"Immunogenicity of hantavirus Dobrava
nucleocapsid protein derivatives in mice"

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades

doctor rerum naturalium(Dr. rer. nat.)


im Fach Biologie

eingereicht an der

Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I

der Humboldt-Universität zu Berlin

von

Diplombiologin Astrid Geldmacher
geboren am 12. Mai 1971 in Erlangen

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin

Prof. Dr. Jürgen Mlynek

Dean: Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I
Prof. Thomas Buckhout, PhD

Approvals:
1. Prof. Dr. Richard Lucius
2. Prof. Dr. Detlev H. Krüger
3. Prof. Dr. Paul Pumpens

Datum der Promotion: 02. Mai 2005

Zusammenfassung

Das in Europa vorkommende Dobravavirus (DOBV) wird durch zwei unterschiedliche Nagetierwirte, die Gelbhalsmaus Apodemus flavicollis und die Brandmaus A. agrarius, übertragen. DOBV kann bei humanen Infektionen zum Auslösen eines "Hämorrhagischen Fiebers mit renalem Syndrom" (HFRS) unterschiedlicher Schweregrade führen. Wie alle Hantaviren ist das DOBV ein umhülltes Virus, das in seiner Hülle die Glykoproteine G1 und G2 trägt. Im Inneren der Viruspartikel befinden sich die drei mit Nukleokapsid (N) Protein assoziierten Negativstrang-RNA Genomsegmente, sowie die RNA-abängige RNA-Polymerase.

Das N Protein von Hantaviren ist stark immunogen, sowohl in natürlich vorkommenden Infektionen von Menschen als auch in natürlichen und experimentellen Infektionen von Nagetieren. Des weiteren rufen Impfungen von Nagetieren mit N Protein eine starke N-spezifische Immunantwort hervor. Eine Impfung mit rekombinanten N Protein Derivativen schützt in Nagetiermodellen vor einer Hantavirusinfektion. Dies konnte unter anderem für chimaere Hepatitis B Virus (HBV) Corepartikel und das komplette rekombinante N (rN) Protein gezeigt werden.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Immunogenität von zwei auf dem DOBV N Protein basierende Protein Derivativen in Mäusen getestet. Zum einen wurden in E. coli exprimierte chimaere HBV Corepartikel verwendet, die von verkürztem Core-(HBcd)-Protein gebildet wurden, das die 120 amino-terminalen Aminosäuren (AS) des DOBV N Proteins trugen (HBcdDOB120). Das zweite Protein, komplettes DOBV rN Protein (429 AS), wurde in Hefen exprimiert. Anschließend wurden BALB/c (H2-d) und C57BL/6 (H2-b) Mäuse dreimal subkutan mit 50 μg HBcdDOB120 oder DOBV rN Protein in komplettem Freund's, inkomplettem Freund's und anschliessend ohne Adjuvants immunisiert. Für die Immunisierungen wurde ein Schema verwendet, mit dem bereits das Potential verschiedener Hantavirus Impfstoffkandidaten im Nagetiermodell getestet wurde. Vor jeder Impfung, sowie zwei Wochen und 29 Wochen nach der dritten Impfung wurde der N-spezifische Antikörpertiter im Serum bestimmt.

Sowohl BALB/c, als auch C57BL/6 Mäuse entwickelten eine starke N-spezifische Antikörperantwort nach Impfung mit sowohl HBcdDOB120, als auch nach Impfung mit DOBV rN-Protein, mit maximalen Titern von über 1:1.000.000. Die Antikörperantwort war langanhaltend und N-spezifische Titer waren 29 nach der dritten Impfung mit HBcdDOB120 und DOBV rN Protein immer noch höher als 1:35.000 in allen Mäusen. Beide Proteine induzierten Antikörper, die eine starke Kreuzreaktivität gegenüber den rN Proteinen der Hantaviren Puumala, Hantaan, Andes und Sin Nombre aufwiesen.

HBcdDOB120 und DOBV rN-Protein induzierten in BALB/c und C57BL/6 Mäusen N-spezifische Antikörper aller Subklassen (IgG1, IgG2a, IgG2b und IgG3), was auf eine gemischte Th1/Th2 Antwort schließen lies. Ebenfalls auf eine gemischte Th1/Th2 Immunantwort deuteten die N-spezifischen IFN-γ und IL-4 sekretierenden Lymphozyten von HBcdDOB120 oder DOBV rN Protein immunisierten Tieren nach in vivo Restimulierung. Die Frequenz der durch die Immunisierungen induzierte N-spezifischen Lymphozyten war allerdings gering.

