Aus der Klinik für Innere Medizin mit Schwerpunkt
Hämatologie und Onkologie
der Medizinischen Fakultät Charitè – Universitätsmedizin Berlin

DISSERTATION

In vivo- und in vitro-Komplementaktivierung durch den monoklonalen CD20-Antikörper Rituximab bei der Behandlung von
Non-Hodgkin-Lymphomen

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charitè – Universitätsmedizin Berlin

von


Christian Gerecke

aus der Hansestadt Stralsund

Gutachter:
1. Prof. Dr. med. D. Huhn
2. Prof. Dr. med. U.W. Knauf
3. Prof. Dr. med. E. Thiel

Datum der Promotion: 27.06.2006

I

In Gedenken an meine Großmutter
Johanna Bielenberg

Inhaltsverzeichnis

• 1. Einleitung
  • 1.1 Non-Hodgkin-Lymphome
  • 1.2 Die Klassifikation der Non-Hodgkin-Lymphome
  • 1.3 Gegenwärtiger Kenntnisstand bei der Behandlung der Non-Hodgkin-Lymphome
  • 1.4 Immunologische Therapiestrategien in der Behandlung von Lymphomen
  • 1.5 Das CD20-Oberflächenantigen als Ziel einer Immuntherapie
  • 1.6 Rituximab – Struktur und Bedeutung in der Therapie
  • 1.7 Das Komplementsystem
  • 1.8 Zielsetzung
• 2. Material und Methoden
  • 2.1 Reagenzien
  • 2.2 Geräte
  • 2.3 Patienten
  • 2.4 Zellkultur
  • 2.5 Zellzählung
  • 2.6 MTT-Proliferationsassay
  • 2.7 Der Komplement C3a-desArg-ELISA
  • 2.8 Statistik
• 3. Ergebnisse
  • 3.1 Einfluss von Rituximab auf das Wachstum humaner B-Zellinien
  • 3.2 Komplementassoziierte Wachstumsinhibition von Rituximab
  • 3.3 Rituximab-induzierte Komplementaktivierung in vivo
• 4. Diskussion
  • 4.1 Rituximab – Effekt auf das Wachstumsverhalten humaner  B-Zellinien
  • 4.2 Einfluss des Komplements auf den wachstumsinhibitorischen Effekt von Rituximab
  • 4.3 Aktivierung des Komplementsystems bei Patienten mit niedrig malignen NHL
• 5. Zusammenfassung
• 6. Abkürzungsverzeichnis
• 7. Literaturverzeichnis
• Eidesstattliche Erklärung
• Danksagung

Tabellen

• Tabelle 1: Patientenkollektiv. Die Diagnosestellung erfolgte nach den Kriterien der WHO Klassifikation [20]. Die Stadieneinteilung für die Patienten mit B-CLL erfolgte nach der Binet-Klassifikation. Für alle anderen Patienten wurde das Stadium nach der Ann Arbor Klassifikation festgelegt.
• Tab.1: Kontrollgruppe
• Tab. 2: Patientengruppe
• Tab. 3: Vergleich der C3a-desArg-Konzentration vor Rituximabgabe mit der Kontrollgruppe

