem zu untersuchendem SNP liegen musste, wurden neue PCR-Primer entworfen. Das für die PCR letztendlich verwendete Primerpaar LOR_AC_F und LOR_P_Bio amplifizierte eine für die Pyrosequenzierung sehr lange Sequenz von 353 Basenpaaren. Trotzdem waren hier die Signale in den Pyrogrammen stärker, und es musste nur die einfache Produktmenge eingesetzt werden. Außerdem schien die dem Primer LOR_AC_F vorangestellte Base T das Bilden von Sekundärstrukturen der Einzelstränge zu erschweren und so zu sauberen Pyrogrammen beizutragen.

▼ 83 

Im weiteren Verlauf führten sowohl die Gelaufreinigung mit „Millipore Ultrafree®-DA“ als auch die Zugabe von SSBP zu sauberen Pyrogrammen. Allerdings bedingte die Gelaufreinigung durch das Ausschneiden des Produktes Verluste. Daher waren die Signale in den Pyrogrammen der Proben mit SSBP-Zugabe etwas stärker. SSBP verhindert die Bildung von Sekundärstrukturen. Zusätzlich verhindert das SSBP wahrscheinlich auch das unspezifische Binden noch vorhandener PCR-Primer. Deshalb ist davon auszugehen, dass die anfänglichen Störsignale durch unspezifisch bindende PCR-Primer verursacht wurden.

Es besteht die Möglichkeit, durch Pyrosequenzierung eine Insertion direkt im Pyrogramm darzustellen. Bei der in dieser Arbeit beschriebenen Mutation handelt es sich jedoch um die Insertion eines siebten nach sechs vorausgegangenen Guaninen. In der Pyrosequenzierung werden aufeinander folgende Basen in einem einzigen Signal mit proportionaler Größe im Pyrogramm dargestellt. Da die Genauigkeit jedoch mit der Länge der repetitiven Sequenz abnimmt, erweist es sich als schwierig, zwischen sechs und sieben aufeinander folgenden Basen zu unterscheiden. Es ist daher davon auszugehen, dass die Mutationsstelle nicht für diese Anwendung der Pyrosequenzierung geeignet ist.

Außerdem hatte die Pyrosequenzierung für das CG-reiche Gen LOR die zusätzliche Problematik einer sehr langen Etablierungsphase. Deshalb sollte diese Methode nicht zur Standarddiagnostik verwendet, sondern das Gen gleich vollständig im Kettenabbruchverfahren sequenziert werden.

4.4 Mutationsauswirkungen

4.4.1 Expression des veränderten Loricrins

▼ 84 

Ein Ziel dieser Arbeit bestand darin, herauszufinden, wie stark LOR auf RNA-Ebene exprimiert wird. Die Tatsache, dass modifizierte Loricrin generell exprimiert wurde, hatten bereits Maestrini und Mitarbeiter aufgezeigt50. Durch quantitative Pyrosequenzierung konnte nachgewiesen werden, dass, im Vergleich zur DNA, die mutierte LOR-RNA mit 2,8% nur unwesentlich schwächer synthetisiert wurde. Es konnte mit Hilfe dieser Arbeit bestätigt werden, dass bei Patienten mit honigwabenförmiger PPK mit Ichthyose bzw. Loricrin-Keratoderma das mutierte sowie das Wildtyp-Allel gleich stark exprimiert werden. Diese Annahme lag auch dem transgenen Mausmodell zu Grunde75. Demzufolge stellen die homozygot transgenen Mäuse ein realistisches Modell für das humane Krankheitsbild Loricrin-Keratoderma dar.

