Die Tierexperimente sind in strenger Einhaltung der Tierschutzrichtlinien durchgeführt und im Tierschutzvorhaben G 0113/2000 Endres vom Berliner Landesamt für Arbeitsschutz, Gesundheitsschutz und technische Sicherheit (LAGetSi) genehmigt worden. Für die Versuche wurden SVJ/129 Wildtypmäuse des Bundesinstitutes für Risikobewertung (BfR) Berlin und eNOS-defiziente (eNOS-„knockout“) Mäuse des Mausstammes B6 129/P2-NOS3 der Firma Charles River, Wilmington, USA verwendet. Für die Experimente zu regelmäßigem körperlichen Training sind Mäuse in Käfigen gehalten worden, die mit einem Laufrad ausgestattet waren, um freiwillige körperliche Aktivität zu ermöglichen. Die Kontrolltiere wurden in normalen Haltungskäfigen belassen. Andere Tiere wurden täglich auf einem Laufband trainiert, um forciertes Training zu simulieren. Die Untersuchungen zu HMG-CoA-Reduktase-Hemmern wurden mit Atorvastatin, der Firma Pfizer und Rosuvastatin, der Firma AstraZeneca durchgeführt. Beide Statine wurden dosisabhängig über 14 bzw. 10 Tage täglich subkutan im Vergleich zur Lösungsmittelkontrolle appliziert.

In Halothannarkose und bei konstanter Körpertemperatur erfolgte die Ischämieinduktion im Versorgungsbereich der linken A. cerebri media. Dazu wird ein silikonbeschichtetes Monofilament in die linke A. carotis communis eingebracht und in die A. carotis interna weiter fortgeführt, um den Abgang der A. cerebri media zu verlegen. Nach ein- bzw. zweistündiger Ischämie wurde das jeweilige Filament wieder entfernt, um die Reperfusion zu ermöglichen. In einigen Tieren pro Gruppe sind während der Ischämie der regionale zerebrale Blutfluß (rCBF) mittels Laserdoppler und physiologische Parameter wie mittlerer arterieller Blutdruck und die Blutgasparameter pH, pO₂, pCO₂ gemessen worden (Endres et al., 1998). Die Einschätzung des neurologischen Defizits wurde nach den Bederson-Kriterien von einem verblindeten Untersucher 30 Minuten bzw. 24 Stunden nach Ischämieinduktion vorgenommen (Bederson et al., 1986).

Für die Neuroprotektionsstudien wurden die Tiere 24 Stunden nach Ischämieinduktion in tiefer Narkose dekapitiert und die Hirne entnommen. Nach Gewebeaufbereitung und Durchführung von histologischen Standardfärbungen erfolgte die Infarktvolumetrie computergestützt mit einem Bildverarbeitungsprogramm. Das Gesamtinfarktvolumen wird entweder durch direkte Aufsummierung der Infarktareale oder aus der Differenz zwischen kontralateraler und nichtinfarzierter ipsilateraler Hemisphäre bestimmt. Die Differenz zwischen direktem und indirektem Infarktvolumen entspricht dem Hirnödem im Infarktgebiet (Endres et al., 1998).

Die Bestimmung des absoluten zerebralen Blutflusses (aCBF) erfolgte während der Ischämie mittels ¹⁴C-Jodantipyrine-Autoradiographie. Dazu wurde nach der Ischämieinduktion und Umstellung der Inhalations- auf intravenöse Etomidate-Narkose ¹⁴C-Jodantipyrine innerhalb einer Minute in ansteigender Rate infundiert. Während der Infusion wurden kontinuierlich arterielle Blutproben gesammelt. Nach anschließender Dekapitierung und Hirnentnahme sind koronare Gefrierschnitte angefertigt und zusammen mit entsprechenden ¹⁴C-Standards auf Röntgenfilme gebracht worden. Die ¹⁴C-Jodantipyrine-Konzentration der gesammelten arteriellen Blutproben wurde 24 Stunden nach Versuchsende bestimmt. Die computergestützte Auswertung erfolgte mit Hilfe eines Bildverarbeitungssystems. Dabei wird die optische Dichte der belichteten Röntgenfilme mit Hilfe der Kalibrierungsstandards und der arteriellen ¹⁴C-Jodantipyrine-Konzentrationskurve in das zerebrale Blutflußergebnis umgerechnet (Jay et al., 1988). Die Bestimmung des aCBF wurde standardisiert in ausgewählten Hirnregionen ipsi- und kontralateral durchgeführt.

In Zusammenarbeit mit Frau PD Dr. med. vet. Ute Lindauer (Experimentelle Neurologie, Charité-Universitätsmedizin, Berlin) wurde an isolierten Femoralarterien die acetylcholinabhängige Vasodilatation nach freiwilliger körperlicher Aktivität gemessen (Lindauer et al., 2001).

Die Blutungszeit ist zweimal in jedem Tier nach Punktion der dorsalen Schwanzvene mittels einer Lanzette gemessen worden (Freedman et al., 1999).

Die Thrombusbildung wurde unter Inhalationsnarkose durch Ligation der V. cava inferior unterhalb der Abgänge der Nierenarterien induziert. Zwei Stunden später erfolgte die Thrombusentnahme und nach 24 Stunden die Gewichtsbestimmung der Thromben (Wollny et al., 1999).

Zur Thrombozytengewinnung und zur Bestimmung der Thrombozytenaktivitätsparameter Plättchenfaktor 4 (PF 4) und beta-Thromboglobulin (beta-TG) wurde durch Punktion des retroorbitalen Venenplexus in tiefer Chloralhydratnarkose Blut entnommen (Kaplan et al., 1981). Nach Aufbereitung und Gewinnung plättchenreichen bzw. plättchenarmen Plasmas erfolgte die weitere Bestimmung von PF4 und beta-TG im ELISA sowie der Thrombozyten-eNOS-mRNA in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von PD Dr. med. Ulrich Laufs (Klinik für Innere Medizin, Universität des Saarlandes, Homburg).

Die Erhebung der weiteren in vitro Analysen wie die Durchführung der reversen Transkriptions-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) zur Quantifizierung der eNOS-„messenger“-Ribonukleinsäure (mRNA), die Bestimmung der NOS-Aktivität im Arginin-Citrullin-Konversionsassay und die Aktivitätsanalyse der Rho-GTPase mittels Immunoprezipitation erfolgte ebenfalls nach Bereitstellung der in vivo Proben wie Aorten, Hirngewebe und Thrombozytenkonzentrat in Kooperation mit der Arbeitsgruppe um Dr. Laufs. Dort wurden desweiteren die „Western Blot“-Untersuchungen zur eNOS und Rho-GTPase-Proteinbestimmung und die „Northern Blot“-Experimente zur eNOS-mRNA-Analyse sowie die Zellkulturarbeiten durchgeführt.

Die Daten wurden als Mittelwert mit zugehörigem Standardfehler erhoben. Die statistischen Vergleiche sind mittels Student`s t-test oder ANOVA gefolgt vom Tukey post hoc Test erstellt worden. Für die Auswertung der Thrombusinduktion kam der Chi-Quadrat-Test und für die Vergleiche zum neurologischen Defizit der Mann-Whitney-Test zur Anwendung. Als statistisch signifikant wurde ein Wert für P<0,05 angenommen.