2. Material und Methoden

2.1. Patientengut und Biopsieentnahme

▼ 6 (fortgesetzt)

Um die myokardiale Genexpression zu untersuchen, wurden insgesamt 51 humane Herzen bioptiert. Die Gewebeproben stammten aus explantierten Empfängerherzen bei orthotopen Herztransplantationen und entsprachen Endstadien koronarer Herzerkrankungen (n = 7) oder dilatativer Kardiomyopathie (n = 27). Die dritte Gruppe waren intraoperativ entnommene Biopsate bei hochgradigen Aortenstenosen (n = 14). Als Kontrollgruppe dienten Biopsate aus abgelehnten Spenderherzen von Multiorganentnahmen (n = 15). Diese Herzen wurden in allen Fällen aus nicht-kardialen, zumeist logistischen Gründen abgelehnt, hatten keine bekannten kardialen Vorerkrankungen und eine normale Ejektionsfraktion. Laut Befundung durch die Herzpathologie des DHZB war ihre Morphologie nicht pathologisch verändert (). Die Gewinnung und Aufarbeitung der Proben erfolgte standardisiert.

Für die Studie existierte ein positives Ethikvotum der Ethikkomission der Charité, Campus Virchow-Klinikum. Die teilnehmenden Patienten wurden vor der Probenentnahme mündlich und schriftlich aufgeklärt und um eine schriftliches Einverständnis gebeten. Untersucht wurden Biopsien der Vorderwand des linken Ventrikels. Die untersuchten Herzen waren wie folgt charakterisiert:

▼ 7 

Tab. :Tabelle mit klinischen und hämodynamischen Daten der Patienten

Patienten-und Kontrollherzen mit Alter, Geschlecht, hämodynamischen Daten als MW der jeweiligen Gruppe

Nach Entnahme gelangten die Biopsate des LV unmittelbar auf Trockeneis und wurden anschließend kontinuierlich bei -78° C gelagert.

2.2. Strategie des Arbeitablaufes

2.3. Probenaufbereitung für PCR

2.3.1. RNA-Extraktion

▼ 8 

Alle Arbeiten mit RNA-Material wie Aufarbeitung, RNA-Messung, RT-Reaktion erfolgten in strikter räumlicher Trennung zu den Laboren der PCR-Amplifizierung und DNA-Experimenten. Um Verunreinigungen und Abbau der RNA durch ubiquitär vorkommende RNAsen zu vermeiden, wurden nur Gerätschaften und Hilfsmittel (Eppendorfgefäße, Pipetten, Pistillen, etc.) verwendet, die zuvor mit 0,1%-iger DEPC-Lösung behandelt und anschließend 30 Min. bei 1 atü und 121°C autoklaviert worden waren. Zu Beginn der RNA Aufarbeitung wurden 10-40 mg Stücke von der Myokardprobe entnommen und auf einer Präzisionswaage abgewogen. Zur Homogenisation mit einer geschliffenen, der Größe des Eppendorfgefäßes angepassten Metallpistille, wurden 160 µl RNAzol auf die Probe gegeben. Der Homogenisator wurde bei einer Geschwindigkeit von 500 U/min angetrieben. Noch an der Pistille befindliches Restgewebe wurde mit RNAzol abgespült, so dass insgesamt 1 ml RNAzol/Probe benutzt wurden. Die Suspension wurde nun vollständig zu Ende homogenisiert mit kurzen Abkühlphasen auf Eis, um einer RNA-Degradation durch Überhitzung vorzubeugen. Anschließend wurde das Homogenat durchmischt, wiederholt gekühlt und zur vollständigen Extraktion für 20 Min. im Kühlraum auf einem Schüttler inkubiert.

In der folgenden Chloroformextraktion wurden alle Ansätze mit 200 µl Chloroform versetzt, für 2 Min. geschüttelt und anschließend für 10 Min. bei 14000 rpm und 4°C in einer Kühlzentrifuge (Eppendorf, Deutschland) abzentrifugiert. Der klare Überstand wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt und, 1:1 mit Isopropanol versetzt, durchmischt. Nach einer Tiefkühlphase von 12 h bei –80 °C wurde die Lösung für 30 Min. bei 14000 rpm und 4°C abzentrifugiert und ihr wässriger Überstand dekantiert.

Zweimal in Folge wurde die nun als Pellet vorliegende RNA mit 80%igem Ethanol gewaschen, abzentrifugiert und luftgetrocknet. Das reine RNA-Pellet wurde mit 40 µl bzw. einer der Größe entsprechenden Menge DEPC-Wasser gelöst und für weitere 12h bei -80°C gelagert.

▼ 9 

Am folgenden Tag wurde der DNAse Verdau durchgeführt, um ggf. mitextrahierte DNA zu eliminieren. Vorher und nachher wurde die RNA-Konzentration photometrisch bei einer Wellenlänge von λ=260nm in einer Verdünnung 1:20 mit H2O bestimmt.

2.3.2. DNAse Verdau

Der DNAse-Verdau-Reaktionsansatz beinhaltete 35 µl der RNA Probe, 2,94 µl DNAse (10U/µl), 8,75 µl MnCl2 (8mM), 1 µl RNAsin (40 U/µl) und wurde mit DEPC-H2O auf ein Gesamtvolumen von 60 µl aufgefüllt. Der Ansatz wurde für 10 Min. bei 37°C inkubiert und die DNAse Reaktion durch Zusatz von RNAzol gestoppt.

