In den Abbildungen 1A-F wird der Einfluss von Rituximab auf das Wachstumsverhalten verschiedener humaner B-Zellinien dargestellt. Am deutlichsten zeigt sich der Einfluss bei der Zellinie DOHH-2. Die drei Kurven zeigen die Inhibition der Proliferation durch drei Rituximab-Konzentrationen 100 ng/ml, 1 µg/ml und 10 µg/ml über einen Zeitraum von 72 Stunden. Der wachstumshemmende Effekt betrug nach 24 Stunden in den Antikörperkonzentrationen 1 µg/ml und 10 µg/ml maximal 50 Prozent. Nach 72 Stunden stieg dieser Effekt auf maximal 80 Prozent an. In der Antikörperkonzentration 100 ng/ml wurde am ersten Tag eine 25-prozentige Wachstumshemmung beobachtet. Die maximale Wachstumshemmung von 80 Prozent wurde am dritten Tag der Inkubation erreicht.

Abbildung 1A : Einfluss von Rituximab auf das Wachstumsverhalten humaner B-Zellinien. DOHH-2-Zellen in einer Konzentration von 2 x 10⁵ Zellen/ml wurden mit unterschiedlichen Rituximabkonzentrationen, (100 ng/ml, 1 µg/ml, 10 µg/ml) bei 37°C über einen Zeitraum von 72 Stunden inkubiert. Die Zellproliferation wurde mittels MTT-Assay bestimmt. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardabweichungen von drei unabhängigen Experimenten.

In der Abbildung 1B wird das Wachstumsverhalten der Zellinie DAUDI beschrieben. Anhand der einzelnen Kurven wird der Verlauf der Wachstumshemmung durch den Antikörper über drei Tage bei drei verschiedenen Konzentrationen beschrieben. Auch hier lässt sich ein deutlicher Einfluss von Rituximab auf das Wachstum der Zellen feststellen. Zwischen den drei Antikörperkonzentrationen konnten dabei Unterschiede in Bezug auf die Wachstumshemmung beobachtet werden. In den Antikörperkonzentrationen 1 µg/ml und 10 µg/ml betrug der wachstumshemmende Effekt durch Rituximab nach 48 Stunden 25-30 Prozent. In der Antikörperkonzentration 100 ng/ml wurde zu keinem Zeitpunkt ein Effekt durch den Antikörper beobachtet.

Abbildung 1B: Einfluss von Rituximab auf das Wachstumsverhalten humaner B-Zellinien. DAUDI-Zellen in einer Konzentration von 2 x 10⁵ Zellen/ml wurden mit unterschiedlichen Rituximabkonzentrationen, (100 ng/ml,

1 µg/ml, 10 µg/ml) bei 37°C, über einen Zeitraum von 72 Stunden inkubiert. Die Zellproliferation wurde mittels MTT-Assay bestimmt. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardabweichungen von drei unabhängigen Experimenten.

Die Abbildung 1C zeigt die Inhibition der Proliferation in Gegenwart der drei Rituximab-Konzentrationen 100 ng/ml, 1 µg/ml und 10 µ/ml bei der Zellinie Granta-519. Wie in der Abbildung zu erkennen ist, konnte kein Effekt durch den Antikörper beobachtet werden. Unterschiede zwischen den verschiedenen Antikörperkonzentrationen gab es nicht.

Abbildung 1C: Einfluss von Rituximab auf das Wachstumsverhalten humaner B-Zellinien. Granta-519-Zellen in einer Konzentration von 2 x 10⁵ Zellen/ml wurden mit unterschiedlichen Rituximabkonzentrationen, (100 ng/ml, 1 µg/ml, 10 µg/ml) bei 37°C über einen Zeitraum von 72 Stunden inkubiert. Die Zellproliferation wurde mittels MTT-Assay bestimmt. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardabweichungen von drei unabhängigen Experimenten.

Abbildung 1D zeigt das Wachstumsverhalten der Zellinie Raji unter drei verschiedenen Antikörperkonzentrationen von Rituximab über einen Zeitraum von 72 Stunden. Wie bereits bei der Zellinie Granta-519 zu beobachten war, konnte auch bei Raji bei keiner der drei Antikörper-konzentrationen ein Effekt nachgewiesen werden.

Abbildung 1D: Einfluss von Rituximab auf das Wachstumsverhalten humaner B-Zellinien. Raji-Zellen in einer Konzentration von 2 x 10⁵ Zellen/ml wurden mit unterschiedlichen Rituximabkonzentrationen, (100 ng/ml,
1 µg/ml, 10 µg/ml) bei 37°C über einen Zeitraum von 72 Stunden inkubiert. Die Zellproliferation wurde mittels MTT-Assay bestimmt. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardabweichungen von drei unabhängigen Experimenten.

