4. Diskussion

4.1. Wichtigste Ergebnisse

▼ 49 (fortgesetzt)

In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob der CnB mRNA- und Proteingehalt in linksventrikulären Myokard-proben bzw. -biopsien in hypertrophierten Herzen mit AS, DCM und KHK gegenüber einer Kontrollgruppe verändert ist. Hierzu wurden eine extern standardisierte Real-Time-PCR-Technik und ein etabliertes Western Blot Verfahren angewandt. Als Positivkontrolle für hypertrophiespezifische Expressionsveränderung dienten die parallel gemessenen ANP und BNP mRNA-Anteile derselben Herzen. Darüber hinaus wurden die krankheitsspezifischen Veränderungen des interstitiellen Gewebes der untersuchten Herzen, das heißt der linksventrikuläre Fibroseanteil in DCM, KHK und Kontrollherzen, quantifiziert.

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In den hypertrophierten Herzen mit DCM zeigte sich eine signifikante Erhöhung der CnB mRNA auf ca. das Dreifache der Kontrollen (293% des Me der Ko, p<0,001).

Die Herzen mit AS wiesen eine erniedrigte CnB mRNA-Expression (43% des Me der Ko, n.s.) auf, ihr Proteingehalt war gegensätzlich dazu tendenziell erhöht (139% des Me der Ko, n.s.). Im Endstadium einer KHK zeichnete sich weder auf Gen- (79% des Me der Ko, n.s.) noch auf Proteinebene (78% des Me der Ko, n.s.) eine deutliche Veränderung des CnB Gehalts gegenüber dieser Kontrollgruppe ab. Dagegen war der mRNA-Gehalt der Hypertrophiemarkergene ANP und BNP in allen Gruppen der hypertrophierten Herzen signifikant heraufreguliert.

In allen hypertrophierten Herzen wurde, gegenüber der Kontrollgruppe mit einem Fibrosegehalt von 7,35 % ±5,2/8,9, bei DCM (14,8 % ±10,8/16,8) und bei KHK (10,7 % ±8,3/15) ein signifikant erhöhter Fibrosierungsgrad gemessen.

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Im Herzen befindet sich der größte Anteil von CnR im Zytoplasma und in den Mikrosomen der Myozyten. Ebenfalls zytoplasmatisch, also in unmittelbarer Nähe lokalisiert, findet man den Transkriptionsfaktor NFATc3 . Kommt es, in kardialen Stressituationen, zu einer vermehrten Freisetzung bestimmter neurohumoraler Faktoren, die hypertrophievermittelnd auf das Myokard einwirken, führen Veränderungen der Calciumhomöostase zu einer Aktivierung von CnR. Es bildet einen Komplex mit NFATc3, der mit Hilfe der Phospholipidbindungsstelle von CnR in den Zellkern diffundieren kann . Hier wird der Transkriptionsfaktor dephosphoryliert und aktiviert die Induktion hypertrophiespezifischer Gene.

Die enzymatische Aktivität von CnR wird in erster Linie durch Konzentrationsanstiege des intrazellulären Calciumgehalts induziert.

Als optimale Bedingung zur Aktivierung von CnR werden langanhaltende Calcium-Konzentrationsanstiege 50 zwischen 1-3 * 10 mol/l beschrieben 51. B. Feng und P. Stemmer 52 haben mit Enzymaktivitätsmessungen verschiedener Calcineurinmutanten der einzelnen Calciumbindungsstellen einen Bereich von 2 *10 mol/l bis optimalerweise 2 *10 mol/l ermittelt, in dem alle Calciumbindungsstellen sowohl von CnB als auch von Calmodulin gesättigt sind. Das Enzym besitzt unter diesen Umständen seine maximale Aktivität.Schnelle Ca-Spikes, wie sie im Ablauf von Kontraktionen im schnellen Skelett–oder Herzmuskel vorkommen, reichen nicht aus, um eine Aktivitätssteigerung zu bewirken. Hingegen stellt langsame, tonisch innervierte Haltemuskulatur mit andauernder intrazellulären Calciumkonzentration um 1-3 *10 –7 mol/l eine sehr geeignete Umgebung zur Calcineurinaktivierung dar 53. Kommt es bei der Herzhypertrophie in Folge verschiedener exogener und endogener Stimuli zu einer dauerhaften Beeinflussung der myozytären Calciumhomöostase, wird das sarkoplasmatische Retikulum aufgefüllt und eine permanente Erhöhung des intrazellulären Calciumspiegels verursacht.