Durch erneute Chloroformextraktion und einen Ethanolwaschvorgang (Vorgehen s. oben) wurde die RNA isoliert und mit DEPC H2O resuspensiert. Es folgte die 2. photometrische RNA-Konzentrationsbestimmung, aus deren Ergebnissen die Ausbeute der RNA-Extraktion in µgRNA/mg FG berechnet wurden.

2.3.3. Reverse Transkription

▼ 10 

Damit in der PCR-Reaktion die Polymerase enzymatisch aktiv werden konnte, war es notwendig, die RNA mit Hilfe der Reversen Transkriptionsreaktion (RT) in die Form der copy DNA umzuschreiben. Hierzu wurden 4µl der isolierten RNA (125ng/µl) mit 6 µl DEPC-H2O verdünnt, mit 2 µl Random-Hexamer-Primern (300 ng /µl) versetzt und für 10 Min. bei 70°C inkubiert. Im Anschluss wurde jeder Ansatz gekühlt und mit 1µl Superscript (200 U/µl) und 9 µl Mastermix versetzt, gemischt, anzentrifugiert und für 10 Min. bei Raumtemperatur sowie für 50 Min. bei 42°C inkubiert. Um die Reaktion zu stoppen, wurde anschließend eine Hitzedenaturierung bei 95°C durchgeführt.

Mastermixkomponenten bei RT-Reaktion:

2.4. Primerkonstruktion

▼ 11 

Um bei der PCR das Zielgen amplifizieren zu können, wurden im Vorfeld entsprechende Primer designt. Mit dem Blast-Computerprogramm wurde getestet, ob sie ausschließlich zu der ausgewählten Zielsequenz komplementär sind

Tab. : Primersequenzen, Amplifikatlängen, Accessionnumber der Gene

Es werden die in der vorliegenden Arbeit verwendeten Primer (Accession-Nummer und Sequenzen der Forward) und die von ihnen in der PCR erzeugten Amplifikatlängen dargestellt.

2.5. Polymerase Ketten Reaktion (PCR)

Die Polymerase Ketten Reaktion (PCR) wurde als Real-Time-PCR mit Hot-Start Technik durchgeführt. Ein 25µl-PCR Ansatz enthielt 1,25 ng Template, 5 pmol Forward-/Revers-Primermix und 12,5 µl SYBR-Green Mastermix (10x SYBR Puffer, Amp-Erase (1U/µl), Ampli Taq Gold (5U/µl), dNTPMix (2,5mMdATP, 2,5mM dCTP, 2,5mM dGTP, 2,5mM dUTG und MgCl2 (25mM), mit H2O auf 25 µl aufgefüllt. Das Fluoreszenzsignal wurde vom Real-Time-PCR Gerät Gene-Amp5700 in jedem Zyklus während des Annealingschrittes gemessen. Durch diese Online-Messung konnte der PCR-Verlauf verfolgt und analysiert werden.

▼ 12 

Das zu Grunde liegende Thermoprofil betrug:

Extensionsschritt: 45``/72C

▼ 13 

Alle Gene wurden 40 Zyklen amplifiziert.

Aus einem Pool der Proben wurde eine Verdünnungsreihe von 25ng - 0,17 ng zu jedem Zielgen vermessen. Daraus wurde die Standardkurve zur Quantifizierung erstellt.

Kontrollreaktionen:

▼ 14 

In jeder PCR wurde eine Negativkontrolle in Form einer H2O Probe mitgeführt, um Kontamination der Chemikalien mit DNA auszuschließen. Diese zeigten keine nullwertdifferenten Extinktionen. Alle Proben wurden in Doppelansatz gemessen.

2.6. Probenaufarbeitung für Western Blot

2.6.1. Proteinextraktion

Von den schockgefrorenen Proben wurden Probenstücke von ca. 60-80 mg entnommen, in einem Verhältnis von 1:5 mit Lysispuffer (s.u.) versetzt und in einem Fast-prep Gerät(FastPrep FP 120 Bio 101 Thermo Savant) homogenisiert. Die Homogenate wurden durchmischt und für 20 Min. auf Eis abgestellt, um die Proteinextraktion zu optimieren. Anschließend wurde für 10 Min. bei 14000 rpm abzentrifugiert und der Überstand mit den Proteinen in ein neues Eppi überführt. Für die Proteinmessung wurden 20 µl entnommen, der restliche Überstand wurde bei –80°C eingefroren. Der Lysispuffer setzte sich aus Protein-Extraktionsdetergenz (100 ml-Ansatz aus 10 mM Tris pH 7,5, 140 mM NaCl, 1mM EDTA, 25% Glycerol, 0,5% SDS und 0,5% Nonident p-4c) und Proteaseinhibitoren–Cocktail (1 ml-Ansatz aus 5 mM DTT, 0,5 mM PMFS, 100 ng Aprotinin, 100 ng Leupeptin und 100 ng Pepstatin) in einem Verhältnis von 1:4 zusammen.

2.6.2. Proteinmessung

Die Proteinmessung erfolgte auf einer Flachbodenplatte im ELISA Platten Reader (Anthos Labtec-HAT 2). Jede Probe wurde in vier verschiedenen Verdünnungsstufen, je als Doppelansatz, gemessen. Pro Ansatz wurden zu der Probe 300 µl Farbstofflösung des BCA-Kits beigegeben und die Platte unter Lichtabschluss für 30 Min. bei 37 °C inkubiert, anschließend wurde im Wellenlängenbereich von 550 nm gemessen. Anhand einer Standard-Albumin-Verdünnungsreihe wurde die Proteinkonzentration errechnet.