Abbildung 1E zeigt den Einfluss von Rituximab auf das Wachstumsverhalten der Zellinie Bonna-12. Wiederum wurde der Antikörper in drei verschiedenen Konzentrationen über einen Zeitraum von 72 Stunden mit Bonna-12-Zellen inkubiert. Es konnte kein Effekt durch den Antikörper beobachtet werden. Unterschiede zwischen den verschiedenen Antikörperkonzentrationen gab es nicht.

Abbildung 1E: Einfluss von Rituximab auf das Wachstumsverhalten humaner B-Zellinien. Bonna-12-Zellen in einer Konzentration von 2 x 10⁵ Zellen/ml wurden mit unterschiedlichen Rituximabkonzentrationen, (100 ng/ml, 1 µg/ml, 10 µg/ml) bei 37°C über einen Zeitraum von 72 Stunden inkubiert. Die Zellproliferation wurde mittels MTT-Assay bestimmt. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardabweichungen von drei unabhängigen Experimenten.

Abbildung 1F zeigt den Einfluss des Antikörpers auf das Wachstumsverhalten der Zellinie

JVM-2 an drei aufeinanderfolgenden Tagen. Auch hier konnte in den verschiedenen Antikörperkonzentrationen kein Einfluss auf das Wachstum der Zellen beobachtet werden.

Abbildung 1F: Einfluss von Rituximab auf das Wachstumsverhalten humaner B-Zellinien. JVM-2-Zellen in einer Konzentration von 2 x 10⁵ Zellen/ml wurden mit unterschiedlichen Rituximabkonzentrationen, (100 ng/ml,
1 µg/ml, 10 µg/ml) bei 37°C über einen Zeitraum von 72 Stunden inkubiert. Die Zellproliferation wurde mittels MTT-Assay bestimmt. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardabweichungen von drei unabhängigen Experimenten.

Zwischen den sechs verschiedenen humanen B-Zellinien gab es Unterschiede in Bezug auf das Wachstumsverhalten unter Rituximab: Bei den Zellinien DOHH-2 und DAUDI konnte eine deutliche Wachstumshemmung beobachtet werden. Dabei betrug der antiproliferative Effekt von 1 µg/ml Rituximab auf die Zellinie DOHH-2 nach 72 Stunden 75 Prozent. Bei der Zellinie DAUDI konnte in der Antikörperkonzentration 1 µg/ml nach 72 Stunden eine Wachstumshemmung von 30 Prozent beobachtet werden. Die anderen vier Zellinien zeigten keine Reaktion im Wachstumsverhalten. Für alle weiteren Versuche wurden zwei Zellinien mit deutlicher Wachstumshemmung unter Antikörpereinfluss und zwei Zellinien ohne Reaktion auf den Antikörper ausgewählt. Der Übersicht halber wird in Abbildung 2 nochmals der Vergleich zwischen den vier Zellinien in bezug auf das Wachstumsverhalten unter Rituximab 1 µg/ml dargestellt.

Abbildung 2: Einfluss von Rituximab auf das Wachstumsverhalten humaner B-Zellinien. Vier verschiedene humane B-Zellinien in einer Konzentration von 2 x 10⁵ Zellen/ml wurden mit einer Antikörperkonzentration von 1 µg/ml inkubiert. Die Inkubation erfolgte bei 37°C über einen Zeitraum von 72 Stunden. Die Zellproliferation wurde mittels MTT-Assay bestimmt. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardabweichungen von drei unabhängigen Experimenten.

Abbildung 3 zeigt das Wachstumsverhalten der Zellinie DOHH-2 unter Zugabe von 1 µg/ml Rituximab und 100 µl/ml humanem Komplement. Dabei wird deutlich, dass der alleinige Antikörpereffekt durch die Zugabe von humanem Komplement verstärkt wird. Am ersten Tag der Inkubation konnte ohne humanes Komplement kein Effekt beobachtet werden. Nach Zugabe von humanem Komplement betrug die Hemmung des Zellwachstums 30 Prozent.

Nach drei Tagen Inkubation betrug der wachstumshemmende Einfluss von Rituximab ohne Komplement 30 Prozent. Die Hemmung des Zellwachstums in Anwesenheit von humanem Komplement lag bei 56 Prozent.

Abbildung 3: Komplement-vermittelte Wachstumshemmung durch Rituximab. DOHH-2-Zellen in einer Konzentration von 2 x 10⁵ Zellen/ml wurden mit 1 µg/ml Rituximab und 100 µl/ml hitzeinaktiviertem (•) oder intaktem humanem Komplement (o) über einen Zeitraum von 72 Stunden inkubiert. Die Zellproliferation wurde mittels MTT-Assay bestimmt. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardabweichungen von unabhängigen Experimenten.

