4. Diskussion

In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass der monoklonale Antikörper Rituximab unterschiedliche Auswirkungen auf das Wachstum humaner B-Zellinien hat. Insgesamt wurden sechs verschiedene humane B-Zellinien untersucht. Alle Zelllinien sind für das CD20-Oberflächenantigen positiv und entsprechen einer bestimmten Lymphomentität.

Eine besonders starke Inhibition der Proliferation konnte bei der Zellinie DOHH-2 beobachtet werden. Diese Zellinie wurde 1990 aus dem follikulären Lymphom (FL) eines 60-jährigen Mannes isoliert. In der Antikörperkonzentration 1 µg/ml betrug der wachstumshemmende Einfluss nach drei Tagen Inkubation 80 Prozent.

In vitro-Versuche mit humanen B-NHL-Zellinien wurden auch von anderen Arbeitsgruppen durchgeführt: Die Arbeitsgruppe um Schmidt-Wolf untersuchte unter anderem die Lymphomzellinie SU-DHL-4 (FL). Dabei betrug die Wachstumsinhibition der Zellinie durch 1 µg/ml Rituximab 82 Prozent ± 25 Prozent [85].

Bei den Lymphomzellinien DAUDI und Raji ließ sich ein unterschiedlicher Effekt von Rituximab auf das Wachstum der Zellen beobachten. Beide Zellinien stammen ursprünglich von Patienten mit einem Burkitt-Lymphom ab, welches zu den hochmalignen NHL gerechnet wird.

Durch Zugabe von 1µg/ml Rituximab konnte bei der Zellinie DAUDI eine 25-30-prozentige Wachstumsinhibition nach zwei Tagen Inkubation beobachtet werden. Bei der Zellinie Raji konnte nach drei Tagen Inkubation mit derselben Konzentration des Antikörpers kein Effekt ausgelöst werden. Die Arbeitsgruppe um Shan führte ebenfalls Versuche mit drei verschiedenen Burkitt-Zellinien (Ramos, DAUDI, Raji) durch. Dabei konnte durch die monoklonalen CD20-Antikörper 1F5 und B1 eine Proliferationsinhibition von 53 Prozent an den neoplastischen

B-Zellinien nachgewiesen werden [52]. Zuvor hatten auch Maloney, Smith und Appelbaum einen antiproliferativen Effekt mit verschiedenen monoklonalen CD20-Antikörpern und verschiedenen humanen B-Zellinien (Ramos, Raji, DHL-4, FL-18) beschrieben [57].

Die Arbeitsgruppe um Schmidt-Wolf konnte bei der Lymphomzellinie DAUDI eine Wachstumsinhibition durch Rituximab von 25 Prozent beobachten, was den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit entspricht. Der Einfluss von Rituximab auf das Wachstumsverhalten der Zellinie Raji lag bei 26 Prozent [85]. Dies konnte in den Ergebnissen dieser Arbeit nicht gezeigt werden.

Bei den Zellinien Granta-519 (Mantelzell-Lymphom = MCL) und Raji (Burkitt-Lymphom), konnte kein Effekt durch den monoklonalen Antikörper beobachtet werden.

Ähnliche Ergebnisse konnte eine japanische Arbeitsgruppe zeigen, welche den Antikörper Rituximab ebenfalls an verschiedenen Lymphomzellinien untersuchte: An zwei Zellinien (FL) konnte eine starke Wachstumsinhibition beobachtet werden, an zwei anderen Zellinien (MCL und DLCL) konnte nur eine geringe Inhibition der Proliferation beschrieben werden [87]. Bei den beiden Zellinien Bonna-12 (Haarzell-Leukämie) und JVM-2 (Prolymphoblastische Leukämie = PLL) konnte ebenfalls kein spezifischer Effekt von Rituximab nachgewiesen werden. Flieger et al. beschrieben vergleichbare Untersuchungen mit der Zellinie JVM-13 (PLL). Auch hier konnte in Bezug auf die Wachstumsinhibition durch Rituximab kein direkter zytotoxischer Effekt gezeigt werden [85].

Die Arbeitsgruppe um Emil Montserat untersuchte den Einfluss von Rituximab auf Haarzell-Leukämiezellen in vitro. Dabei konnte kein Effekt auf das Wachstum von HCL-Zellen beobachtet werden [88].