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Eine Ca Bindung hat nur einen geringen, aber signifikanten, direkten Einfluss auf die Aktivität der Phosphatase, während der Haupteffekt indirekt durch Induktion der Calmodulinbindung (s.u.) vermittelt wird. Die beiden C-terminal gelegenen Calciumbindungsstellen von CnB besitzen eine sehr starke Calcium-Affinität (Km = 1*10mol/l) und tragen zur Stabilität des aktiven Zentrums bei. Diejenigen am Aminoende des Proteins sind weniger stark calciumaffin (Km = 1*10mol/l). Sie vermitteln, nach reversibler Calciumbindung, durch Konformitätsänderung eine vermehrte Calmodulinbindung, die zur Freigabe des autoinhibitorisch geblockten katalytischen Zentrums und somit zur Aktivitätssteigerung führt .

Auf der anderen Seite wird die Enzymaktivität durch Faktoren mit inhibitorischem Einfluss auf CnR gehemmt. Dazu gehören einige endogene Inhibitoren wie z.B. das Ankerprotein AKAP79 oder das Phosphoprotein cain/cabin. Experimentell wurde das in verschiedenen genetischen Inhibitionsmodellen belegt, in denen auf Grund einer Überexpression von AKAP79 bzw. cain die Ausbildung von Hypertrophie blockiert werden konnte. In vitro konnte dies in Rattenmyozyten, die mit rekombinanten Adenoviren infizierte waren, gezeigt werden . In vivo wurden transgene Mäuse untersucht 54.

Die bekanntesten CnR Inhibitoren sind allerdings die Immunsupressiva Cyclosporin A und FK 506, mit Hilfe derer man, durch die Blockade der hypertrophischen Antwort kultivierter Myozyten nach Stimulation durch Angiotensin II (Ang II), auf die bedeutende Rolle von CnR bei der Entstehung der Hypertrophie aufmerksam geworden ist. Cyclosporin A und FK 506 formen mit ihren zugehörigen Bindungsproteinen Cyclophilin bzw. FKBP 12 Komplexe und binden in der autoinhibitorischen Domäne der katalytischen Untereinheit CnA 55. Hierdurch wird die enzymatische Aktivität der Phosphatase blockiert. Nach diesen Untersuchungen kam schnell die Frage auf, ob CnR möglicherweise ein pharmakologischer Angriffspunkt zur Verhinderung der Ausbildung bzw. des progredienten Verlaufs einer Herzhypertrophie und des konsekutiven Herzversagens sein könnte. In diesem Zusammenhang wurden sehr unterschiedliche Ergebnisse gefunden, so dass sich in der Literatur durchaus kontroverse Meinungen zu der inhibitorischen Funktion von Cyclosporin A und FK 506 auf CnR gebildet haben.

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In Tierhypertrophiemodellen, die durch inappropiate Expression von sarkoplasmatischen Proteinen bei gleichzeitig vermehrter CnR-Aktivität gekennzeichnet sind, konnte die Ausbildung von Hypertrophie durch Cyclosporin A verhindert werden (Molkentin JD, Lu JR, Antos CL, Markham EN. :24). Auch Meguro et al. belegten mit ihren Experimenten einen hypertrophiereduzierenden Effekt, wiesen aber auf eine verstärkte Mortalität der mit Cyclosporin A behandelten Tiere hin. In druckbelasteten Mäusen und Ratten nach aortalem Banding konnte wiederum keine Reduktion der Hypertrophie durch Calcineurininhibition mit Cyclosporin A gezeigt werden . In dieser Studie war auch bei spontan hypertensiven Ratten keine Reduktion der Hypertrophie durch eine Behandlung mit Cyclosporin A nachzuweisen.

Diese Differenzen können auf Variationen in der experimentellen Technik oder der Hypertrophiezeiten zurückzuführen sein. Es muss kritisch berücksichtigt werden, dass die reduzierte CnR Aktivität nach Intervention mit Cyclosporin A zumeist mit der Aktivität einer Kontrollgruppe verglichen wurde, anstatt die CnR Aktivität einer Versuchsgruppe vor und nach Intervention mit Cyclosporin A vergleichend darzustellen. Den oben diskutierten Untersuchungen lagen zumeist Zeitspannen von 2-4 Wochen zu Grunde, in denen die Hypertrophie provoziert und der Inhibitor verabreicht wurde. Nicht berücksichtigt werden dabei Regulationsmechanismen, die bei Patienten gegebenenfalls erst in fortgeschrittenen Krankheitsstadien eingreifen und den CnR Gehalt erhöhen bzw. deren Aktivität effektiv steigern würden. Derartige zeitversetzte Faktoren entziehen sich der experimentellen Blockade durch Cyclosporin A.

