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Kapitel 2. Stichprobenauswahl und Methodik

2.1 Die Patientenkollektive

AGS-Stichprobe:

62 Patienten aus 62 nicht miteinander verwandten, klinisch charakterisierten AGS-Familien wurden in der IV. Klinik für Innere Medizin des Universitätsklinikums Charité-Berlin und in der Kinderklinik des Eberhard-Karls-Universitätsklinikums Tübingen untersucht. Das mittlere Alter der 41 weiblichen und der 21 männlichen Patienten lag bei 20 Jahren (zwischen 2 und 55 Jahren). 26 Patientinnen und 11 Patienten wiesen eine klassische AGS-Form mit Salzverlust-Syndrom auf. Drei Patientinnen und ein Patient zeigten eine nicht-klassische Form. 14 Patientinnen und sieben Patienten wiesen eine einfach virilisierende Form des AGS auf.

PCOS-Stichprobe:

Die Stichprobe PCOS entstammte aus der Kinderwunsch-Sprechstunde der Frauenklinik der Charité. Als erstes Auswahlkriterium diente die PCO-Diagnose mittels vaginalem Ultraschall sowie Anamnese und körperliche Untersuchung in Bezug auf Hirsutismus und Akne. Das Vorliegen von Zyklusstörungen wie Amenorrhoe und Oligomenorrhoe diente als weiteres Diagnosekriterium.

Bei den 17 Teilnehmerinnen der Kontrollgruppe wurden alle diagnostisch wichtigen Merkmale berücksichtigt und das Vorliegen eines PCOS ausgeschlossen. Die Untersuchungen erfolgten nach der schriftlichen Einwilligung der Probandinnen.

Alle so diagnostizierten Studienteilnehmerinnen wurden mit einem ACTH-Test im Labor der IV. Medizinischen Klinik der Charité untersucht. Die Analyse der gewonnenen Blutproben wurde im Institut für Experimentelle Endokrinologie der Charité vorgenommen. Nach Auswertung der klinischen Untersuchungen wurden 21 Patientinnen in die Studie eingeschlossen.

IO-Stichprobe:

Bei Männern mit IO aus der Andrologischen Ambulanz der Charité wurden bekannte mögliche Faktoren für Spermatogenesestörung ausgeschlossen. Kontrollen ergaben, daß die Probanden dieser Stichprobe keine zytogenetischen Auffälligkeiten aufweisen. Für die geplanten Untersuchungen der Stichprobe waren 50 Patienten der Andrologischen Ambulanz geeignet. Bei ihnen wurde eine Oligospermie unbekannter Ursache diagnostiziert. Auf ein persönliches Anschreiben meldeten sich weniger als 25%, letztendlich waren insgesamt nur 8 Patienten (16%) im Alter zwischen 35 und 45 Jahren bereit, an dieser Studie teilzunehmen. Bei drei dieser Patienten lagen Hormonbefunde vor. Um die Patienten nach gezielten Kriterien bewerten zu können, waren eine ausführliche Erhebung der Anamnese und des Status praesens, die Auswertung von Spermiogrammen und verschiedene Blutuntersuchungen notwendig. Es wurde hierfür eine Festlegung der Spermatozoenzahlen zwischen 1 und 10 Millionen pro ml getroffen. Dabei läßt sich dieser Bereich als Nachweis einer wirklich eindeutigen Fertilitätsminderung begründen. Azoospermien können auch durch totale Verschlüsse unterschiedlicher Lokalisation bedingt sein. Deshalb sollten Patienten mit einer Azoospermie nicht untersucht werden. Deshalb wurde als untere Grenze für die Auswahl der Patienten eine Spermatozoen-Konzentratrion von 1x10⁶ Spermatozoen pro ml gewählt.

Neben der allgemeinen, Eigen- und Familienanamnese erfaßte die andrologische Befragung zusätzlich alle Störungen hinsichtlich der Sexualfunktion, Erkrankungen, Operationen und Traumen im Bereich der Genitalorgane; die gynäkologische Anamnese der Partnerin, Angaben zum Kinderwunsch und zu chronischen Streßsituationen. Durch eine zytogenetische Voruntersuchung wurde in dieser Stichprobe chromosomale Abberationen ausgeschlossen. Zur Kontrollgruppe gehörten 26 gesunde Männer. Zusätzlich zur Basis-Diagnostik wurde nach schriftlicher Einwilligung bei den Probanden ein ACTH-Test durchgeführt.

