1. Einleitung

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Herzinsuffizienz mit konsekutivem Herzversagen ist ein zentrales kardiovaskuläres Problem der heutigen Bevölkerung. In Deutschland ist etwa 1% der Bevölkerung betroffen. Unter den 70-ig jährigen steigt der Anteil der Betroffenen auf etwa 10% an. Zu den häufigsten Ursachen zählen unter anderem die Koronare Herzerkrankung (KHK), Hypertension und Myopathien wie z.B. die Dilatative Kardiomyopathie (DCM).

Herzinsuffizienz zeichnet sich aus durch das Unvermögen, eine ausreichende Menge Blut für die metabolischen und zirkulatorischen Anforderungen der Gewebe zu fördern. Pathogenetisch kann die Herzinsuffizienz durch Veränderungen der Vor-, (z.B. Regurgitationen nach Herzklappeninsuffizienz) und Nachlast (z.B. arterielle Hypertonie, Aortenstenose), Einschränkungen des kontraktilen Apparates (z.B. bei angeborenen oder erworbenen Kardiomyopathien, Ischämie nach KHK) oder Herzrhytmusstörungen hervorgerufen werden. Unabhängig von der Ursache kommt es bei der Herzinsuffizienz zu charakteristischen Adaptationsmechanismen. Epidemiologische Studien belegen, dass diese primär kompensatorischen Mechanismen, die unter dem Begriff des Remodeling zusammengefasst werden, prädestinierend zu Gefügedilatation mit konsekutiver Herzdekompensation und Herzversagen führen 1 2 3. Hierbei spielt insbesondere die Herzhypertrophie eine große Rolle. Mikroskopisch beobachtet man myozytär eine ausgeprägte Hypertrophie und vermehrte Apoptose, während die extrazelluläre Matrix (EZM) in dieser Phase durch vermehrten Kollagenabbau, Kollagenshift und reparativer sowie reaktiver Fibrosierung gekennzeichnet ist 4. Noch unklar sind die Details der hypertrophieinduzierenden, intrazellulären Signalwege auf molekularer Ebene. Es kommt zu einer Aktivierung neurohumoraler Faktoren (symphatisches Nervensystem (NS), Renin-Angiotensin-Aldosteronsystem (RAAS), 5 6 Endothelin 17 8, Transforming growth factor (TGF-ß) 9 10, Insulin like growth factor 11), die hypertrophievermittelnd auf das Myokard einwirken, indem sie zu Veränderungen der Calciumhomöostase führen und eine Vielzahl von Signaltransduktionswegen beeinflussen. Über spezifische Zell-Oberflächenrezeptoren (Integrine) werden die Signale aus dem Extrazellularraum an das intrazelluläre Cytosklett vermittelt.12 Hier werden durch Konformitätsänderung und Aktivierung sarkoplasmatischer Proteine (z.B. Phospholipase C (PLC) oder Proteinkinase C (PKC)) Signalkaskaden in Gang gesetzt, die zumeist über G-Proteine gekoppelt zu einer Aktivierung von Mitogen aktivierten Proteinkinasen (MAPKs) oder Janus assoziierten Kinasen (JAKs) führen. Diese verändern über Transkriptionsfaktoren die kardiale Genexpression. Initial kommt es zur Induktion der „Immediate-early-genes“ (Proto-onkogene wie z.B. c-fos, c-jun, Hitzeschockproteinen wie z.B. hsp 70 etc.), darauffolgend zu einer Umstellung der Expression von adulten zu fetalen Isoformen bestimmter Proteine, zu einer Reexpression bestimmter rein fetaler Proteine (z.B. des Atrial natriuretischen Peptids (ANP)) und zu einer Herabregulation vereinzelter Gene (z.B. der Sarkoplasmatischen Ca-Adenosintriphosphatase (SERKA)13 14).