Abbildung 4 zeigt das Wachstumsverhalten der Zellinie DAUDI unter Zugabe von 1 µg/ml Rituximab und 100 µl/ml humanem Komplement. Auch hier konnte ein deutlicher Anstieg der Wachstumshemmung durch humanes Komplement gezeigt werden. Ohne humanes Komplement konnte an keinem der drei Tage ein Effekt durch den Antikörper beobachtet werden. Nach Zugabe von humanem Komplement betrug die Hemmung des Zellwachstums schon am ersten Tag 53 Prozent, stieg am zweiten Tag auf 65 Prozent an und betrug nach drei Tagen Inkubation 56 Prozent.

Abbildung 4: Komplement-vermittelte Wachstumshemmung durch Rituximab. DAUDI-Zellen in einer Konzentration von 2 x 10⁵ Zellen/ml wurden mit 1 µg/ml Rituximab und 100 µl/ml hitzeinaktiviertem (•) oder intaktem humanem Komplement (o) über einen Zeitraum von 72 Stunden inkubiert. Die Zellproliferation wurde mittels MTT-Assay bestimmt. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardabweichungen von unabhängigen Experimenten.

Abbildung 5 zeigt das Wachstumsverhalten der Zellinie JVM-2 unter Zugabe von 1 µg/ml Rituximab und 100 µl/ml humanem Komplement. Nach 72 Stunden Inkubation konnte weder mit, noch ohne Zugabe von humanem Komplement ein Effekt auf das Wachstum der Zellen beobachtet werden.

Abbildung 5: Komplement-vermittelte Wachstumshemmung durch Rituximab. JVM-2-Zellen in einer Konzentration von 2 x 10⁵ Zellen/ml wurden mit 1 µg/ml Rituximab und 100 µl/ml hitzeinaktiviertem (•) oder intaktem humanem Komplement (o) über einen Zeitraum von 72 Stunden inkubiert. Die Zellproliferation wurde mittels MTT-Assay bestimmt. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardabweichungen von unabhängigen Experimenten.

Abbildung 6 zeigt das Wachstumsverhalten der Zellinie RAJI unter Zugabe von 1 µg/ml Rituximab und 100 µl/ml humanem Komplement. Wie auch bei der Zellinie JVM-2 erkennbar war, konnte weder durch den Antikörper alleine, noch durch Zugabe von humanem Komplement eine Wachstumshemmung erreicht werden.

Abbildung 6: Komplement-vermittelte Wachstumshemmung durch Rituximab. Raji-Zellen in einer Konzentration von 2 x 10⁵ Zellen/ml wurden mit 1 µg/ml Rituximab und 100 µl/ml hitzeinaktiviertem (•) oder intaktem humanem Komplement (o) über einen Zeitraum von 72 Stunden inkubiert. Die Zellproliferation wurde mittels MTT-Assay bestimmt. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardabweichungen von unabhängigen Experimenten.

Um einen möglichen Zusammenhang zwischen der Wirkung des monoklonalen Antikörpers Rituximab und dem menschlichen Komplementsystem herzustellen, wurde bei zehn Patienten mit unterschiedlichen Non-Hodgkin-Lymphomen der Verlauf der C3a-desArg-Konzentration vor, während und nach einer Infusion mit Rituximab gemessen.

Die Kontrollgruppe definierte sich dabei wie folgt:

Sie war sehr heterogen, da das Alter von 27-52 Jahren variierte, sie acht männliche und dreizehn weibliche Probanden umfasste und die C3a-desArg Konzentration im Median zwischen 50-142 ng/ml lag. Infektionen, chronische Erkrankungen oder Allergien bestanden anamnestisch bei den Probanden nicht. In der Literatur konnten keine Hinweise für einen Zusammenhang zwischen Alter, Geschlecht und der Höhe der C3a-desArg Konzentration in Gesunden gefunden werden. Im Median wurde eine C3a-desArg Konzentration von 77 ng/ml für die Kontrollgruppe ermittelt. In der Literatur wurden vergleichende Konzentrationen für C3a-desArg bei gesunden Probanden ermittelt [83]. Tabelle 1 und 2 geben einen Überblick über das Patientenkollektiv und die Kontrollgruppe. Tabelle 3 zeigt den Vergleich der C3a-desArg-Konzentration von Kontroll- und Patientengruppe vor einer Rituximab-Infusion.