▼ 15 

Kontrollreaktionen ELISA Platten Reader Proteinmessung

Als Negativkontrolle wurde ein Ansatz mit H2O, zur Ermittlung der Eigenextinktion, die von allen Messwerten subtrahiert werden muss, ein Ansatz mit Lysispuffer, mitgeführt.

2.7. Western Blot

2.7.1. Diskontinuierliche SDS-Gelelektrophorese der Probenproteine

Die Gelkomponenten waren:

▼ 16 

Sammelgel 5%

Trenngel 12,5%

▼ 17 

Die Gele wurden für 30 Min. bei Raumtemperatur, anschließend für 12 h bei 4°C polymerisiert.

Zum Beladen des Gels wurden die Proteine mit Rotiload Ladepuffer versetzt (25% des Gesamtvolumens) und für 5 Min. bei 95°C hitzedenaturiert. Nach kurzer Abkühlung bei Raumtemperatur wurden 13,3 µl der auf 3 µg/µl konzentrierten Proben aufgetragen. Die Kammer wurde für 30 Min. an einen Powersupplie-Stromkreis bei einer Spannung von 80 Volt angeschlossen. In dieser Zeit durchliefen die Proteine das Sammelgel. Sie traten in das Trenngel über, in dem sie anschließend bei 100 Volt für 1,5 h der Größe nach aufgetrennt wurden.

2.7.2. Comassiefärbung

▼ 18 

Zum Anfertigen des Comassiegel wurden 6,6µl des auf 3 µg/µl konzentrierten Gesamtproteins einer jeden untersuchten Probe mit einer SDS PAGE aufgetrennt und mit Comassieblue angefärbt.

Vorgehen:

Nach Auftrennung der Proteine mittels PAGE wurden die Gele für 12 h bei 4°C in Comassieblue angefärbt. Danach wurden sie in Waschvorgängen von 3x 15 Min. in einer 1:1 Methanol:H2O Verdünnung plus 10% Eisessig entfärbt. Die Trocknung erfolgte in dafür vorgesehenen Rahmenvorrichtungen in Ersatzzellophan. Die angefärbten Proteinbanden der getrockneten Gele wurden eingescannt und die optische Dichte (OD) der Actinbande gemessen (s.u. Detektion).

2.7.3. Calcineurin B AK

▼ 19 

Der monoklonale Anti-Calcineurin B Antikörper ist ein aus Mausserum gewonnenes Immunglobulin der Klasse M. Er bindet spezifisch ein Epitop auf der Calcineurin B Untereinheit von Mensch, Rind und Ratte und zeigt keine Kreuzreaktion mit Calcineurin A. Der 2.AK ist ein Anti-Maus-AK, der an ein Oberflächenepitop des 1.AK bindet. Er wird aus Kaninchenserum isoliert und ist mit Meerrettichperoxidase (HRP-Enzym) gekoppelt.

2.7.4. Western Blot Verfahren

Die gelelektrophoretisch aufgetrennten Proteine wurden nun auf eine Membran überführt und dort einer CnB spezifischen Nachweisreaktion unterzogen. Es wurde ein Nass-Blottverfahren mit einem Maxi-Wet-Tank (Biorad) durchgeführt. Als Blottingmembran wurde Nitrocellulose als proteinbindendes Material genutzt. Die Komponenten des Transferpuffers waren:

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Die für den Blotting-sandwich genutzten Filterkartonpapiere, Nitrocellulosemembranen und Schwammpads wurden mit Transferpuffer getränkt, die Gele ca.15 Min. in Transferpuffer äquilibriert. Für den Transfer wurde für eine Dauer von 1,5h eine Stromdichte von 300-400 A (entsprechend 0,2-0,5 mA*cm)angelegt bei einer Spannung von50-60 V. Die Kühlung erfolgte mit einer Durchflusskühlanlage.

2.7.5. Anfärbung der Proteine als Kontrollreaktion

Die Bloteffizienz wurde mit Hilfe der Ponceaurotfärbung überprüft. Die Membran wurde 1 Min. in Ponceaurot (1:10 Verdünnung) geschwänkt und anschließend 2x 5 Min. mit dest. H2O gewaschen. Die Proteinbanden wurden rot angefärbt sichtbar, so dass die Membran zugeschnitten und die Markerbanden beschriftet werden konnten.

2.7.6. Nachweisreaktion Hybridisierung der AK

Die Membran wurde für 1 h bei Raumtemperatur unter langsamen Schwenken in 5%iger Milchpulverlösung geblockt. Es folgte ein Waschschritt 1x 5 Min., 2x 15 Min. mit TBS-T Puffer in einer Zusammensetzung aus:

▼ 21 

in 5000 ml H2O gelöst, pH = 7,6.

Die Inkubation mit dem 1.AK wurde für 4 h bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach Waschschritten von 1x 5 Min., 2x 15 Min. mit TBS-T Puffer folgte die Inkubation mit dem 2.AK für 1 h bei Raumtemperatur. Im Anschluss wiederholten sich die Waschschritte. Um ein gleichmäßiges Benetzen der Oberfläche zu gewährleisten, erfolgten die Hybridisierungsvorgänge unter ständigem Schütteln der Membran. Die AK-Verdünnungen wurden in TBS-T Puffer (s.o.) hergestellt. Der 1.AK in einer Verdünnung von 1:2000, der 2.AK in einer Verdünnung von 1:300000.