In vitro-Untersuchungen mit Rituximab an Haarzell-Leukämiezellen wurden in der Literatur bisher selten beschrieben, so dass ein Vergleich mit den Ergebnissen dieser Arbeit keine relevanten Schlussfolgerungen zulässt. In mehreren klinischen Studien wurde jedoch der Effekt von Rituximab an Patienten mit fortgeschrittener HCL untersucht. Dabei konnten Ansprechraten von bis zu 50 Prozent beobachtet werden [88, 90, 91, 92].

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Rituximab in vitro eine unterschiedliche Wirksamkeit bei unterschiedlichen Lymphomzellinien aufweist. Da alle sechs Zellinien das CD20-Oberflächenantigen auf ihrer Oberfläche exprimieren, muss die Ursache des differenzierten Effektes in zelltypischen Strukturen begründet sein. Diskutiert wird außerdem eine unterschiedlich starke CD20-Expression auf den B-Lymphozyten bzw. eine unterschiedlich starke Bindung an das CD20-Oberflächenantigen, welche die Wirkung von Rituximab abschwächen könnte.

Einige Arbeitsgruppen postulieren, dass es weder einen Zusammenhang zwischen der Antigenexpression, noch der Antigenbindungskapazität und der Wachstumsinhibition humaner B-NHL-Zellinien durch Rituximab gibt [96, 99]. So wurde interessanterweise bei Patienten, die eine CR ihrer Erkrankung nach Behandlung mit Rituximab zeigten, zuvor eine niedrigere CD20-Expression gemessen, als bei Patienten, die nur partiell ansprachen [99]. Taji et al. konnten in Ihren Versuchen zeigen, dass das CD20-Oberflächenantigen zwar wichtig, aber nicht allein ausschlaggebend für die Wachstumsinhibition durch Rituximab ist [87]. Dafür untersuchten sie die Wachstumsinhibition durch Rituximab bei sechs verschiedenen B-Zellinien mit unterschiedlich starker CD20-Expression. Vier Zellinien mit starker CD20-Expression zeigten eine signifikante Wachstumsinhibition, bei den anderen beiden Zellinien mit geringerer Expression von CD20 konnte keine Wachstumshemmung beobachtet werden. Bei den vier Zellinien mit starker CD20-Expression zeigte eine Zellinie, trotz höherer CD20-Expression, eine geringere Wachstumsinhibition als zwei andere Zellinien [87].

Das Komplementsystem spielt als Teil der unspezifischen Immunantwort eine große Rolle bei der Bekämpfung körperfremder Stoffe. Als ein möglicher Wirkungsmechanismus von Rituximab wird die Komplement-vermittelte Zytotoxizität (CDC) angenommen. In der vorliegenden Arbeit wurden vier humane Lymphomzellinien auf eine Komplement-vermittelte Zytotoxizität durch Rituximab untersucht. Dabei wurde humanes Komplement verwendet. Bei zwei der Zellinien konnte der antiproliferative Effekt von Rituximab verstärkt werden. Bei der Zellinie DAUDI konnte eine starke Inhibition der Proliferation durch humanes Komplement beobachtet werden. Die maximale Wachstumshemmung durch 1µg/ml Rituximab lag in Anwesenheit von humanem Komplement bei 65 Prozent. Durch die alleinige Zugabe des Antikörpers konnte kein Effekt beobachtet werden.

Bei der Zellinie DOHH-2 konnte der antiproliferative Effekt von Rituximab weiter verstärkt werden. Während ohne Komplement nur eine maximale Wachstumsinhibition von 30 Prozent erreicht werden konnte, betrug der antiproliferative Effekt in Anwesenheit von humanem Komplement 56 Prozent. Bei den Zellinien Raji und JVM-2 konnte kein Effekt nachgewiesen werden. Der deutliche Effekt, der bei den Zellinien DAUDI und DOHH-2 beobachtet werden konnte, spricht für eine Beteiligung des Komplementsystems an der durch Rituximab vermittelten Wirkung. Mehrere Studien belegen die Bindung des Komplementfaktors C1q an den Fc-Teil der IgG1-Untereinheit von Rituximab und somit eine Aktivierung des Komplementsystems [56, 93, 96, 101].

