2. Material und Methoden

Untersucht wurden Patienten aus dem Universitätsklinikum Charitè, Campus Virchow Klinikum, Abteilung für Hämatologie und Onkologie (Leiter: Prof. Dr. D. Huhn) und aus dem Klinikum Hansestadt Stralsund, Lehrkrankenhaus der Universität Greifswald, Abteilung für Hämatologie und Onkologie (Leiter: Prof. Dr. T. H. Ittel).

Das Kollektiv bestand aus zehn Patienten mit unterschiedlichen Non-Hodgkin-Lymphomen, die mit Rituximab behandelt wurden. Bei allen Patienten befand sich die Erkrankung in einem fortgeschrittenen Stadium.

Die Patienten aus dem Virchow-Klinikum bekamen Rituximab als Monotherapie, wobei die meisten Patienten vorher schon einmal mit Chemotherapie behandelt wurden. Die insgesamt acht Patienten aus dem Virchow-Klinikum erhielten die erste Rituximab-Gabe mit 375 mg/m² als Einzelgabe. Allen Patienten wurden vier Gaben in wöchentlichem Abstand verabreicht. Patienten mit einer chronischen lymphatischen Leukämie vom B-Zelltyp (B-CLL) erhielten zudem eine Erhaltungstherapie mit 100 mg Rituximab in zweiwöchigen Abständen.

Die beiden Patienten aus dem Klinikum Stralsund wurden innerhalb einer Studie der ostdeutschen Lymphomstudiengruppe mit einer Kombination aus Chemotherapie bestehend aus Mitoxantron, Cyclophosphamid, Prednison und Rituximab behandelt. Für beide Patienten war es die erste Therapie nach Diagnosestellung. Auch sie bekamen Rituximab in der Dosierung

375 mg/m², jedoch in vierwöchigem Abstand und in Kombination mit der Chemotherapie.

Allen Patienten wurde unmittelbar vor der Therapie und jeweils nach 1h, 2h, 4h, 6h, 9h und 24h Blut aus einer Armvene entnommen und sofort weiterverarbeitet.

Tabelle 1: Patientenkollektiv. Die Diagnosestellung erfolgte nach den Kriterien der WHO Klassifikation [20]. Die Stadieneinteilung für die Patienten mit B-CLL erfolgte nach der Binet-Klassifikation. Für alle anderen Patienten wurde das Stadium nach der Ann Arbor Klassifikation festgelegt.

Für die in vitro-Versuche wurden sechs verschiedene Zellinien verwendet. Alle Zelllinien stammten aus der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH in Braunschweig.

Zellinie Raji: Diese Zellinie wurde 1963 aus einem Burkitt-Lymphom eines 11 Jahre alten afrikanischen Jungen isoliert.

Zellinie DOHH-2: Die Zellinie entspricht einem follikulären Lymphom (FL), isoliert 1990 bei einem 60 Jahre alten Mann.

Zellinie DAUDI: Diese Zellinie wurde 1967 bei einem 16-jährigen Jungen mit Burkitt-Lymphom isoliert.

Zellinie JVM-2: Isoliert aus dem Blut einer 67 Jahre alten Frau mit B-Prolymphoblastischer Leukämie (PLL).

Zellinie Bonna-12: Diese Zellinie stammt aus der Milz eines 46-jährigen Mannes mit Haarzell-Leukämie (HCL) und wurde im Jahre 1988 isoliert.

Zellinie Granta-519:Isoliert aus einem hochmalignen Lymphom einer 58-jährigen Frau (DLCL).