2.7.7. Visualisierung der Nachweisreaktion

▼ 22 

Die auf Parafilm gebetteten Membranen wurden für 3 Min. gleichmäßig mit femto LUCENT HRP-Substratlösung benetzt. Die randständig überschüssige Lösung wurde anschließend vorsichtig entfernt und die Membran in Klarsichtfolie luftblasenfrei eingepackt.

2.7.8. Detektion

Die Membran wurde, mit der Proteinseite zum Film hin, in eine Filmkassette gelegt. Die Exposition des Films erfolgte je nach Bedarf für 10 Sek. bis zu 15 Min. Nach Entwicklung und Belichtung des Filmes wurde er mit EPSON-Scann eingescannt und die optische Dichte (OD) der Bandenstärke mit Hilfe des Alpha-Ease Messprogramms gemessen.

Das Scannen von expositionierten Röntgenfilmen bietet einen linearen Messbereich von ca. 20 bis 50 Graustufen. Um das Signal zu normalisieren, wurde es auf den Actin-OD Wert der gescannten Comassiegele kalibriert.

2.8. Quantitative Bestimmung des Anteils an interstitiellem Gewebe (Fibrose, Narben) im Myokard

▼ 23 

Für die Untersuchung standen histologische Präparate der VW des LV von insgesamt 25 an DCM und 6 an KHK erkrankten Herzen zur Verfügung. Das Material der intraoperativ entnommen Biopsien der an AS erkrankten Herzen war sehr gering, so dass keine histologischen Präparate angefertigt wurden. Als Kontrollgruppe dienten die histologischen Präparate der Vorderwand des Myokards des linken Herzventrikels von 8 abgelehnten Spenderherzen (). Es handelte sich um dieselben Herzen, aus denen die für PCR und Western Blots entnommenen Proben stammten. Die Erfassung der Fibrose orientierte sich an dem mittels Grauwertsegmentierung markierten Anteil an interstitiellem Gewebe im Myokard in nach Domagk gefärbten histologischen Schnitten von 3 µm. Dabei wurden die interessierenden Strukturen mittels Farbsegmentierung detektiert und entsprechende Parameter wie Fibrosefläche in µm und prozentualer Anteil der fibrosierten Fläche an der Gesamtfläche des eingestellten Präparateausschnitts berechnet. Die Messeinrichtung bestand aus einem Lichtmikroskop (Zeiss, Axioskop) mit angeschlossener Kamera (Sony) und Bildverarbeitungssystem (Zeiss, KS 400). Zur eigentlichen Messung wurde ein von Dipl. Ingenieur T. Bez (Zeiss) und Prof. R. Meyer (DHZB) entwickeltes Softwarepaket BG 7 verwendet, welches auf der Basis des Bildverarbeitungssystem KS 400 entwickelt wurde. Nach Validierung des Verfahrens wurde wie folgt vorgegangen.

Das gesamte Präparat wurde in 4 gleichgroße Flächen eingeteilt und in jedem dieser Areale wurden 12 Messungen durchgeführt. Bei einer 100-fachen Gesamtvergrößerung wurde eine Fläche von 14,7 mm vermessen. Um die erzielten Daten dieser 48 Einzelmessungen (prozentualer Anteil fibrosierter Fläche an vermessenem Myokardausschnitt) als prozentualer Gesamtfibroseanteil der vermessenen Gesamtfläche des jeweiligen Herzens zusammenzufassen, wurden sie gemittelt. Es resultierten 8 MW der Kontrollgruppe, 6 MW der von KHK und 25 MW der an DCM erkrankten Herzen. Aus diesen Werten wurde für die statistischen Signifikanzberechnungen von jeder untersuchten Gruppe der mediane Wert bestimmt, der im Weiteren als Fibrosegehalt der Kontroll-, DCM- bzw. KHK-Gruppe dargestellt wird.

2.9. Validierung der Methoden

2.9.1. RNA-Ausbeute vor und nach Dnase-Verdau

Von jeder Myokardprobe wurden Stücke mit Feuchtgewichten (FG) zwischen 10,7-40,0 mg entnommen, um daraus die RNA zu extrahieren. Die RNA-Ausbeuten der individuellen Gruppen wurden in Tabelle 4 genannt. Die RNA-Ausbeuten vor und nach Dnase-Verdau waren zwischen den einzelnen Gruppen nicht signifikant unterschiedlich

▼ 24 

Tab. 3: Daten der RNA-Ausbeute vor und nach Dnase-Verdau

Darstellung der RNA-Ausbeute vor bzw. nach Dnase-Verdau als MW der Kontroll-, DCM-, AS- und KHK-Gruppe

2.9.2. Etablierung quantitativer PCR

2.9.2.1. Optimale Spezifität durch Hot-Start-Technik

Die PCR wurde mit Hot-Start-Technik in dem Real Time-PCR-Gerät GeneAmp 5700 durchgeführt Die dazu verwendete Polymerase ist die AmpliTaq Gold, die bei Raumtemperatur chemisch modifiziert und damit inaktiv ist. Dadurch werden unspezifische Primerfehlpaarungen während der Probenvorbereitung nicht verlängert. Erst nach irreversibeler Aktivierung durch einen Hot Start von 10`bei 95°C beginnt das Enzym mit der spezifischen Verlängerung.