Am Verlauf der Komplementaktivierung sind zudem weitere Faktoren beteiligt. Ein Grund für das verschiedenartige Ansprechen der Zellinien könnte eine unterschiedlich starke Expression von CD55 und CD59 auf den Zielzellen sein. Beide Oberflächenantigene sind Regulatorproteine des Komplementsystems. Sie befinden sich auf allen hämatopoetischen und nichthämatopoetischen Zellen und spielen eine entscheidende Rolle bei der Steuerung des Komplementsystems [94]. CD55, auch decay accelerating factor (DAF) genannt, inhibiert die C3/C5-Konvertase, welche für die weitere Aktivierung des Komplementsystems von großer Bedeutung ist [95]. Die vollständige Aktivierung des Komplementsystems endet im Membranangriffskomplex (MAC), der aus den Faktoren C5b, C6, C7, C8 und C9 gebildet wird. Dieser ist in der Lage – wahrscheinlich über die Aufhebung des osmotischen Gleichgewichtes – die Zielzelle zu lysieren. CD59 verhindert durch Anlagerung an C8 und C9 die endgültige Zusammenlagerung des MAC und damit die Zerstörung der Zielzelle [4].

Harjunpää et al. veröffentlichten im Jahr 2000 eine Arbeit, in der die Blockierung von CD55 und CD59 auf zwei Lymphomzellinien zu einer starken Zunahme der CDC-vermittelten Wachstumshemmung durch Rituximab führte [82]. Dabei lag die Inhibition der Proliferation durch Rituximab und Komplement auf die Zellinie Raji bei 16 Prozent, und auf die Zellinie HF-1.3.4. (FL) bei 48 Prozent, was den Ergebnissen dieser Arbeit entspricht. Durch Zugabe eines Antikörpers gegen CD59 konnte der Effekt auf 80 Prozent gesteigert werden. Diese Ergebnisse werden durch zwei weitere Publikationen bestätigt, in denen ebenfalls humane B-Zellinien auf die CDC-induzierte Wachstumsinhibition durch Rituximab untersucht wurden. Golay et al. konnten bestätigen, dass die Expression von CD55, aber auch die von CD59 auf den Zielzellen wichtig ist für die Komplement-vermittelte Lyse [96]. Treon et al. untersuchten in vitro die Expression von CD20, CD46, CD55 und CD59 in verschiedenen NHL und Multiples Myelom-Zellinien auf eine CDC, induziert durch Rituximab. Sie fanden heraus, dass in den Zellinien, in denen das CD59-Oberflächenantigen nur schwach oder gar nicht exprimiert wurde, der Effekt der Komplement-vermittelten Lyse durch Rituximab um ein Vielfaches stärker war [97].

In einer klinischen Studie wurde untersucht, ob eventuell CD55 und CD59 für die Resistenz von B-CLL-Zellen gegenüber Rituximab verantwortlich sind. Dabei konnte keine signifikante Korrelation zwischen der CD55- und CD59-Expression und der Ansprechrate auf die Rituximab-Therapie gefunden werden. Jedoch wurde bei Patienten, bei denen es zu keiner Reduktion von B-CLL-Zellen im Blut kam, eine höhere Genexpression gemessen als bei Patienten bei denen es zu einem deutlichen Abfall der B-CLL-Zellen im Blut kam [98]. Diese Hypothese konnten Weng und Levy nicht bestätigen. Sie untersuchten 29 Patienten mit follikulärem Lymphom auf einen Zusammenhang zwischen der Genexpression von CD46, CD55 und CD59 und dem Ansprechen auf Rituximab. Es gab keinen signifikanten Zusammenhang zwischen der Expression der drei Komplementinhibitoren und der klinischen Ansprechrate unter Rituximab. Die CD59-Expression war zwar bei Patienten mit CR niedriger, jedoch war die Expression von CD46 und CD55 höher als bei Patienten mit PR [99].

Auch Bellosillo et al. untersuchten in vitro den Effekt von Rituximab bei 55 Patienten mit

B-Zell-lymphoproliferativen Erkrankungen (B-CLL, FL, MCL HZL) auf eine CDC-vermittelte Wachstumsinhibition. Dabei konnte alleinig durch den Antikörper kein Effekt beobachtet werden. In Anwesenheit von humanem Komplement konnte bei 31 von 55 Patienten

(56 Prozent) eine Rituximab-induzierte CDC beobachtet werden [89].

Die Ergebnisse sprechen zwar für eine Beteiligung des Komplementsystems, zeigen jedoch auch, dass es neben der Komplement-vermittelten Lyse weitere Komplement-unabhängige Mechanismen geben muss. Dabei spielt vermutlich die Apoptose – der natürliche Zelltod – eine wichtige Rolle. Verschiedene Arbeitsgruppen untersuchten in vitro den Aspekt der Apoptose-induzierten Wirkung von Rituximab [52, 100]. Es konnte gezeigt werden, dass Rituximab Apoptose induzieren kann, jedoch waren die apoptotischen Effekte unterschiedlich stark ausgeprägt [52, 57, 82, 87, 96, 100].