Alle Zellinien sind Suspensionszellinien, die entweder alleine oder in Clustern wachsen. Die Zellen wurden in Zellkulturflaschen kultiviert und wuchsen unter aseptischen Bedingungen bei 37^o C und 5% CO₂ im Inkubator. Die Zellen wurden in expotentiellen Wachstum gehalten und alle zwei Tage auf eine Konzentration von 2 x 10⁵ Zellen/ml umgesetzt. Kontrollen und Rituximab-enthaltende Versuchsansätze wurden in gleicher Zusammensetzung mit RMPI und zehn Prozent FCS, 2,5 Prozent Penicillin, 2,5 Prozent Streptomycin, zehn Prozent humanem Komplement, sowie 2 x 10⁵ Zellen/ml zum selben Zeitpunkt angesetzt. Alle sechs Zellinien lagen in einer Konzentration von 2 x10⁵ Zellen/ml vor und wurden mit 100 µl/ml humanem Komplement und dem monoklonalen Antikörper Rituximab jeweils in der Konzentration 100 ng/ml, 1 µg/ml und 10 µg/ml über einen Zeitraum von 72 Stunden inkubiert. Nach 24, 48 und 72 Stunden erfolgte jeweils die Bestimmung der Zellproliferation.

Die Bestimmung der Zellzahl erfolgte durch Anfärbung der Zellen mit 0,5-prozentigem Trypanblau. Trypanblau ist ein saurer Farbstoff, der als Anion sehr leicht an Proteine binden kann. Bei der Trypanblaufärbung werden lebende Zellen, deren Membran noch intakt ist nicht angefärbt, während tote Zellen durchgängig angefärbt werden. Die Auszählung erfolgte mit einer Neubauer-Zählkammer, welche aus vier großen Quadranten besteht. Jedes dieser Quadrate hat eine Fläche von 1mm² und eine Tiefe von 0,1mm. Mit einem Lichtmikroskop erfolgte bei 40-facher Vergrößerung die Auszählung der vier Quadranten.

Der MTT-Proliferationsassay wurde 1983 von Mosmann beschrieben [76]. Dabei wird die Aktivität mitochondrialer Dehydrogenasen von lebenden Zellen bestimmt. Dieser Prozess ist unabhängig davon, ob die Zellen momentan DNA synthetisieren oder nicht. Das Tetrazoliumbromid MTT (3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromid) dringt in die Zellen ein, dabei wird sein Ring durch mitochondriale Dehydrogenasen aufgebrochen und das MTT zu Formazan reduziert. Das alkohollösliche Formazan bildet einen dunkelblauen kristallinen Niederschlag.

Durch Zugabe von HCl-Isopropanol werden die Zellen aufgebrochen und das Formazan in Lösung gebracht. Durch Messung der Extinktion in einem Photometer können Rückschlüsse auf das Wachstumsverhalten der Zellen gezogen werden.

Die Messungen erfolgten in 96 Loch-Zellkulturplatten jeweils in Form von Quinduplikaten. Jedes Loch wurde mit 10 µl MTT-Lösung in einer Konzentration von 5 mg/ml befüllt. Anschließend wurden 90 µl Zellsuspension der entsprechenden Versuchsansätze zugesetzt. Alle Versuchsansätze wurden zum gleichen Zeitpunkt angesetzt. Die Inkubation erfolgte bei 37°C und fünf Prozent CO₂ über einen Zeitraum von 72 Stunden. Messzeitpunkt war jeweils nach 24, 48 und nach 72 Stunden. Die Messung erfolgte spektrophotometrisch bei einer Wellenlänge von 540 nm und einer Referenzwellenlänge von 690 nm. Die gemessene Extinktion korreliert dabei mit der Anzahl vitaler Zellen.

Dem Prinzip dieser Methode liegt der enzymgekoppelte Immunadsorptionstest (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) zu Grunde. Dieser zeichnet sich dadurch aus, dass ein Enzym chemisch mit einem Antikörper oder Antigen gekoppelt wird. Dabei wird die unmarkierte Komponente an einen festen Träger gebunden. Dies können zum Beispiel Vertiefungen in einer Mikrotiterplatte sein, welche Proteine in gewissem Maße adsorbiert. Bei den meisten heute durchgeführten ELISA’s bindet man das Antigen an die Platte und testet die Anlagerung des markierten Antikörpers. Die Antikörperbindung wird dann mit Hilfe einer enzymatischen Reaktion, die ein farbloses Substrat in ein farbiges Produkt umwandelt, dargestellt. Schließlich wird die Extinktion mit einem Photometer (ELISA-READER) bestimmt [4].