2.9.2.2. Optimale Primerkonstruktion

Ausgangspunkt für das Primerdesign ist die genomische DNA-Sequenz für das zu amplifizierende Gen. Optimalerweise werden die Primer derart entworfen, dass sie in ihrem komplementären Anlagerungsbereichein Intron überspannen. Auf diese Weise wird ein Mitamplifizieren von DNA-Verunreinigung vermieden. Die von uns verwendeten Primer sind intronüberspannend, so dass eine spezifische Amplifikation gewährleistet ist

2.9.2.3. Primeroptimierung für Real-Time-PCR

▼ 25 

Zur Primeroptimierung für die PCR-Reaktionen wurden systematisch die Ansätze verschiedener Konzentrationsverhältnisse Forward- (in 5´ Richtung amplifizierend) zu Reverse- (in 3´ Richtung amplifizierend) Primer von 1:1, 1:3 und 3:1 bei ansonsten konstanten Mastermixkomponenten ausgetestet. Die einfache Primerkonzentration entsprach 5 pmol. Optimal ist das Primerkonzentrationsverhältnis, wenn keine Primer-Dimerbildung und keine Primerselbstinhibition stattfindet.

Des Weiteren wurde die vom Hersteller empfohlene Anlagerungstemperatur optimiert, indem in einem PCR-Durchgang Variationen um je 2°C nach unten bzw. oben ausgetestet wurden. In den PCR Reaktionen wurde das Verhältniss 1:1 Forward-zu Reverseprimer und ein Annealingsschritt von 60`` bei 60 C° ausgewählt.

2.9.2.4. Validierung der optimalen PCR Zykluslänge

Die Validierung der optimalen Zykluslänge für die PCR der CnB (ANP, BNP, GAPDH) cDNA erfolgte, indem eine repräsentative RNA auf gleiche Weise wie die untersuchten Proben reverse transkribiert und in 50 ng Ansätzen mit den spezifischen Primern 32-46 Zyklen amplifiziert wurde. In einem Zweizyklentakt wurde je ein Ansatz entnommen, dessen Reaktion gestoppt und anschließend in einem Ethidiumbromidgel elektrophoretisch aufgetrennt, um mit UV-Licht detektiert werden zu können. Die Aufnahme der Ethidiumbromid gefärbten Banden erfolgte mittels einer Geldokumentationsanlage (Biometra). Die Bandenstärken wurden mit dem Alpha-ease-Computerprogramm quantifiziert und logarithmisch in Abhängigkeit zu ihrer Zykluslänge dargestellt. Die Zyklusbereiche, in denen die Amplifikation linear verläuft, sprechen für eine optimale Amplifikationseffizienz, bei der die Zunahme des Amplifikats von einem Zyklus zum nächsten mit den zur Verfügung stehenden Mitteln am besten detektiert werden kann. Geht die Amplifikation in ein Plateau über, sind die Bereiche der optimalen PCR-Effizienz überschritten. Für den Plateau-Effekt in der Amplifikationskurve ist hauptsächlich die zunehmende Kopienzahl verantwortlich, durch die das Reannealing der Produktstränge mehr und mehr die Primeranlagerung antagonisiert (Produkthemmung). Die derart (s.o.) ermittelten optimalen Bedingungen dienten als Anhaltspunkte und konnten nicht 1:1 auf das Real-Time-PCR-Gerät übertragen werden, da hier mit anderen Amplifikationsraten gerechnet werden muss. Für die Quantifizierung der CnB mRNA (ANP, BNP, GAPDH) wurden auf dem Real-Time-PCR-Gerät 40 PCR-Zyklen gewählt. Der Auswertzyklus wurde für CnB und ANP bei 25-32, für BNP bei 20-30 und für GAPDH bei 21-25 Zyklen gelegt.

2.9.3. Validierung der Quantifizierung anhand einer Eichgeraden

2.9.3.1. Erstellen einer Eichgerade

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In jedem PCR-Durchgang wurde eine Verdünnungsreihe mit bekannten Ausgangskonzentrationen cDNA mitgeführt ). Zum Erstellen einer Standardgerade wurden die Ct–Werte des jeweiligen Verdünnungsschrittes invers logarithmisch zu der Ausgangskonzentration der cDNA dargestellt. Es ist darauf zu achten, dass die Ausgangskonzentrationen der zu messenden Proben innerhalb des Konzentrationsbereichs der Verdünnungsreihen liegen, da eine gleiche PCR-Effizienz vorliegen sollte, um die entsprechende Standardgerade zur Quantifizierung heranziehen zu können. Standardgeraden sind nicht nur Grundlage der PCR-Quantifizierung anhand Standardgeradengleichungen ), sondern dienen auch als Kontrolle der PCR-Effizienz. Mit ihrer Hilfe können, in einer vergleichenden Studie mit PCR-Durchgängen verschiedener Gene, deren PCR-Effizienzen verglichen werden. Geht man von einer 100%-igen Effizienz aus, so wird mit jedem Zyklus eine Verdopplung der Amplifikationsmenge erreicht

Abb. : Standardgerade einer PCR-Quantifizierung

Die Ct–Werte des jeweiligen Verdünnungsschrittes werden invers logarithmisch zur Ausgangskonzentration der cDNA dargestellt.