Auch in Mäusen, die hohe HBc-spezifische Antikörpertiter aufwiesen konnte eine starke N-spezifischen Immunantwort mittels Impfung mit HBcdDOB120 induziert werden. Das heisst, auf chimären Core Partikel basierende Impfstoffe sollten selbst in anti-HBc-positiven Individuen nach einer HBV Infektion wirksam sein.

HBcdDOB120 und Hefe-exprimiertes DOBV rN Protein stellen vielversprechende Vakzinekandidaten dar, die auf ihre Protektivität hin getestet werden sollten, sobald ein DOBV Infektionsmodell verfügbar ist. Da HBcdDOB120 sowie DOBV rN Protein eine starke Antikörperantwort und nur eine schwache T-Zellantwort induzieren sollte zusätzlich die Rolle von N-spezifischen Antikörpern im Schutz gegen die Virusinfektion weiter charakterisiert werden.

Eigene Schlagworte: Hantaviren, Virus-ähnliche Partikel, Dobrava Virus, rekombinantes Nukleokapsidprotein, Antikörperantwort, Präexistierende Immunantwort, Impfstoff

Summary

In Europe, the human pathogenic Dobrava virus (DOBV) is carried by the yellow-necked mouse Apodemus flavicollis and the stiped field mouse A. agrarius and causes "haemorrhagic fever with renal syndrome" of different severity in humans. Like other hantaviruses, DOBV is an enveloped virus with the glycoproteins G1 and G2 embedded in the envelope. Inside the virions are the RNA-dependent RNA-polymerase and the three negative-strand RNA segments which are associated with the nucleocapsid (N) protein.

The N protein is very immunogenic in natural infections of humans and in natural as well as experimental infections of rodents. Even immunisations of rodents with N protein induces a strong N-secific immune response. Moreover, immunisation with N protein derivatives could protect rodents from a hantavirus infection. This was shown for several derivatives, including chimeric hepatitis B virus core (HBc) particles and entire recombinant N (rN) protein.

In this study, the immunogenicity of the two following derivatives based on the DOBV N protein was tested in mice. Chimeric HBV core particles, consisting of truncated HBc (HBcd) particles carrying the amino-terminal 120 amino acids (aa) of the DOBV N protein (HBcdDOB120) were expressed in E. coli. The second derivative, the entire DOBV rN protein (429 aa) was expressed in the yeastSaccharomyces cerevisiae. Hence BALB/c (H2-d) and C57BL/6 (H2-b) mice were immunised subcoutanously three times with 50 μg HBcdDOB120 or DOBV rN protein in complete Freund's, incomplete Freund's and without adjuvant, respectively. The immunisations were thereby identical to the immunisation sheme used previously in a hantavirus challenge model. Before each immunisation as well as two and 29 weeks after the last immunisation N-specific antibody titers in the serum were determined.

Mice of both strains elicited strong N-specific antibody responses after HBcdDOB120 as well as after DOBV rN protein immunisation, with endpoint titers as high as 1:1,000,000. The antibody response was long-lived and N-specific titers were above 1:35,000 in all mice 29 weeks after the third immunisation with either derivative. Both derivatives induced antibodies that were highly cross-reactiveto the rN proteins of the hantaviruses Puumala, Hantaan, Andes and Sin Nombre.

HBcdDOB120 and DOBV rN protein induced in BALB/c and C57BL/6 mice N-specific antibodies of all IgG subclasses (IgG1, IgG2a, IgG2b and IgG3) suggesting a mixed Th1/Th2 immune response. In the same line, IFN-γ and IL-4 was secreted by N-specific lymphocytes from mice immunised with HBcdDOB120 or DOBV rN protein after in vitro restimulation which also indicated a mixed Th1/Th2 response. However, the frequency of N-specific lymphocytes that were induced by HBcdDOB120 and DOBV rN protein seemed to be low.

In mice that exhibited a high HBc-specific antibody titer HBcdDOB120 induced a strong N-specific immune response. Therefore, vaccines based on chimeric HBcd particles will probably be effective even in anti-HBc positive individuals after HBV infection.

HBcdDOB120 and yeast-expressed DOBV rN protein represent a promising vaccine candidate that should be tested for their protective potential in an DOBV challenge model as soon as one gets available. Additionally, as protection might be partially based on N-specific antibodies, their role in protecting against a hantavirus infection should be characterised further.

Keywords: Hantavirus, virus-like particle, Dobrava virus, recombinant nucleocapsid protein, antibodies, preexisting immunity, vaccine

Table of contents

Tables

Images



© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
XDiML DTD Version 4.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML generated:
22.08.2006