Sowohl der klassische Weg als auch der alternative Weg der Komplementaktivierung münden zusammen in der Bildung einer C3-Konvertase. Diese spaltet die Komponente C3 in die kleine C3a-Untereinheit und in die große C3b-Einheit. C3a ist im Serum nur kurzlebig und wird rasch in das stabilere C3a-desArg überführt [83]. Lange Zeit stellte der selektive Nachweis des Komplementfaktors C3a bzw. C3a-desArg durch monoklonale Antikörper ein Problem da. Dies lag zum einen an der geringen Größe von C3a, zum anderen konnten andere Faktoren wie C5a oder C5 nicht sicher abgetrennt werden. Burger et al. stellten 1987 einen ELISA vor, der mit Hilfe des monoklonalen Antikörpers H13 die Komplementfaktoren C3a und C3a-desArg selektiv nachweisen kann [81].

Um die Rituximab-induzierte Komplementaktivierung in vivo zu untersuchen, wurde bei zehn Patienten mit unterschiedlichen NHL der Verlauf der C3a-desArg-Konzentzration vor, während und nach einer Infusion mit Rituximab gemessen. Als Kontrollgruppe diente die Plasmakonzentration von C3a-desArg bei 21 gesunden Probanden.

Die Blutentnahmen erfolgten jeweils vor Rituximabgabe (0h), 1h, 2h, 4h, 9h und nach 24 Stunden. Die Blutproben wurden in einem Na-EDTA Röhrchen abgenommen und sofort nach der Entnahme bei 3000g und 2-8^oC 15 min zentrifugiert und dann bei -20°C gelagert.

Für alle Versuche wurde der C3a-Enzymimmunoassay der Firma Progen Biotech (Deutschland), der mit Hilfe von monoklonalen Antikörpern hochselektiv die Komplementkomponente C3a-desArg bestimmt, benutzt. In einem ersten Schritt erfolgte eine 1:100-Verdünnung des Patientenplasmas. In einem zweiten Schritt erfolgte die Inkubation bei Raumtemperatur in speziellen Mikrotiterstreifen, welche mit einem monoklonalen Antikörper für C3a-desArg beschichtet waren. Nach dem Auswaschen des nicht gebundenen Nativ-C3 erfolgte der C3a-Nachweis mit einem weiteren monoklonalen Antikörper, der mit Peroxidase markiert war. Das überflüssige Peroxidase-Konjugat wurde in einem weiteren Waschschritt entfernt. Anschließend erfolgte die Substratinkubation mit 1, 3, 5-Trinitrobenzen. Nach 15 min wurde die ablaufende Peroxidasereaktion durch 1 N Salzsäure beendet. Die in diesem Zeitraum umgesetzte Substratmenge ist proportional zur Menge an C3a-desArg und anhand der optischen Dichte quantifizierbar. Die Messung der optischen Dichte (OD) erfolgte in einem Mikrotiterplatten-Photometer bei 450 nm Messwellenlänge und 550 nm Referenzwellenlänge. Die OD-Werte für die C3a-desArg-Standards wurden in ein Auswertschema eingetragen. Über die gemessenen OD-Werte konnte der C3a-desArg Gehalt direkt aus der Eichkurve extrapoliert werden.

Um zu überprüfen, ob die Ergebnisse einer wissenschaftlichen Untersuchung zufällig sind oder nicht, bieten sich unzählige statistische Testverfahren an. Um ein geeignetes Verfahren auszuwählen ist es nötig, die Fragestellung der Untersuchung, das Untersuchungsdesign (Anzahl der Stichproben), das Niveau der erhobenen Daten, die Stichprobengröße und die Annahme zur Verteilung zu beachten. Unter Berücksichtigung dieser Aspekte wurden die entsprechenden Verfahren für die vorliegenden Daten ausgewählt und angewandt. Diese werden nachfolgend kurz erläutert.