Die meisten Arbeitsgruppen, die nach Intervention mit Cyclosporin A keine Reduktion der Hypertrophie zeigen konnten, detektierten aber eine deutliche Reduktion der CnR Aktivität zum Zeitpunkt des Aktivitätsassay. Sie folgerten daraus, dass die Hypertrophie hauptsächlich einem anderen Regulationsmechanismus unterliegen muss.

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Diese Ansätze stellen in Frage, ob CnR nicht ohnehin erst in fortgeschrittenen Hypertrophiestadien eine größere Rolle spielt und in kurzweiligen Tierhypertrophiemodellen der Schwerpunkt auf anderen Signalkaskaden liegt. Bedeutend sind, neben dem CnR-NFATc3 Weg, die Signalkaskaden der verschiedenen Proteinkinasen wie Protein Kinase C (PKC) und MAPK, die letztendlich auch über Transkriptionsfaktoraktivierung zu einer Induktion hypertrophierelevanter Gene führen. Sie sind durch einen langen Signalweg gekennzeichnet und daher prädestiniert zu Interaktionen mit anderen Signalkaskaden. Bisher kennt man Schnittpunkte mit dem CnR-NFATc3 Mechanismus 56 57, es besteht jedoch noch keine experimentelle Klarheit über eine gegenseitige regulatorische Beeinflussung der beiden Signalkaskaden. Es befinden sich z.B. in der ANP Promotorregion die Sequenzen eines AP1 abhängigen cAMP-responsive-Element (CRE) und die von 2 NFATc3 Bindungsstellen in unmittelbarer Nähe. Das CRE-Element bindet cJun/ATF2 Dimere, die in ihrer Aktivität von der MAPK Signalkaskade abhängig sind. Möglicherweise findet hier die Bindung der regulatorischen Faktoren erst nach Komplexbildung statt, was ein Zusammenführen der beiden Signalwege bedeuten würde 58.

Hinsichtlich dieser unklaren Resultate muss gesagt werden, dass der Regulationsmechanismus von CnR und dessen Interaktionen mit anderen Signalwegen noch nicht vollends aufgeklärt ist und offensichtlich nicht durch den alleinigen Angriffspunkt des Cyclosporin A kontrolliert werden kann. Unter anderem scheint die Pathogenese der Herzhypertrophie entscheidend zu sein, ob die Blockade von CnR komplett ist. In Abhängigkeit der Grunderkrankung gibt es möglicherweise weitere, noch unbekannte, endogene Regulationsmechanismen, die transkriptionell, translationell oder posttranslationell potentiell in den Regulationsablauf der Phosphatase-Aktivität eingreifen. Geht man z.B. von einer signifikanten Regulation über CnB aus, würde diese Komponente nicht vom Cyclosporin A inhibiert werden. Letztlich ist CnR in das komplexe Zusammenspiel vieler Signalkaskaden und Regulationsmechanismen eingebunden, so dass es wegen der multifaktoriellen Interaktion schwierig sein dürfte, hier punktuell zu inhibieren, um in die molekularen Zusammenhänge der Herzhypertrophie zu intervenieren.

Außerdem ist wie bei allen tierexperimentellen Untersuchungen fraglich, ob die Resultate auf den Menschen übertragbar sind und ob die experimentell eingesetzten Dosen in einem für den humanen Organismus tolerierbaren Bereich liegen. Besonders bei Cyclosporin A muss berücksichtigt werden, dass sein breites Wirkspektrum neben CnR eine Vielzahl von anderen zellulären Molekülen beeinflusst. Kardial werden weitere Effekte auf die Entwicklung der Hypertrophie, unter anderem durch Beeinflussung des Wachstumsfaktors TNF α 59 60 und der Calciumfreisetzung aus dem Sarkoplasmatischen Retikulum 61 62, beschrieben. In der Klinik werden die Calcineurininhibitoren Cyclosporin A und Tacrolimus (FK 506) zur Immunsuppressionstheraphie nach Organtransplantation eingesetzt. In vielen Fällen entwickelt sich eine Hypertension, die in Folge der häufig vorhandenen steroidalen Nebenwirkungen, aber auch auf Grund direkter myokardialer Effekte entstehen könnte 63. Cyclosporin A inhibiert die Na- K-ATPase, was zu einer Nephrotoxität führen kann, die ebenfalls eine sekundäre Hypertonie zur Folge hat 64 .