Bilder

• Abb. 1: Darstellung eines CD20 Oberflächenantigen auf B- Lymphozyten
• Abb. 2 Wirkungsweise von Rituximab
• Abbildung 1A : Einfluss von Rituximab auf das Wachstumsverhalten humaner B-Zellinien. DOHH-2-Zellen in einer Konzentration von 2 x 10⁵ Zellen/ml wurden mit unterschiedlichen Rituximabkonzentrationen, (100 ng/ml, 1 µg/ml, 10 µg/ml) bei 37°C über einen Zeitraum von 72 Stunden inkubiert. Die Zellproliferation wurde mittels MTT-Assay bestimmt. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardabweichungen von drei unabhängigen Experimenten.
• Abbildung 1B: Einfluss von Rituximab auf das Wachstumsverhalten humaner B-Zellinien. DAUDI-Zellen in einer Konzentration von 2 x 10⁵ Zellen/ml wurden mit unterschiedlichen Rituximabkonzentrationen, (100 ng/ml,
• Abbildung 1C: Einfluss von Rituximab auf das Wachstumsverhalten humaner B-Zellinien. Granta-519-Zellen in einer Konzentration von 2 x 10⁵ Zellen/ml wurden mit unterschiedlichen Rituximabkonzentrationen, (100 ng/ml, 1 µg/ml, 10 µg/ml) bei 37°C über einen Zeitraum von 72 Stunden inkubiert. Die Zellproliferation wurde mittels MTT-Assay bestimmt. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardabweichungen von drei unabhängigen Experimenten.
• Abbildung 1D: Einfluss von Rituximab auf das Wachstumsverhalten humaner B-Zellinien. Raji-Zellen in einer Konzentration von 2 x 10⁵ Zellen/ml wurden mit unterschiedlichen Rituximabkonzentrationen, (100 ng/ml,  1 µg/ml, 10 µg/ml) bei 37°C über einen Zeitraum von 72 Stunden inkubiert. Die Zellproliferation wurde mittels MTT-Assay bestimmt. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardabweichungen von drei unabhängigen Experimenten.
• Abbildung 1E: Einfluss von Rituximab auf das Wachstumsverhalten humaner B-Zellinien. Bonna-12-Zellen in einer Konzentration von 2 x 10⁵ Zellen/ml wurden mit unterschiedlichen Rituximabkonzentrationen, (100 ng/ml, 1 µg/ml, 10 µg/ml) bei 37°C über einen Zeitraum von 72 Stunden inkubiert. Die Zellproliferation wurde mittels MTT-Assay bestimmt. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardabweichungen von drei unabhängigen Experimenten.
• Abbildung 1F: Einfluss von Rituximab auf das Wachstumsverhalten humaner B-Zellinien. JVM-2-Zellen in einer Konzentration von 2 x 10⁵ Zellen/ml wurden mit unterschiedlichen Rituximabkonzentrationen, (100 ng/ml,  1 µg/ml, 10 µg/ml) bei 37°C über einen Zeitraum von 72 Stunden inkubiert. Die Zellproliferation wurde mittels MTT-Assay bestimmt. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardabweichungen von drei unabhängigen Experimenten.
• Abbildung 2: Einfluss von Rituximab auf das Wachstumsverhalten humaner B-Zellinien. Vier verschiedene humane B-Zellinien in einer Konzentration von 2 x 10⁵ Zellen/ml wurden mit einer Antikörperkonzentration von 1 µg/ml inkubiert. Die Inkubation erfolgte bei 37°C über einen Zeitraum von 72 Stunden. Die Zellproliferation wurde mittels MTT-Assay bestimmt. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardabweichungen von drei unabhängigen Experimenten.
• Abbildung 3: Komplement-vermittelte Wachstumshemmung durch Rituximab. DOHH-2-Zellen in einer Konzentration von 2 x 10⁵ Zellen/ml wurden mit 1 µg/ml Rituximab und 100 µl/ml hitzeinaktiviertem (•) oder intaktem humanem Komplement (o) über einen Zeitraum von 72 Stunden inkubiert. Die Zellproliferation wurde mittels MTT-Assay bestimmt. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardabweichungen von unabhängigen Experimenten.
• Abbildung 4: Komplement-vermittelte Wachstumshemmung durch Rituximab. DAUDI-Zellen in einer Konzentration von 2 x 10⁵ Zellen/ml wurden mit 1 µg/ml Rituximab und 100 µl/ml hitzeinaktiviertem (•) oder intaktem humanem Komplement (o) über einen Zeitraum von 72 Stunden inkubiert. Die Zellproliferation wurde mittels MTT-Assay bestimmt. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardabweichungen von unabhängigen Experimenten.
• Abbildung 5: Komplement-vermittelte Wachstumshemmung durch Rituximab. JVM-2-Zellen in einer Konzentration von 2 x 10⁵ Zellen/ml wurden mit 1 µg/ml Rituximab und 100 µl/ml hitzeinaktiviertem (•) oder intaktem humanem Komplement (o) über einen Zeitraum von 72 Stunden inkubiert. Die Zellproliferation wurde mittels MTT-Assay bestimmt. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardabweichungen von unabhängigen Experimenten.
• Abbildung 6: Komplement-vermittelte Wachstumshemmung durch Rituximab. Raji-Zellen in einer Konzentration von 2 x 10⁵ Zellen/ml wurden mit 1 µg/ml Rituximab und 100 µl/ml hitzeinaktiviertem (•) oder intaktem humanem Komplement (o) über einen Zeitraum von 72 Stunden inkubiert. Die Zellproliferation wurde mittels MTT-Assay bestimmt. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardabweichungen von unabhängigen Experimenten.
• Abbildung 8: In vivo- Komplementaktivierung durch Rituximab bei Patienten mit B-CLL. Beginn der Rituximab-Infusion zur Zeit = 0h. Die Messungen bei den Patienten 2 und 4 erfolgte zum Zeitpunkt 0h, 1h, 2h, 4h, bei  Pat. 1 und 3 auch bei 6h, 9h, und 24h. Dargestellt ist der C3a-desArg Plasmakonzentrationsverlauf über 24h.
• Abbildung 9: In vivo- Komplementaktivierung durch Rituximab bei Patienten mit einem follikulären Lymphom Grad II°-III°. Beginn der Rituximab-Infusion zur Zeit = 0h. Die Messungen erfolgten zum Zeitpunkt 0h, 1h, 2h, 4h, 6h, 9h und 24h. Dargestellt ist der C3a-desArg Plasmakonzentrationsverlauf über 24h.
• Abbildung 10: In vivo- Komplementaktivierung durch Rituximab bei einem Patienten mit einem Mantelzellymphom. Beginn der Rituximab-Infusion erfolgte zur Zeit = 0h. Die Messungen erfolgten zum Zeitpunkt 0h, 1h, 2h, 4h, 6h, 9h und 24h. Dargestellt ist der mittlere C3a-desArg Plasmakonzentrationsverlauf über 24h.