Um die aus den Untersuchungen gewonnenen Daten einer statistischen Auswertung zu unterziehen, wurden nonparametrische Verfahren genutzt. Diese werden auch als verteilungsfreie Testverfahren bezeichnet und setzen keine bestimmten Verteilungsmodelle in der Stichprobe (und der Grundgesamtheit) voraus. Dies ist in diesem Fall angezeigt, da nicht von einem bestimmten Verteilungsmodell ausgegangen werden kann. Des Weiteren handelt es sich um ausgesprochen kleine Stichproben, die einer besonderen, diesem Umstand angemessenen Auswertung bedürfen.

Die Untersuchung bestand zum einen aus einem Vergleich der C3a-desArg-Konzentration zwischen der Patientengruppe und einer Kontrollgruppe vor Gabe von Rituximab mit Hilfe des Fisher-Pitmans-Randomisierungstestfür zwei unabhängige Stichproben.

Nachfolgend wurde der Patientengruppe Rituximab verabreicht und in Abständen von 0,5, 1, 2, 4, 6, 9 und 24 Stunden die C3a-desArg-Konzentration gemessen. Diese Messwerte sollten mit denen, die vor der Gabe von Rituximab erhoben wurden, verglichen werden. Dazu wurde Fishers Randomisierungstest für abhängige Stichproben genutzt.

Beide Testverfahren gehören zu den Randomisierungstests, die davon ausgehen, dass es sich bei der Stichprobe um ein Abbild der zugehörigen Populationen handelt. Sie werden aufgrund dessen auch als "bedingte" Tests bezeichnet [3]. Für jeden Test werden somit individuelle Prüfverteilungen und somit auch individuelle Prüfgrößen ermittelt, da einer Tabellierung von Prüfgrößen, wie sie bei parametrischen Verfahren üblich sind, nicht möglich ist.

Im ersten Teil der Untersuchung sollte gezeigt werden, ob zwischen der Kontroll- und der Patientengruppe ein signifikanter Unterschied hinsichtlich der C3a-desArg-Konzentration zum Zeitpunkt 0 h (vor Verabreichung von Rituximab) besteht. Dazu wurde der Fisher-Pitmans-Randomisierungstestfür zwei unabhängige Stichproben genutzt [3]. Mit diesem Test prüft man, ob beide Stichproben, deren Daten auf metrischem Niveau vorliegen, aus derselben Population stammen. Neben der Anwendbarkeit ohne Verteilungsbedingung und bei kleinen Stichproben hat dieses Testverfahren noch einen weiteren Vorteil: Es ist auch bei deutlich unterschiedlichen Stichprobengrößen wie in diesem Fall effizient.

Im weiteren Verlauf sollte untersucht werden, ob sich durch die Gabe von Rituximab in der Patientengruppe die C3a-desArg-Konzentration signifikant erhöht.

Dazu war es nötig, die C3a-desArg-Konzentration zum Zeitpunkt 0h mit der Konzentration zu jedem weiteren Messzeitpunkt zu vergleichen. Die Prüfung auf Signifikanz erfolgte mit Hilfe von Fishers Randomisierungstest für zwei abhängige Stichproben [3]. Dieses nonparametrische Testverfahren für metrische Daten bietet sich insbesondere für kleine Stichproben an. Ein Testverfahren für abhängige Stichproben wird immer dann angewandt, wenn Messwerte derselben Personen zu zwei verschiedenen Zeitpunkten bzw. unter zwei verschiedenen Bedingungen verglichen werden sollen. In diesem Fall handelt es sich um einen Vergleich der Konzentration vor und zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Behandlung.