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Abb. : Hypertrophieinduzierte Signalkaskaden

CnR abhängige Signalkaskade und andere wichtige Transduktionswege extrazellulärer Signale, die bei Hypertrophie zu einer Beeinflussung der Genexpression führen.
Abk. : Adenylatcyclase (AC), Angiotensin II (ANG II), Transkriptionsfaktor (AP-1), cyclisches Adenosin-Monophosphat (cAMP), Cyclosporin A (CsA), Diacylglycerin (DAG), Extrazellullär -regulierte Kinase (ERK), Endothlin 1 (ET-1), Tacrolimus (FK 506), Transkriptionsfaktor (GATA), G-Protein gekoppelter Rezeptor (GPCR), Inositol-1,4,5-Triphosphatase (IP3), Janus-Kinase (JNK), Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK), Nuclear factor of activated T-cells (NFAT), Phenylephrine (PE), Proteinkinase A (PKA), Proteinkinase C (PKC).

4.3. CnB spezifische Genexpressionsregulation und Proteingehalt in hypertrophierten Herzen mit DCM

Bisher publizierte Arbeiten an humanen Herzen bzw. Tiermodellen mit DCM beziehen ihre Untersuchungen vorwiegend auf die katalytische Untereinheit von CnR, auf CnA 65. Es wird eine verstärkte Aktivität und ein erhöhter CnA Anteil in Herzen mit DCM beschrieben 66Da CnB als regulatorische Untereinheit zur Enzymaktivität unbedingt gebraucht wird, ist demnach mit einem erhöhten Bedarf zur maximalen Aufsättigung der vorhandenen CnA- Untereinheiten zu rechnen. Die vorliegende Arbeit konzentriert sich auf die Quantifizierung von CnB in linksventrikulären Myokardproben von explantierten Herzen mit DCM und hat eine statistisch signifikante Erhöhung des CnB mRNA-Gehalts nachgewiesen. Auf Proteinebene war, konform zu der gesteigerten mRNA-Expression, die CnB Konzentrationin Herzen mit DCM erhöht. Der Anstieg ist in einem zweiseitigen Test nicht signifikant, wird aber in einem einseitigen Test signifikant. Das Ausbleiben der Signifikanz schon im zweiseitigen Test kann möglicherweise durch die hohe, biologische Varianz der Proben wie Alter, Sex, unterschiedliche Ätiologie der DCM, etc. erklärt werden. Das könnte heißen, dass die Proteinsynthese in Herzen mit DCM gesteigert ist, da nach hypertrophiespezifischen Stimuli ein vermehrtes Angebot an mRNA vorliegt. Entsprechend fanden Diedrichs et al. in humanen Herzen mit DCM, neben einer signifikant erhöhten CnR-Aktivität, ebenfalls einen signifikant erhöhten CnB-Gehalt.

Der erhöhte Anteil an CnB und ein verstärkter intrazellulärer CaEinstrom bei Hypertrophie bedeuten für die Phosphatase optimale Bedingungen zur Entfaltung ihrer Enzymaktivität. Das könnte bewirken, dass die CnR abhängige Signalkaskade in Herzen mit DCM bedeutend aktiviert ist und zu einer Induktion hypertrophiespezifischer Gene beiträgt, die zu einer Progression der kardialen Hypertrophie führt.

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Die CnB mRNA der an DCM erkrankten Herzen korrelierte nicht mit den mRNA-Werten der Hypertrophiemarkergene ANP und BNP. In Tiermodellen, in denen Tenhunen et al. 67 durch Ventrikeldilatation eine Wandspannung induzierten, wurde auch kein Zusammenhang zwischen CnR und der Expression von BNP beschrieben. Neben den Mechanismen, die für die hypertrophiespezifische Induktion von ANP und BNP verantwortlich sind, scheinen für die Regulation von CnB noch bzw. auch andere Faktoren eine Rolle zu spielen.

Weder die Sequenz der genomischen DNA noch die Genstruktur von CnB sind bisher völlig geklärt, so dass es noch keine Identifikation eines Promotorbereiches mit Hinweisen auf Expressionsregulatoren gibt.