2.9.3.2. Auswertung mit Hilfe der Standardgeradengleichung

Nach Beendigung der Amplifikation wurde der PCR-Ablauf als graphischen Darstellung, in der die PCR-Zyklen gegen die Fluoreszenslevel der Proben aufgetragen sind, von der Gen-Amp5700 Software ausgegeben (

▼ 27 

In den Amplot wurde zur Auswertung eine Linie auf Höhe eines ausgewählten Fluoreszenzsignals der y-Achse als parallele x-Gerade gelegt. Kriterium ist hierbei, dass bei diesem Signal alle Proben einen ersten deutlichen Anstieg von der Grundlinie zeigen und die Steigung der Amplifikationsplots gleichmäßig und optimalerweise maximal verläuft. Damit wurde das Ziel verfolgt, die Auswertlinie in einen der ersten Zyklen mit maximaler PCR-Effizienz zu legen. Dieser wurde anschließend als Auswertzyklus (Treshold-Cycle = Ct–Wert) einer jeden Probe bestimmt. Der Ct–Wert entspricht dem Zyklus, in welchem die jeweilige Probe das Fluoreszenssignal der Auswertlinie erreicht hat. Da das Fluoreszenzsignal auf dem Vorhandensein doppelsträngiger DNA basiert und proportional zur Amplifikationsmenge der spezifischen Gene ist, erreichten die Proben mit einer höheren Ausgangskonzentration spezifischer cDNA pro Gesamt-RNA Ausgangskonzentration das Ct-Signal entsprechend früher. Es wurde mit Hilfe der Verdünnungsreihen (s.o.) eine Standardgerade erstellt, indem man die bekannten Ausgangskonzentrationen (cDNA) der einzelnen Verdünnungsschritte invers logarithmisch gegen die dazu gemessenen Ct -Werte darstellt. Der ermittelte Proben-Ct-Wert wurde auf diese Gerade bezogen und in deren Standardgeradengleichung (y = mx+b) eingesetzt. Steigung und y-Achsenschnittpunkt der Geraden wurden determiniert, so dass mit Hilfe des eingesetzten Ct-Wertes der zu quantifizierenden Zielgene (semiquantitativ) die Konzentrationen der spezifischen RNA in der konstanten Gesamt-Ausgangs RNA bestimmt werden konnte, wenn die Gleichung nach x aufgelöst wurde.

Abb. : PCR-Amplot

Darstellung, eines PCR-Amplot, in dem Fluoreszenslevel versus PCR-Zyklusanzahl aufgezeichnet werden

2.9.3.3. Kalibrator und externe Standardisierung

Um die erhaltenen Konzentrationswerte an cDNA zu quantifizieren, wurden sie relativ zu einem Kalibrator gesetzt, welcher einer physiologischen Referenz gleichkommt. Im Rahmen der vorliegenden Untersuchungen wurde der MW der Kontrollgruppe als Kalibrator definiert. Zusätzlich wurden die Werte auf eine endogene Kontrolle, ein sogenanntes „House-keeping-Gen“ (HK-Gen = GAPDH) normalisiert, um den Unterschieden und Ungenauigkeiten in den Ausgangskonzentrationen sowie der Qualität der Gesamt-RNA und der Effizienz der RT-Reaktion Rechnung zu tragen. Bei dem externen Standard sollte es sich um ein gegenüber den Kranheitseinflüssen der untersuchten Patientengruppen stabiles Gen handeln.

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Folgende Formel wurde zur Berechnung der kalibrierten und standardisierten PCR-Ergebnisse verwendet:

2.9.4. Proteinausbeute

Von jeder Myokardprobe wurden Stücke mit Feuchtgewichten zwischen 60-80 mg entnommen und deren Proteine extrahiert. Nach Austesten verschiedener Lysispuffervolumen/FG-Verhältnissen (1:5, 1:10 und 1:15) und unterschiedlicher Homogenisierungsmatrixes wurde die Proteinextraktion optimiert. Die Protein-Ausbeuten wurden tabellarisch dargestellt. Und waren zwischen den untersuchten Gruppen statistisch nicht signifikant unterschiedlich Ein Lysispuffervolumen/FG-Verhältnis von 1:5 ermöglichte die größten Ausbeuten und wurde für die Extraktionen beibehalten.

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Tab. 4:Daten der Protein-Ausbeute

Darstellung der Protein-Ausbeute als MW der Kontroll-, DCM-, AS- und KHK-Gruppe

2.9.5. Etablierung quantitatives Western Blot-Verfahren

2.9.5.1. Proteineinsatz und Proteinqualität

Zu Beginn der Versuche wurden mit dem CnB-AK Verdünnungsreihen mit Proteinkonzentrationen von 10-50 µg durchgeführt. Diese Verdünnungsreihen wurden durch Optimierung der AK-Konzentrationen solange validiert, bis das spezifische Signal eine saubere, konzentrationsabhängige Steigerung der OD zeigte. Aus den Verdünnungen konnte nun die Proteinmenge bestimmt werden, deren spezifische CnB-Bande deutlich sichtbar und gut von den Banden der vorherigen bzw. darauffolgenden Probe abzugrenzen war. Die graphisch in einem Achsenkreuz dargestellte Abhängigkeit von Proteinkonzentration zu OD-Signal zeigte in diesem Konzentrationsbereich einen linearen Anstieg. Für den CnB spezifischen Western Blot wurde eine Gesamtprotein-Konzentration von 40 µg/Probe ausgewählt.