Eine entscheidende Rolle scheint außerdem Calcineurin (CnR) zu spielen15. Das Enzym ist ein Heterodimer aus der katalytischen Untereinheit CnA mit 61 kDa und der regulatorischen calciumsensiblen Untereinheit CnB mit 19 kDa. Es handelt sich um eine cytoplasmatische Calcium-Calmodulin abhängige Serin/Threonin-Phosphatase, die physiologisch ubiquitär in einer Vielzahl von Geweben vorkommt. Vorangegangene Studien befassen sich vor allem mit ihrer Funktion in immunkompetenten Zellen (T-/B-Lymphozyten) 16, in Myozyten, Skelettmuskelzellen 17 18, Fibroblasten und Neuronen. In T-Zellen wird von einer Funktion in der immunulogischen T-Zellaktivierung berichtet. In Skelettmuskelzellen ist es auf molekularer Ebene beteiligt, wenn durch tonische Motoneuronenaktivität selektiv die Genexpression charakteristischer Proteine phänotypisch langsamer Haltemuskulatur amplifiziert wird. Kardial dephosphoryliert CnR den Transkriptionsfaktor “Nuclear factor of activated T cells” (NFATc3)19 , der in Folge in den Zellkern diffundieren kann 20 und synergistisch mit dem Transkriptionsfaktor GATA4 die Genexpression beeinflusst 21 22. Verschiedene Studien belegen die Hypothese, dass CnR ein wichtiges Glied der molekularen Signaltransduktionkette bei Hypertrophie ist. In Tierexperimenten mit einer dominant inaktiven Calcineurinmutante wurde eine abgeschwächte Hypertrophie in Folge pathophysiologischer Stimulation nachgewiesen 23. Transgene Mäuse, in denen mit Hilfe eines Promotors eine Überexpression der aktiven Calcineurinform generiert wurde, zeigten eine vermehrte Ausbildung von Hypertrophie und eine signifikante Zunahme des Herzgewichtes 24. Shimoyama et al. 25 und Lim et al. 26 berichteten von einer Heraufregulation der CnR-Expression und Zunahme der CnR-Aktivität im Rahmen einer druckbelastungsinduzierten Hypertrophie. Taigen et al.27 untersuchten in vitro kultivierte, neonatale Rattenmyozyten. Nach Stimulation mit hypertrophen Agonisten wie Angiotensin II oder Phenylephrin wurde ein erhöhter mRNA-Gehalt von CnA ß sowie eine verstärkte Enzymaktivität gemessen. Goldspink et al. 28 konnten diese Resultate in vivo an Rattenmodellen wiederholen.

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Hierzu sind in der Literatur jedoch auch kontroverse Ergebnisse zu finden. Zhang et al.29 und Meguro et al.30 fanden in Mausmodellen keine Veränderung der CnR-Aktivität in Folge Hypertrophieinduktion mittels aortalem Banding, in einer vergleichbaren Studie von Ding et al. 31 war die CnR-Aktivität signifikant verminderte.

Die beschriebenen Effekte auf CnR konnten z.T. mit den Immunsuppressiva Cyclosporin A und Tacrolimus (FK 506) unterdrückt werden, die in vielen Studien als experimentelle Calcineurininhibitoren dienen .

Da CnA allein aber nur eine sehr geringe spezifische Aktivität besitzt und seine Aktivierung über die regulatorischen Untereinheit vermittelt 32 wird, stellt CnB eine wichtige Schlüsselstelle zur Regulation der CnR abhängigen Signalkaskade dar. CnB wird, örtlich getrennt und unabhängig von der CnA-Expression, von einem Single-Copy-Gen auf Chromosom 2 p15-16 kodiert 33. Bisher publizierte Befunde gehen von einer Fusionssequenz von Chromosom 20 und 2 aus und beinhalten gravierende Artefakte 34. In einer unpublizierten Arbeit (A.Neuhausen Dissertation) aus der AG Regitz-Zagrosek wurde erneut an der Aufklärung der Genstruktur gearbeitet. Das CnB Gen ist über 50 kBp groß und beinhaltet 6 Exons und 5 Introns.

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Bisher sind zwei Splicevarianten von CnB beschrieben worden, neben der ubiquitär vorkommenden Isoform (s.o.) eine weiter Splicevariante, die ausschließlich im Testisgewebe exprimiert wird und offensichtlich eine Funktion bei der Ausdifferenzierung der Zellen hat 35 36 37. CnB ist ein evolutionär hoch konserviertes 38 39 Protein aus der Gruppe der Zinkfinger-Bindungsproteine (EF-hand proteins) 40 41. Zu Calmodulin (CaM) besteht eine Sequenzhomologie von 35% 42. CaM bindet, wie CnB, an die CnA-Untereinheit und ist ein wichtiges Glied des Aktivierungsvorgangs. Sie haben jedoch unterschiedliche Bindungsstellen und sind nicht austauschbar 43. Im Vergleich dazu beträgt die Sequenzhomologie zu dem ebenfalls vier Calciumbindungsstellen besitzenden Troponin immerhin noch 29% .