In den an DCM erkrankten Herzen, die in dieser Studie untersucht wurden, konnten keine Zusammenhänge zwischen CnB Proteingehalt und Patientenalter bzw. Herzgewicht gefunden werden. Des Weiteren gab es keine Hinweise auf eine gegenseitige Beeinflussung des CnB Gehalts und bestimmten klinischen Parametern wie Linksventrikulare Ejektionsfraktion (LVEF%) und Linksventrikulären enddiastolischen Diameter (LVEDD). Der pharmakologische Einfluss der medikamentösen Therapie konnte hierbei nicht berücksichtigt werden. CnB ist demnach kein geeigneter Marker für die Progredienz des Krankheitsverlaufes der DCM.

4.4. CnB spezifische Genexpressionsregulation und Proteingehalt in hypertrophierten Herzen mit ICM nach koronarer Herzerkrankung

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In der vorliegenden Arbeit gibt es keinen Anhalt für eine regulatorische post-, transkriptionelle Beeinflussung der kardialen CnB Expression bei Patienten mit ICM nach KHK. Der CnB Gehalt unterscheidet sich, sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene, nicht signifikant von der Kontrollgruppe. Der fehlende Anstieg von CnB und ein fehlender korrelativer Zusammenhang zwischen CnB und ANP bzw. BNP weisen darauf hin, dass CnB bei KHK, im Unterschied zu insuffizienten Herzen mit DCM und AS, eine weniger bedeutende Rolle in der Aktivitätsregulation von CnR spielt. Möglicherweise unterliegt CnR hier einer regulativen Kontrolle durch intrazelluläre Calciumionen oder dem Einfluss noch unbekannter Regulationsmechanismen

Die ICM unterscheidet sich durch ihren Pathomechanismus von den auch untersuchten Hypertrophieformen. Es ist denkbar, dass die CnR abhängige Signalkaskade deshalb bei KHK nicht von Bedeutung ist oder mit anderen Signalwegen interagiert.

4.5. CnB spezifische Genexpressionsregulation und Proteingehalt in hypertrophierten Herzen mit AS

Der CnB mRNA-Gehalt in linksventrikulären Myokardproben von Patienten mit AS war gegenüber einer Kontrollgruppe deutlich erniedrigt, der Proteingehalt hingegen war erhöht. Sowohl für die mRNA- als auch die Proteindaten wäre eine erhebliche Erweiterung der Zahl der Patientenproben nötig, um eine statistische Signifikanz der Werte erreichen zu können. In einer vergleichbaren Studie wurde ebenfalls ein erhöhter Proteingehalt für CnA in einer Patientengruppe mit AS bei normaler EF gezeigt 68.

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Da die Veränderungen des CnB Gehaltes nicht mit den gesteigerten Proteinexpressionen korrespondieren, wurde nach zwischengeschalteten Regulationsmechanismen gesucht. Durch Sequenzanalysen mittels UTR-Scan 69 konnten in der 3`UTR von CnB putative Bindungsstellen für hnRNPE1 und hnRNPK 70und 10 repetitive Motive für ribosomale Bindungsstellen nachgewiesen werden. Die Regulatorproteine hnRNPE1 und hnRNPK können durch Bindung an die entsprechenden Motive eine Herauf-oder Herabregulation der Translation induzieren 71 72 73 74

Tatsächlich wurde in Herzen, die infolge einer höhergradigen AS hypertrophiert sind, auch ein erhöhter Gehalt an hnRNPE1 und hnRNPK mRNA gefunden 75. Bei Hypertrophie mit DCM und KHK wurde in derselben Studie diese Veränderung nicht gefunden. Im Kontext mit den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit könnte das heißen, dass dieser Mechanismus in der Regulation der CnB Genexpression involviert ist. Kommt es in Herzen mit AS zu einer vermehrten Degradation der mRNA oder zu einer Depression der Genexpression, könnte die mRNA im Anschluss einer Translationskontrolle unterliegen, die durch gesteigerte Translationsrate zu einem erhöhten Proteinangebot führen könnte. Für CnR würde das, zu vergleichen mit der Situation bei DCM, ein großes Angebot an CnB und damit optimale Bedingungen für die enzymatische Aktivität bedeuteten. In der Literatur sind bisher nur Hinweise auf einen posttranskriptionellen Regulationsmechanismus von der katalytischen Untereinheit CnA, hin zu einer stärkeren Aktivierung, zu finden. Ritter, Hack, Neyses et.al detektierten bei ihren Untersuchungen an humanen Myokardbiopsien, ebenfalls aus Herzen mit AS, zwei CnR Proteinbanden unterschiedlicher Molekulargewichte. Zum Nachweis benutzten sie einen N-Terminus-spezifischen CnA AK und vermuten auf Grund ihrer Ergebnisse eine Proteolyse von CnR am C-terminalen Ende. Diese Modifikation soll in hypertrophen Herzen mit AS zu einer gesteigerten Aktivität der Phosphatase führen. Verantwortlich dafür ist ihrer Meinung nach möglicherweise das Kalpainprotein oder ein erhöhter intrazellulärer Calciumspiegel.