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass es in allen vier Zellinien zu einer unterschiedlich starken Aktivierung des Komplementsystems gekommen ist. Bei zwei von vier Zellinien konnte der monoklonale Antikörper Rituximab eine Komplement-vermittelte Zytotoxizität induzieren.

Um der Frage nach einer Komplementaktivierung durch Rituximab weiter nachzugehen, wurde in vivo die C3des-Arg-Plasmakonzentration bei zehn Patienten mit niedrigmalignen NHL unterschiedlicher Entität untersucht. Das Patientenkollektiv bestand aus Männern und Frauen im Alter zwischen 50 und 72 Jahren (Tabelle 2). Dabei lag die C3a-desArg-Konzentration bei den Patienten mit NHL schon vor der Rituximab-Infusion signifikant (p = 0,05) höher als in der Kontrollgruppe (Tabelle 3). Diese Beobachtung bestätigt eine Studie, welche die Konzentration von verschiedenen Komplementkomponenten bei Patienten mit unterschiedlichen hämatologischen Erkrankungen untersuchte. Dabei fand sich eine erhöhte Konzentration von C3a bei Patienten mit NHL, Morbus Hodgkin und akuter Leukämie [84].

Bei den in vivo untersuchten Patienten konnte ein deutlicher Anstieg der C3a-desArg-Konzentration während der Rituximab-Infusion beobachtet werden. Bei drei von vier Patienten mit B-CLL kam es zu einem Komplementanstieg innerhalb von 24 Stunden (Abb. 8) Die C3a-desArg-Konzentration war gegenüber der Kontrollgruppe um das sechsfache erhöht. Bei den Patienten mit FL war der Verlauf der C3a-desArg-Konzentration uneinheitlich. Während bei zwei von fünf Patienten ein starker Anstieg von C3a-desArg im Plasma unter Rituximab zu beobachten war, zeigten die anderen Patienten keinen Effekt. Ob diese erhöhte C3a-desArg-Konzentration ein Ausdruck der CDC durch Rituximab ist, bleibt ungeklärt.

Erhöhte Plasmakonzentrationen von C3a-desArg wurden auch bei Patienten mit Sepsis und Multiorganversagen festgestellt. C3a gehört zu den Anaphylatoxinen. Es besitzt chemotaktische Wirkung auf eosinophile und basophile Granulozyten und bewirkt durch Degranulation die Freisetzung von Histamin. C3a induziert die Freisetzung von Prostaglandin E₂ in humanen Makrophagen und reguliert die IL-1 und TNF-α in PBMC [102]. Auch bei der Synthese von IL-6 scheint C3a stimulierend zu wirken [103]. Es wäre also denkbar, dass der durch Rituximab induzierte Anstieg von C3a-desArg im Plasma nicht nur für therapeutische Effekte verantwortlich ist, sondern auch für die in vivo-beobachteten Nebenwirkungen ausschlaggebend ist.

Warum einige der Patienten eine erhöhte C3a-desArg-Konzentration als Zeichen einer Komplementaktivierung unter Rituximab aufweisen und andere hingegen nicht, lässt sich nur mutmaßen. Wichtig wäre in diesem Zusammenhang zu untersuchen, ob es eine Verbindung zwischen der Höhe der C3a-desArg-Konzentration und dem Ansprechen auf die Rituximabtherapie gibt. Die Rolle des Komplementsystems von Patienten mit hämatologischen Neoplasien wird in der Wissenschaft immer noch sehr unterschiedlich diskutiert. Zwei Studien berichten über eine verminderte Aktivität des Komplementsystem in Korrelation mit einer niedrigen Überlebensrate bei Patienten mit B-CLL [104, 105]. Bannerji et al. untersuchten die globale Komplementaktivität (CH50) und die C3-Konzentration bei Patienten mit B-CLL am Tag 1 und 3 sowohl vor als auch nach der Gabe von Rituximab. Dabei kam es zum Abfall sowohl der CH50 als auch der C3-Konzentration nach der Gabe von Rituximab [98].

In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass es bei sechs von zehn Patienten mit unterschiedlichen Lymphomentitäten zu einer Aktivierung des Komplementsystems kam. Dabei gab es keine signifikante Korrelation zwischen den einzelnen Entitäten. Um diese Ergebnisse zu bestätigen oder zu widerlegen, müssen weitere Untersuchungen mit größeren Patientenzahlen folgen.