Kontrollgruppe

Anzahl, n

21

Alter, Median (Range)

42 (27-52)

männlich / weiblich

8/13

C3a-desArg-Level; Median (Range)

77 (50-142)

Tab.1: Kontrollgruppe

FL

B-CLL

MCL

Total

Patienten

5

4

1

10

Alter, Median (Range)

63 (53-72)

57 (50-62)

71

57,5 (50-72)

männlich / weiblich

3/2

3/1

1/0

7/3

Tab. 2: Patientengruppe

C3a-desArg-Konzentration

Median (Range), [ng/ml]

P*

Normalkollektiv, n = 21

77 (50-142)

NHL-Patienten, n = 10

148,5 (96-726)

0,05

Tab. 3: Vergleich der C3a-desArg-Konzentration vor Rituximabgabe mit der Kontrollgruppe

Die Abbildung 8 zeigt den Verlauf der Komplementaktivierung bei vier Patienten mit einer

B-CLL unter Therapie mit Rituximab. Bei drei dieser Patienten konnte ein kontinuierlicher Anstieg der C3a-desArg-Konzentration im Plasma beobachtet werden. Dabei lag die maximale Konzentration bei den Patienten 1 und 3 bei 630 ng/ml und wurde sechs Stunden nach Infusionsbeginn gemessen. Bei Patient 4 betrug die C3a-desArg-Konzentration vor der Rituximab-Infusion 141 ng/ml und stieg innerhalb von vier Stunden nach Beginn der Infusion auf einen Wert von 800 ng/ml an. Bei Patient 2 konnte keine Komplementaktivierung festgestellt werden, die C3a-desArg-Konzentration schwankte um den Bereich der Kontrollgruppe.

Abbildung 8: In vivo- Komplementaktivierung durch Rituximab bei Patienten mit B-CLL. Beginn der Rituximab-Infusion zur Zeit = 0h. Die Messungen bei den Patienten 2 und 4 erfolgte zum Zeitpunkt 0h, 1h, 2h, 4h, bei
Pat. 1 und 3 auch bei 6h, 9h, und 24h. Dargestellt ist der C3a-desArg Plasmakonzentrationsverlauf über 24h.

Bei den Patienten 5-9 handelte es sich um Patienten mit einem follikulären Lymphom II°-III°. Insgesamt konnten unterschiedliche C3a-desArg-Konzentrationen vor, während und nach einer Rituximab-Infusion beobachtet werden. Dabei entsprachen bei den Patienten 5 und 6 alle gemessenen C3a-desArg-Konzentrationen sowohl vor, während als auch danach, denen der Kontrollgruppe. Bei Patient 7 lag die Konzentration vor der Rituximab-Infusion bei 331 ng/ml und damit über der des Normalkollektivs. Während der Infusion stieg die C3a-desArg-Konzentration auf 3390 ng/ml an und fiel danach kontinuierlich wieder ab. Bei Patient 8 stieg die maximale Konzentration nach vier Stunden auf 303 ng/ml. Allerdings lag schon die initiale Konzentration mit 286 ng/ml außerhalb des Normalbereichs, so dass eine Komplementaktivierung eher unwahrscheinlich erscheint. Auch bei dem Patient 9 lag die initiale C3a-desArg-Konzentration mit 726 ng/ml außerhalb des Normalbereichs und stieg im Verlauf von 24 Stunden nur noch auf einen maximalen Wert von 800 ng/ml an.

Abbildung 9: In vivo- Komplementaktivierung durch Rituximab bei Patienten mit einem follikulären Lymphom Grad II°-III°. Beginn der Rituximab-Infusion zur Zeit = 0h. Die Messungen erfolgten zum Zeitpunkt 0h, 1h, 2h, 4h, 6h, 9h und 24h. Dargestellt ist der C3a-desArg Plasmakonzentrationsverlauf über 24h.

Bei dem in der Abbildung 10 dargestellten Patienten mit einem Mantelzell-Lymphom lag die im Plasma gemessene C3a-desArg-Konzentration vor der Rituximab-Infusion mit 152 ng/ml im Bereich des Normalkollektivs. Nach Beginn der Rituximab-Infusion konnte ein deutlicher Anstieg der C3a-desArg-Konzentration bis auf einen maximalen Wert von 2518 ng/ml vier Stunden nach Beginn der Infusion beobachtet werden. Auch nach 24 Stunden lag die gemessene Konzentration an C3a-desArg mit 1073 ng/ml weit außerhalb des Bereichs der Kontrollgruppe.

Abbildung 10: In vivo- Komplementaktivierung durch Rituximab bei einem Patienten mit einem Mantelzellymphom. Beginn der Rituximab-Infusion erfolgte zur Zeit = 0h. Die Messungen erfolgten zum Zeitpunkt 0h, 1h, 2h, 4h, 6h, 9h und 24h. Dargestellt ist der mittlere C3a-desArg Plasmakonzentrationsverlauf über 24h.