Da auch anhand der durchgeführten Korrelationsanalysen gezeigte wurde, dass die CnB Genexpression unabhängig von den beiden Markergenen ANP und BNP reguliert wird, sind in Herzen mit AS, neben den bekannten hypertrophiespezifischen Signaltransduktionswegen, offensichtlich anderen Regulationsmechanismen involviert.

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Diese Befunde weisen darauf hin, dass CnR eine bedeutende Rolle in der Pathopysiologie der hypertrophierten Herzen mit AS zukommt. CnB übernimmt hierbei möglicherweise eine wichtige Regulationsfunktion.

4.6. Remodeling-Hypertrophie und veränderte extrazelluläre Matrix

Bei chronischer Druck-bzw. Volumenbelastung des Herzens kommt es zu spezifischen Umbauvorgängen, die als kardiales Remodeling bezeichnet werden. Der Prozess des ventrikulären Remodelings dauert über Wochen und Monate. Die traditionelle Auffassung von zellulärem Remodeling bei Herzinsuffizienz umfasst eine Degeneration der Myozyten und Verlust an kontraktilem Potential 76.

Neben Veränderungen im myozytären Gewebe findet auch ein Remodeling der extrazellulären Matrix (EZM) statt 77 78. Man findet Veränderungen in der Zusammensetzung der EZM, ihres Fibroseanteils und ihres Kollagensubtypenmusters, die Konsequenzen für die Struktur und Funktion des lokalen Gewebes haben 79 80 81.

4.7.  Fibrosegehalt der Kontroll-und Patientengruppen

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Die untersuchten Herzen mit DCM, AS und KHK sind gekennzeichnet durch einen signifikanten Anstieg der Markergene ANP und BNP. Das ist ein charakteristisches Merkmal für eine ausgeprägte Hypertrophie 82 83 Die klinischen Parameter wie LVEF und LVEDD, die gegenüber der Kontrollgruppe signifikant erniedrigt bzw. erhöht waren, belegen ihre insuffiziente Herzleistung. Um zu untersuchen inwieweit die Herzen, einhergehend mit der Hypertrophie, ebenfalls Veränderungen des interstitiellen Gewebes, entsprechend dem extrazellulären Remodeling, aufweisen, wurde der Fibroseanteil von histologischen Präparaten des LV der Kontrollgruppe und den explantierten Patientenherzen mit DCM und KHK gemessen.

Der Fibrosegehalt der einzelnen Herzen wurde mit der mRNA-Expression von CnB und den Hypertrophiemarkern ANP und BNP korreliert und auf Abhängigkeit untersucht.

Der prozentuale Fibrosegehalt im Herzmuskelgewebe der Kontrollgruppe betrug 7,35% ±5,2/8,9%. Diese Herzen, die uns als Referenzgruppe für die mRNA- und Proteinmessungen dienten, zeigen somit keinen Anhalt für Vorgänge eines Remodelings der EZM.

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Die hypertrophierten Herzen der an DCM und KHK erkrankten Patienten wiesen einen signifikant erhöhten Fibroseanteil auf. Es haben somit Vorgänge eines Remodelings der EZM stattgefunden.

Knieriem 84 hat schon 1964 darauf hingewiesen, dass es nach relativer Koronarinsuffizienz bei exentrischer Muskelhypertrophie und Gefügedilatation oder nach primärer Minderversorgung des Myokardgewebes bei Koronarsklerose zu einer vermehrten interstitiellen und perivaskulären Fibrosierung kommt. Er hat in einer Gruppe gesunder Herzen einen Fibrosegehalt von 9,5% gemessen. Als sogenannter „Kritischer Fibrosegehalt“, bei dem es zu einem Versagen der Herzmuskelkraft kommt, wird in seiner Arbeit ein linksventrikulärer Wert von 15% beschrieben.

Nach Vergleich der SD der Einzelmessungen (EM) der einzelnen Herzen von ihrem MW gibt es keinen Anhalt, dass die Veränderung des interstitiellen Gewebes in einem an DCM erkrankten Herzen punktuell in ihrer lokalen Verteilung im Myokard der VW des LV deutlich inhomogener abläuft als in Folge ICM nach KHK oder in nicht pathologisch veränderten Herzen.