Die Proteinqualität kann bei der Extraktion, durch Hitzedenaturierung in der Aufarbeitung für die SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE), bei der Zwischenlagerung und durch eine inkonstante Kühlkette von Proteinextraktion bis –trennung beeinflusst werden. Sie wurde anhand des Proteinmusters und der Bandenqualität des in den Comassiegelen angefärbten Gesamtproteins beurteilt und kontrolliert (. Der Bandenverlauf der verwendeten Proben war gleichmäßig und entsprach einem typischem Myokardproteinmuster, ein Hinweis auf guterhaltene und nicht degradierte Proteine.

2.9.5.2. Optimale Trennbedingungen bei SDS-PAGE

▼ 30 

Bei der Optimierung der Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) mussten einige Parameter auf die relativ geringe Molekülmasse des CnB Proteins abgestimmt werden. Für optimale Wanderungbedingungen der Proteine dieser Größe wurde im Trenngel ein Acrylamidanteil von 12,5 % gewählt. Die Laufzeit des Gels wurde auf 30 Min. bei 80 V zum Konzentrieren im Sammelgel und anschließend 1,5 h bei 100 V zur Trennung optimiert. Die Pufferbereiche wurden für eine saubere Trennung und für einen effizienten Transfer in einen pH-Bereich von 7,3-11 eingestellt. Es wurde eine diskontinuierliche SDS-PAGE durchgeführt, um die Proteine vor der eigentlichen Trennung in einer konzentrierten Ausgangsbande zu fokussieren.

2.9.5.3. Optimale Transferbedingungen des Western Blot

Es ist eine Trägermembran nötig, auf die Proteine mit geringem Molekulargewicht effizient geblottet werden. In vorliegendem Versuchsaufbau wurde eine Nitrocellulosemembran mit Proteinbindungskapazität bis zu 180 µg/cm und einer Porengröße von 0,1-0,2 genutzt.

Das Wet-Blot-Verfahren gewährleistet durch große Puffervolumina und Durchflusskühlung, die übermäßiges Erwärmen der Proteine verhindern, einen proteinschonenden Transfer. Ein 20 %-iger Methanol-Anteil im Transferpuffer lockert die SDS-Moleküle von der Proteinoberfläche und begünstigt die Proteinbindung an der Nitrocellulosemembran.

▼ 31 

Die Strom und Spannungsstärke und die Dauer des CnB Blots wurden wie folgt ausgetestet und optimiert. Die Strom-bzw. Spannungsstärke wurde hochreguliert, wenn nach dem Blot noch Proteinbanden auf dem SDS-PAGE Gel mit Comassie-Bluefarblösung anfärbbar waren. Waren sowohl auf der Membran als auch auf dem SDS-PAGE Gel keine Proteinbanden mehr nachweisbar, wurde die angelegte Spannung herunterreguliert, da die Proteine während der Blotdauer zu weit in Richtung Anode fokussiert und durch die Membran hindurch geblottet worden sind.

Die Effizienz des Blotvorgangs, unter den angewandten Bedingungen wurde mit Hilfe der Ponceaurotfärbung der Membranen kontrolliert

2.9.5.4. AK-Optimierung

Die Hybridisierungmethode mit zwei Antikörpern führt zu einer Signalverstärkung gegenüber der direkten Proteinmarkierung, da von dem 1.AK potentiell mehr als ein HRP markierter 2.AK mit gebunden wird.

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Es wurden systematisch verschiedene Verdünnungsstufen des 1.AK (1:1500, 1:2000) und des 2.AK (1:150000, 1:300000) ausgetestet, um Hintergrundsignale und unspezifische Banden zu minimieren. Für den CnB-Blot wurde eine Verdünnung von 1:2000 für den 1.AK und 1:300000 für den 2.AK gewählt. Alle Chemilumineszenzsignale, die neben der spezifischen CnB-Bande nach Optimierung nicht vermieden werden konnten, waren ebenfalls auf der Negativkontrolle sichtbar und wurden daher als unspezifisch beurteilt. Der verwendete AK bindet spezifisch an CnB und zeigte keine Kreuzreaktion mit CnA.

2.9.5.5. Versuchskonsistenz und externe Standardisierung

Aus technischen Gründen konnten nur ein Einfachansätze jeder Probe durchgeführt werden. Um die Reliabilität der Ergebnisse zu überprüfen, wurde die beschriebenen Versuchsprozedur wiederholt. Anhaltspunkte für eine gelungene Reproduktion waren überwiegend gleiche Rangfolgen der Einzelproben innerhalb jeder Gruppe und gleiche Abweichungstendenzen der Krankheitsgruppen gegenüber der Kontrollgruppe in Blotdurchgang 1 und 2. Für einen quantitativen Western Blot ist die exakt gleiche Proteineinsatzmenge in die SDS-PAGE Vorraussetzung. Die photometrische Vermessung auf dem ELISA-Reader und die darauf basierende Konzentrationseinstellung der Proteine weist methodische Ungenauigkeiten auf, die berücksichtigt werden müssen. Daher wurden die Ergebnisse extern auf einen Bezugswert standardisiert. Als Bezugsbande diente uns die 40 kDa große Aktinbande, die auf Comassiegelen quantifiziert wurde Ihr myokardialer Gehalt gilt als stabil und resisten gegenüber hypertrophievermittelten Regulationsvorgängen.

