The role of the N-terminal acetyltransferase NatA
in transcriptional silencing in Saccharomyces cerevisiae

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades
Doktor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)

im Fach Biologie

eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

von

Diplom-Biologin Antje Geißenhöner
geb. am 12.01.1969 in Suhl

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Jürgen Mlynek

Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. Michael Linscheid

Gutachter:
1. Prof. Dr. Harald Saumweber
2. PD Dr. Ann Ehrenhofer-Murray
3. Prof. Dr. Jörn Walter

Tag der mündlichen Prüfung: 13.07.2004

Zusammenfassung

Nα‑Acetylierung, eine der häufigsten eukaryontischen Proteinmodifikationen, wird von N‑terminalen Acetyltransferasen (NATs) katalysiert. NatA, die bedeutendste NAT in Saccharomyces cerevisiae, besteht aus den Untereinheiten Nat1, Ard1 und Nat5, und ist am silencing, d.h. am Aufbau repressiver Chromatinstrukturenan Telomeren und den Paarungstyp-Loci HML und HMR beteiligt. Die vorliegende Arbeit demonstriert eine Rolle von NatA auch beim rDNA-silencing, und zeigt erstmals, dass die silencing-Faktoren Orc1 und Sir3 funktionell von der Nα‑Acetylierung durch NatA abhängen.

Orc1, die größte Untereinheit des origin recognition complex (ORC), wurde in vivo durch NatA Nα‑acetyliert. Mutationen, die dies verhinderten, bewirkten eine starke telomerische Derepression. NatA wirkte genetisch über die ORC Bindungsstelle des HMR-E-silencers. Die artifizielle Bindung von Orc1 an HMR-E machte HMR-silencing NatA-unabhängig. Auch die synthetische Letalität von nat1Δorc2-1 Doppelmutanten wies auf eine funktionelle Verbindung zwischen NatA und ORC hin.

Als weiteres NatA-Substrat wurde Sir3 identifiziert, dessen zelluläre Lokalisierung von NAT1 abhing. Die schwächeren silencing-Defekte der unacetylierten orc1 sir3 Doppelmutante im Vergleich zu nat1Δ implizierten allerdings, dass noch weitere silencing-Proteine die Nα‑Acetylierung für ihre Funktion bedürfen.

Weitere Ergebnisse dieser Arbeit belegen eine Funktion N-terminalen 100 Aminosäuren von Orc1 im silencing. Deletionen innerhalb dieses Bereichs erzeugten silencing-Defekte. Das Fehlen von 51 Aminosäuren vom N‑Terminus von Orc1 unterbrach die Interaktion mit Sir1, verstärkte aber auch den silencing-Defekt von sir1Δ. Dies ergibt ein Model, in dem Orc1 neben Sir1 ein weiteres silencing-Protein rekrutiert, das zu seiner Bindung einen intakten, acetylierten N‑Terminus von Orc1 benötigt.

Zusammenfassend sprechen die Ergebnisse für eine Rolle der Nα‑Acetylierung durch NatA bei der Modellierung der Chromatinstruktur.

Eigene Schlagworte: Chromatin, Genregulation, Silencing, Nat1, Orc1

Abstract

Nα‑acetylation, one of the most abundant eukaryotic protein modifications, is catalyzed by N‑terminal acetyltransferases (NATs). NatA, the major NAT in Saccharomyces cerevisiae, consists of the subunits Nat1, Ard1 and Nat5 and is necessary for the assembly of repressive chromatin structures at the silent mating type loci and telomeres. This thesis shows that NatA also acts in rDNA repression and it provides the first direct evidence for the functional regulation of the silencing factors Orc1 and Sir3 by NatA‑dependent Nα‑acetylation.

Orc1, the large subunit of the origin recognition complex (ORC), was Nα‑acetylated in vivo by NatA. Mutations that abrogated this acetylation caused strong telomeric derepression. NatA functioned genetically through the ORC binding site of the HMR‑E silencer. Direct tethering of Orc1 to HMR‑E circumvented the requirement for NatA in silencing. The synthetic lethality of nat1∆ orc2-1 double mutantsfurther supported a functional link between NatA and ORC.

Sir3 was also indentified as a NatA substrate. Its localization to perinuclear foci was NAT1 dependent. Unacetylated sir3 orc1 double mutants did not resemble the nat1Δ silencing phenotype. Thus, we suggest that further silencing components require NatA‑dependent Nα‑acetylation for their function.

We further identified the N-terminal 100 amino acids of Orc1 to be important for silencing, since truncations within this region impaired silencing. The deletion of 51 amino acids from the Orc1 N‑terminus interrupted the interaction with Sir1 and also reduced silencing in sir1Δ strains. We thus propose that the silencing function of Orc1 is not restricted to Sir1 recruitment, but also comprises the interaction with another protein. The silencing function of this hypothesized interaction partner may depend on the Nα‑acetylation and integrity of the N‑terminus of Orc1.

In summary, we propose that Nα‑acetylation by NatA represents a protein modification that modulates chromatin structure in yeast.

Keywords: Chromatin, gene regulation, silencing, Nat1, Orc1

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08.06.2005