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Mit der Fragestellung, wie charakteristisch der Fibrosegehalt für bestimmte Myopathien ist und inwieweit er in verschiedenen Herzen bei gleichem Krankheitsstadium variiert, wurden die 25%-75%-igen Perzentilenbereiche der untersuchten Gruppen verglichen. Bei der KHK ist kausal eindeutig die Minderversorgung des Gewebes mit Blut für den Myokardschaden verantwortlich. Möglicherweise führt das Ausmaß des Infarktareals zu Varianzen der pathologisch veränderten Myokardmorphologie. Hingegen ist die DCM eine uniforme Erscheinung eines multifaktoriellen Prozesses, der verschiedene Gründe wie neurohumorale, infektiologische, toxische, genetische und andere Faktoren zu Grunde liegen können. Trotz der unterschiedlichen Pathomechanismen von DCM und KHK zeigte sich aber, dass die Veränderungen des interstitiellen Gewebes im Myokard der an DCM erkrankten Patienten, die sich alle in einem klinischen Stadium entsprechend NYHA 4 befanden, keine signifikant größere Streubreite hatten als in Herzen mit KHK. Entsprechend ist der gemessene Fibrosegehalt quantitativ nicht signifikant unterschiedlich bei den DCM- und KHK-Herzen.

Es gibt keine Hinweise auf einen direkten Einfluss des vermehrten myokardialen Fibrosegehalts durch CnB bzw. ANP und BNP, da kein linearer Zusammenhang zwischen Genexpressionsregulation und myokardialem Fibrosegehalt nachgewiesen werden konnte.

Die vorliegende Arbeit wird limitiert durch eine fehlende CnR Aktivitäts-Messung der untersuchten Herzen, anhand derer man die Bedeutung des CnB Gehalts für die Phosphataseaktivität direkt darstellen könnte. Die Hypothese, dass Konzentrationsunterschiede von CnB Einfluss auf die Aktivität des CnR haben, muss somit anhand der Ergebnisse anderer Arbeitsgruppen, die CnR-Assays in Herzen mit ähnlichen Krankheitsbildern durchgeführt haben, diskutiertewerden.

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In den einzelnen Gruppen mit DCM, AS und KHK hatten alle Patienten vergleichbare Begleitmedikation.

Eine weitere Limitation der Arbeit stellt die Auswahl der Kontrollgruppe dar, bei der es sich um organisch gesunde Spenderherzen nach abgelehnter Herztransplantation handelt. Sie zeigten keine pathologischen Veränderungen in ihrer Funktion und sind nach bestimmten Kriterien als morphologisch gesunde Herzen beurteilt worden. Sie wurden aus logistischen Gründen abgelehnt. Selten gab es andere, nicht-kardiale, Gründe wie zum Beispiel verlängerte Ischämiezeit nach Entnahme oder zu starke Verfettung als Spenderherz.

In der Methodik der vorliegenden Arbeit wurde ein etabliertes Real-Time-PCR Verfahren verwendet. Nach Testung verschiedener Referenzgene wie PDH und ACTB erwies sich das „House-keeping Gen“ GAPDH als stabil und am besten geeignet für die externe Standardisierung. ANP und BNP sind anerkannte Hypertrophiemarkergene. Da in der vorliegenden Arbeit dementsprechend die ANP und BNP mRNA in allen untersuchten, hypertrophierten Herzen signifikant angestiegen war, spricht das für eine Validität der externen Standardisierung und eine Spezifität der PCR-Ergebnisse.

▼ 64 

Der Western Blot war ein im Labor für den Nachweis anderer Proteine etabliertes Verfahren. Trotz langer Validierung des Verfahrens mit CnB AK und Bemühungen um genaue Ergebnisse blieb die Streuung der Daten relativ hoch.

Bei dem Untersuchungsmaterial handelt es sich um biologische Proben, die nicht sofort untersucht werden, sondern nach Entnahme lange Zeit tiefgefroren werden. Dadurch kann es zu Beeinträchtigung des Myokardgewebes und Dedradation der DNA bzw. Proteine kommen, was infolge die Varianz der Ergebnisse erhöht

4.9. Zusammenfassung

Calcineurin ist eine cytoplasmatische Calcium-Calmodulin abhängige Serin/Threonin-Phosphatase, die aus der katalytischen Untereinheit CnA und der regulatorischen, calciumsensiblen Untereinheit CnB besteht. Kardial beeinflusst CnR über den Transkriptionsfaktor “Nuclear factor of activated T cells” (NFATc3)85 die Genexpression.