4.4.2 Auswirkungen des veränderten Loricrins

Es wird davon ausgegangen, dass Profilaggrin eine wichtige Rolle in der terminalen Differenzierung der Keratinozyten und somit der Keratinisierung spielt. Das aminoterminale Ende von Profilaggrin besteht aus einer sauren A-Domäne, die Ca bindet, und einer basischen B-Domäne. Außerdem hat Profilaggrin eine zweiteilige nukleäre Kernzielsequenz. Im Verlauf der Keratinisierung gruppiert sich der Aminoterminus von Profilaggrin im Kern um die fragmentierte DNA33. Das gesamte veränderte Loricrin wandert in den Nukleus, wie bei Mäusen gezeigt werden konnte, die nur das mutierte menschliche Gen tragen75. Dort umgibt es den Aminoterminus von Profilaggrin und ist selbst in den oberflächlich gelegenen Zellen noch zu beobachten. Die Interaktion von verändertem Loricrin, Profilaggrin und DNA wird als Grund der fehlenden terminalen Differenzierung der Keratinozyten und somit als Störung der Keratinisierung angesehen. Daher wird die Mutation in LOR auch als „gain-of-function“-Mutation bezeichnet, da das aus der Mutation resultierende Proteinprodukt eine neue Funktion erlangt. Die Mechanismen, welche dazu führen, dass Profilaggrin und das veränderte Loricrin im Kern bleiben, sind bisher nicht aufgeklärt. Es wird vermutet, dass ionische Interaktionen mit Nukleinsäuren eine Rolle spielen, da die B-Domäne von Profilaggrin und das veränderte Loricrin stark positiv geladen sind33.

4.4.3 Hinweise auf ein „Backup“-System

Das CE besteht zu einem großen Teil aus Loricrin. Daher würden dramatische Folgen beim vollständigen Fehlen von Loricrin zu erwarten sein. Dies ist allerdings bei -/- „knock-out“-Mäusen, die kein Loricrin exprimieren, nicht der Fall. Diese Tiere zeigen keine Abnormalitäten in Dicke, Entwicklung und Differenzierung des CE. Es ist auch keine Erhöhung des transepidermalen Wasserverlustes (TEWL) zu beobachten. Auffällig sind nur eine erhöhte Anfälligkeit des CE gegenüber mechanischem Stress sowie erhöhte Neigung zur Desquamation. Dabei ist die mechanische Stabilität der Haut von „knock-out“-Mäusen nicht signifikant eingeschränkt, da die Pfoten keine mikroskopischen Läsionen zeigten 40.

▼ 85 

Auch bei Loricrin-Keratoderma-Patienten zeigte sich zwar eine erhöhte Brüchigkeit der Korneozyten und eine erhöhte Anfälligkeit der Haut für mechanischen Stress, es waren aber keine klinischen Zeichen von erhöhter Hautvulnerabilität wie Blasenbildung oder Anfälligkeit für Verletzungen zu beobachten. Auch scheint sich die Struktur des CE im äußeren Stratum corneum zu normalisieren. Im inneren Stratum corneum weist das CE nur 30% der normalen Dicke auf, im äußeren Stratum corneum erreicht es immerhin 60% der normalen Dicke70. Dies sind Hinweise auf die Existenz eines „Backup“-Systems. Wahrscheinlich wird dieses „Backup“-System jedoch verspätet aktiviert, da die embryonischen LOR-/- „knock-out“-Mäuse eine langsamer einsetzende Entwicklung der Hautbarriere zeigen. Zusätzlich weisen die neugeborenen Mäuse einen transienten Phänotyp auf 40. Es kann daher mit hoher Wahrscheinlichkeit davon ausgegangen werden, dass ein „Backup“-System existiert, welches die Funktion von Loricrin übernimmt. Proteine, die Bestandteil dieses „Backup“-Systems sein könnten, sind:

Diese Proteine werden bei LOR-/- „knock-out“-Mäusen vermehrt exprimiert 35 40

4.4.4 Verändertes Loricrin in Zusammenhang mit dem „Backup“-System

▼ 86 

Basierend auf der Annahme eines bestehenden „Backup“-Systems überraschte der vergleichsweise schwer ausgeprägte Phänotyp der Mäuse der F2-Generation, welche aus der Paarung von transgenen Mäusen mit LOR-/- „knock-out“-Mäusen hervorgeht (Abschnitt 1.4.3)75. Dies führte zu der Überlegung, dass das modifizierte Loricrin auf noch nicht bekannte Weise auch das vermutete „Backup“-System beeinträchtigen könnte. Dafür sprechen auch weitere Erkenntnisse über die Dicke des CE. So ist beispielsweise das CE bei Loricrin-Keratoderma-Patienten dünner 30 41 und erreicht maximal 60% der eigentlichen Dicke 70. Bei LOR-/- „knock-out“-Mäusen hingegen sieht das CE normal aus und hat die normale Dicke von 15 nm mit sehr ähnlicher Masse pro Unit 35. Ein weiterer Punkt, der diese These unterstützt, ist der TEWL, dessen Erhöhung einen Defekt in der Permibilitätsbarriere anzeigt. So wurde bei LOR-/- „knock-out“-Mäusen beim TEWL keine Abnormalitäten beobachtet40. Transgene Mäuse und Loricrin-Keratoderma-Patienten zeigten hingegen eine Erhöhung des TEWL und somit einen Defekt in der Permiabilitätsbarriere 70 75.

4.5 Fazit der Diskussion

Bei der Bezeichnung Loricrin-Keratoderma handelt es sich um eine genetische Nomenklatur. Als klinische Bezeichnung hingegen wird häufig der Begriff mutilierende Palmoplantarkeratose mit Ichthyose verwendet. Für Loricrin-Keratoderma können eine honigwabenförmige Palmoplantarkeratose und eine Ichthyose als Hauptmerkmale definiert werden. Darüber hinaus können als Nebenmerkmale Pseudoainhums, Autoamputationen, Geburt als Kollodiumbaby, prominente Fingerknöchel sowie Hyperkeratosen in Bereichen wie den Knien und den Ellenbögen auftreten. Die Autoamputationen kommen bei nur knapp einem Drittel der Patienten mit Loricrin-Keratoderma vor. Daraus ergibt sich die Folgerung, die Bezeichnung mutilierende Palmoplantarkeratose dem Olmsted-Syndrom vorzubehalten. Weiterführend schlägt die Autorin vor, im Zusammenhang mit Loricrin-Keratoderma die klinische Nomenklatur honigwabenförmige Palmoplantarkeratose mit Ichthyose zu verwenden, die die Hauptsymptome dieser PPK berücksichtigt.

Für die molekulare Standarddiagnostik von honigwabenförmiger Palmoplantarkeratose mit Ichthyose bzw. Loricrin-Keratoderma kann die Sequenzierung von DNA-Proben verwandt werden. Die in dieser Arbeit darüber hinaus angewandten Methoden, wie beispielsweise die Pyrosequenzierung, eignen sich eher zu Forschungszwecken, da aufgrund des CG-Reichtums von LOR eine sehr lange Etablierungsphase notwendig ist.

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Bei der in dieser Arbeit beschriebenen Familie MDC-804 mit nachgewiesener Mutation 730insG handelt es sich um eine „gain-of-function“-Mutation. Das veränderte Loricrin wandert dabei im Stratum granulosum in den Kern und verhindert somit die terminale Differenzierung der Keratinozyten 31 33. Des Weiteren behindert das veränderte Loricrin wahrscheinlich das „Backup“-System, welches die Funktion des Wildtyp-Loricrins übernimmt. Bei dieser „gain-of-function“-Mutation werden das Wildtyp-Allel sowie das mutierte Allel zu gleichen Teilen exprimiert. Diese Tatsache belegt die Annahme des transgenen Mausmodells 75, welches darauf beruht, dass sowohl Wildtyp-Allel und mutiertes Allel gleichermaßen exprimiert werden.


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22.06.2006