2.9.6. Etablierung der quantitativen Fibrosemessung

Die Quantifizierung des linksventrikulären Fibrosegehaltes musste sich auf die Untersuchung der entnommenen Myokardproben beschränken, die nur repräsentativ den Gesamtfibrosegehalt des gesamten linken Ventrikels darstellen. Da eine ungleichmäßige Verteilung der Fibrose im Myokard vorliegt, ist es wichtig, mit einer methodisch hohen Messgenauigkeit eine möglichst große Fläche in die Quantifizierung einzubeziehen. Eine komplette Ausmessung der Präparatfläche ist auf Grund des hohen Arbeitsaufwands nicht vertretbar. Andererseits erhält man durch unzureichende Anzahl der Messungen gegebenenfalls nicht repräsentative Ergebnisse.

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Deshalb musste das Messmodul BG 7, das sich zuvor in der Vermessung von Biopsaten zur Beurteilung von Spenderorganen bewährt hat, den Anforderungen der Vermessung eines größeren histologischen Präparats angepasst werden. Dazu wurde zunächst ein Präparat mit einer 200-fachen Vergrößerung komplett vermessen, so dass Basisdaten für die realen Verhältnisse des interstitiellen Gewebes gewonnen werden konnten. In weiteren Voruntersuchungen wurde näherungsweise ermittelt, wieviele Areale vermessen werden mussten, um Ergebnisse zu erhalten, die sich statistisch nicht signifikant von dem “Realwert” unterscheiden. Im Ergebnis dieser Analysen hat sich das in Kapitel 2.8 Material/Methoden beschriebene Verfahren als geeignet erwiesen. Die so ermittelten Ergebnisse (einer Messung von 14,7 mm ) unterschieden sich nicht mehr statistisch signifikant von denen der Präparatgesamtläche mit 31,6mm.

Damit liess sich die Farbsegmentierungsmethode zur Quantifizierung des Anteils an interstitiellem Gewebe (Fibrose, Narben) im Myokard einsetzten.

2.10. Darstellung der Ergebnisse und Statistik

2.10.1. Darstellung der Ergebnisse

Zur externen Standardisierung der PCR wurde von jeder Probe ein Zielgen/GAPDH–Quotient gebildet. Im Weiteren wird dies als Normalisierung der Werte bezeichnet.

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Mit einer semiquantitativen PCR ist es nicht möglich absolute Konzentrationen zu bestimmen. Die im Ergebnissteil aufgeführten Endwerte entsprechen dem normalisierten mRNA-Gehalt des jeweiligen Zielgens relativ zu einem Kalibrator ( ).

Die Gruppenmediane der hypertrophierten Herzen (DCM, AS, KHK) werden auf den Median der Kontrollgruppe des betreffenden Gens bezogen und als dessen prozentualer Anteil dargestellt (% d. Ko).

Für die Korrelationen wurden die gemessenen mRNA-Werte der Zielgene ohne Normalisierung und Kalibrierung benutzt. Von den Korrelationsanalysen und den statistischen Berechnungen der Zielgene wurden die Werte ausgeschlossen, die außerhalb des Wertebereichs von MW ± 4-fache Standardabweichung lagen und als Ausreißer betrachtet wurden.

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In den Western Blot Verfahren der untersuchten Krankheitsgruppen wurden auf jedem der 3 Blots zehn identische Kontrollherzen mitgeführt, deren Median jeweils als Vergleichswert diente. Die Endergebnisse entsprechen dem MW der Daten aus 2 Blots

statistischen Berechnungen des CnB Proteingehaltes erfolgte unter Vernachlässigung der Werte, die nach oben genannten Kriterien als Ausreißer betrachtet wurden.

In den Boxplots wird der Median (Me) als waagerechte Linie dargestellt. Die 25% bzw. 75% Perzentilen ( 25%/75%Perz.) entsprechen der Box. Die Balken markieren den größten Wert der äußeren Eingerenzung (Me ± 2-fache Spannweite ). Als Extremwerte(*) werden Fälle mit Werten bezeichnet, die mehr als 3 Interquartilsabstände von dem 1. und 3. Quartil abweichen. Werte, die zwischen 1,5 - 3 Interquartilsabstände von dem 1. und 3. Quartil abweichen, werden von SPSS mit einem Kreis (o) markiert.

2.10.2. Statistik

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Von der Gruppe der Kontrollherzen und den Gruppen der hypertrophierten Herzen wurden Median (Me) ± 25%/75%-Perzentile (25%/75%-Perz.) der mRNA- und Proteinmessungen berechnet. Um einen Vergleich zu ermöglichen, wurde ergänzend der Mittelwert (MW) ± Standardfehler (SEM) angegeben.

Für die Signifikanzberechnungen wurde nur mit dem Me der nicht parametrische Mann-Whitney-Test durchgeführt, da keine Normalverteilung vorlag. Die berechneten Signifikanzen werden auf einem Niveau von p<0,001 bzw. p<0,05 angegeben.

Die Korrelationsanalysen wurden nach Spearman durchgeführt und mit einem Signifikanzniveau von p<0,01 bzw. p<0,05 bestimmt. Die statistische Auswertung erfolgte mit SPSS 11.0 (Fa. SPSS for Windows).


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