▼ 65 

CnR besitzt hypertrophievermittelnde Eigenschaften. In verschiedenen Studien wurden eine gesteigerte Aktivität und ein erhöhter CnR-Gehalt bei unterschiedlichen Formen der Hypertrophie gezeigt. Es wird angenommen, dass CnR einen bedeutenden Einfluss auf die Progression des kardialen Remodelings insuffizienter Herzen hat.

Da die Enzymaktivität über die Calciumbindungsstellen vermittelt wird, hängt die Effektivität der CnR Wirkung möglicherweise von dem Gehalt der Untereinheit CnB ab. Basierend auf diesem Hintergrund wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht, inwiefern CnB in der Pathogenese von Herzhypertrophie und interstitieller Fibrosierung menschlicher Herzen eine Rolle spielt.

Dazu wurde der CnB mRNA- und Proteingehalt in hypertrophierten Herzen mit DCM, AS und KHK bestimmt und mit der Expression der Hypertrophiemarker ANP und BNP korreliert.

▼ 66 

Zum Vergleich wurden die Untersuchungen parallel in einer Kontrollgruppe gesunder Spenderherzen durchgeführt.

In den Herzen, von denen histologische Präparate zur Verfügung standen, wurde zusätzlich der Gehalt an interstitieller Fibrose gemessen. Als Verfahren dienten eine Real-Time PCR und ein etabliertes Western Blot Verfahren sowie einer, auf Farbsegmentierung beruhender, Fibrosemesseinrichtung.

Gegenüber der Kontrollgruppe zeigte sich in bei DCM eine Erhöhung des CnB Anteils, der in den durchgeführten Untersuchungen nur auf mRNA-Ebene statistisch signifikant war (293% des Me der Ko, p<0,001), auf Proteinebene aber den gleichen Trend zeigte.

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Die Herzen mit AS wiesen eine erniedrigte CnB mRNA-Expression (43% des Me der Ko, n.s.) auf, ihr Proteingehalt war gegensätzlich dazu tendenziell erhöht (139% des Me der Ko, n.s.). Als Grundlage dieser Veränderung ist eine translationelle Regulation denkbar. Im Endstadium einer KHK zeichnete sich weder auf Gen- (79% des Me der Ko, n.s.) noch auf Proteinebene (78% des Me der Ko, n.s.) eine deutliche Veränderung des CnB Gehalts gegenüber der Kontrollgruppe ab. CnB steht in keinem Zusammenhang mit den in allen untersuchten Krankheitsgruppen erhöhten Hypertrophiemarkergenen ANP und BNP und unterliegt möglicherweise zusätzlich oder gänzlich anderen Regulationsmechanismen.

In den hypertrophierten Herzen wurde, gegenüber der Kontrollgruppe mit einem Fibrosegehalt von 6,9 % ±2,2, bei DCM (14,78 % ±5,1) und bei KHK (11,10 % ±3,6) ein signifikant erhöhter Fibrosegehalt gemessen. Der mit der Hypertrophie einhergehend gesteigerte Anteil an interstitieller Fibrose zeigte weder mit CnB noch mit ANP bzw. BNP einen korrelativen Zusammenhang.

Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass sich CnB betreffend Gen-und Proteinexpression in den verschiedenen Untersuchungsgruppen der hypertrophierten Herzen nicht einheitlich verhält. Es scheint, je nach Ätiologie der Herzhypertrophie bzw. Insuffizienz, von verschiedenen Regulationsmechanismen beeinflusst zu werden. In den Herzen mit DCM führte dies zu einer gesteigerten Genexpression, darüber durch ein größeres Angebot an mRNA zu einer erhöhten Proteinsyntheserate. In den Herzen mit AS deutet eine Diskrepanz zwischen vermindertem mRNA-, aber erhöhtem Proteingehalt, auf eine posttranskriptionelle Regulation hin. Die Lokalisation von putativen Bindungsstellen für hnRNPE1 und hnRNPKund 10 repetitiven Motiven für das Eisen-Regulierte Protein (IRE) in der 3´UTR von CnB lässtt eine Translationskontrolle vermuten, die durch gesteigerte Translationsrate zu einem erhöhten Proteinangebot führen könnte.

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Die Bedeutung der ersichtlichen Regulationen von CnB bei DCM und AS für die CnR abhängige Signalkaskade und deren Auswirkung auf das Fortschreiten der Hypertrophie und die Vorgänge des Remodelings bleibt zu überprüfen.


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26.05.2006