Posttranslationell unterliegt CnB einer Modifikation, bei der das Anfangs-Methionin abgespalten und durch eine Fettsäureveresterung an die nachfolgende Aminosäure ersetzt wird. Die Funktion dieser Fettsäuren ist noch ungeklärt. Es konnte gezeigt werden, dass sie keinen Einfluss auf die Aktivität des Enzymes haben und eventuell zur Thermostabilität beitragen 44.

Die regulatorische Funktion von CnB wird über seine vier Calciumbindungsstellen vermittelt. An den N-terminalen Bindungsstellen führt es, durch reversible Calciumbindung, zu einer gesteigerten Calmodulinaffinität. Dadurch kommt es zu einer vermehrten Calmodulinbindung, die zu einer gesteigerten Aktivität führt. Bisher publizierte Untersuchungen zur hypertrophievermittelnden Funktion von CnR beziehen sich vorwiegend auf die katalytischen Untereinheit CnA. Es wird vermutet, dass ein erhöhter Anteil an CnA Gehalt für die in Hypertrophiemodellen gesteigerte CnR Aktivität verantwortlich ist.

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In anderen Studien wurde der Frage nachgegangen, ob ein Zusammenhang zwischen CnR-Aktivität und dem Anteil an interstitieller Fibrose im Herzmuskelgewebe besteht. Nagata K., Somura F. et al. 45 fanden in Rattenmodellen mit Hypertension nach hämoynamischer Überbelastung Hinweise auf eine Korrelation zwischen kardialer Fibroseinduktion und CnR-Aktivität. Konkret hat man in dieser und ähnlichen Studien untersucht, inwiefern die Blockade des RAAS durch einen AT1-Rezeptor-Antagonist die kardiale Hypertrophie und Fibrosierung in Folge salzinduzierter Hypertension vermindert und ob die CnR-Aktivität beeinflusst wird 46. Die Ergebnisse zeigten einen Zusammenhang zwischen AT1-Block und erniedrigter CnR-Aktivität bzw. mRNA-Gehalt von CnAß, einhergehend mit einer Reduktion sowohl der myokardialen Hypertrophie als auch der Fibrosierung ohne antihypertensiven Effekt.

Es wurde bisher nicht geprüft, ob Hypertrophie und interstitielle Fibrosierung in insuffizienten Herzen von dem CnB-Gehalt modifiziert werden.

Da die regulierte CnR-Aktivität nicht vollständig durch die Veränderungen der CnA-Expression erklärt werden kann 47 und in Anbetracht der calciumsensiblen Regulation der Phosphataseaktivität von CnR wurde unsere Aufmerksamkeit auf CnB gelenkt. Mit seinen Calciumbindungsstellen ist es eine wichtige Transduktionsstelle zwischen Enzymaktivität und Herzhypertrophie 48 .

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Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der Rolle von CnB in der Pathogenese von Herzhypertrophie und interstitieller Fibrosierung. Dazu wurde die krankheitsspezifische Regulation von CnB in hypertrophierten Herzen verschiedener Pathogenesen gemessen und der interstitielle Fibrosegehalt dieser Herzen bestimmt.

In linksventrikulären Myokardbiopsien von Patienten mit AS bzw. aus explantierten Herzen mit DCM und KHK wurde der mRNA-und Proteingehalt von CnB bestimmt und mit der Expression der Hypertrophiemarker ANP und BNP korreliert. Zum Vergleich wurden die Untersuchungen parallel in einer Kontrollgruppe gesunder Spenderherzen durchgeführt.

Die Herzen, von denen histologische Präparate zur Verfügung standen, wurden zusätzlich hinsichtlich ihres Fibrosegehalts untersucht. Zu diesem Zweck wurde ein, auf Farbsegmentierung beruhendes, Messsystem für die Größe der von uns untersuchten Präparatflächen validiert.

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Parallel wurde in der Arbeitsgruppe ein Projekt zu Calcineurin A durchgeführt, indem der mRNA- und Proteingehalt der verschiedenen Splicevarianten, ebenfalls im Vergleich zu den Hypertrophiemarkern ANP und BNP, Ziel der Untersuchungen war.


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26.05.2006