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2.2 Molekulargenetische Untersuchung

2.2.1 Vorbemerkung

Das Ziel unserer Untersuchungen der AGS-Stichprobe bestand neben dem Auffinden Mutationen in CYP21 und Erstellung einer Genotyp-Phänotyp Korrelation auch in der Optimierung von PCR- und ASO für das jeweilige untersuchte Exon, um ein routinemäßiges und schnelles Mutationsscreening im Rahmen einer AGS-Diagnostik mit hoher Effektivität zu ermöglichen. Aus diesem Grunde werden die Ergebnisse der Optimierungsversuche sowie Standardbedingungen, die für Darstellung der molekulargenetischen Untersuchungsergebnisse gewählt und erfolgreich durchgeführt wurden, vorangestellt.

Screeningmethoden von Mutationen im CYP21 sind zum gegenwärtigen Zeitpunkt sehr zeit- und kostenaufwendig. Bei der Auswahl unserer Methoden wurde auf eine möglichst weitreichende Erfassung in Frage kommender Mutationen bei vertretbarem apparativen und zeitlichen Aufwand besonders Wert gelegt.

2.2.2 Mutationsanalyse in CYP21

CYP21 wurde in den verschiedenen Patientengruppen nach folgendem Schema untersucht.

Abbildung 5: Schematische Darstellung der molekulargenetischen Methodik zur Untersuchung der CYP21(CYP21P / CYP21)

Die spezifische Trennung des Pseudogens (CYP21P) vom aktiven Gen (CYP21) war Voraussetzung für die weiteren Untersuchungen. Zur Unterscheidung zwischen Pseudogen und aktivem Gen sowie zur direkten Mutationsanalyse des CYP21 wurde aus verschiedenen möglichen Methoden die effektive Technik der Southernblot-Hybridisierung ausgewählt, um große Deletionen und Genkonversionen aufzuspüren. Die spezifische Amplifikation des aktiven CYP21 erfolgte durch Anwendung von PCR-Techniken, die zu diesem Zweck optimiert wurden. Die Untersuchungen von Punktmutationen erfolgte mit Hilfe von radioaktiver Sequenzierung, da sich diese

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2.2.3 Verfahrensschritte

2.2.3.1 Präparation genomischer DNA aus Citrat- oder EDTA-Vollblut

Nach einer venösen Blutentnahme zur Gewinnung peripherer Leukozyten erfolgte eine DNA-Präparation.

Die Präparation der genomischen DNA basierte auf frischem Citrat- oder EDTA- Vollblut in Anlehnung an die von Miller et al. (1987) publizierte Vorschrift. Dementsprechend wurde das Blut (etwa 10 ml) mit einem vierfachen Volumen Kaliumchlorid (50 mM) versetzt und vorsichtig gemischt. Nach der Sedimentation der Leukozyten (1000 rpm, 10 min, 4°C) resuspendierten wir das Pellet in 3 ml Lysepuffer (s. Anhang) sowie 200 µl 10% SDS und 50 µl Proteinase K und inkubierten es entweder bei 50°C für zwei bis drei Stunden oder bei 37°C über Nacht. Dann erfolgte die Phenol- und Chloroformextraktion. Die DNA wurde anschließend mit einem zweifachen Volumen absoluten Ethanols gefällt, auf einen Glasstab aufgewickelt und mit 70%igem Ethanol nachgewaschen. Nachdem die DNA luftgetrocknet war, wurde sie in Aqua bidestillata gelöst und bei 4°C aufbewahrt. Die Konzentration und Reinheit der DNA wurde durch Messung des Absorptionskoeffizienten mit dem Spektralphotometer bei Wellenlängen von 269 nm sowie 280 nm bestimmt und der Quotient aus beiden Absorptionskoeffizienten gebildet. Wenn der Quotient kleiner als 1,8 war, mußte die Chloroformextraktion wiederholt werden, da die entsprechenden Proben einen zu hohen Anteil von Eiweißen aufwiesen.

2.2.3.2 Präparation von Plasmid-DNA aus E.coli

Die Plasmid-DNA-Präparation erfolgte nach der Alkali-Lyse-Methode (Sambrook et al. 1989). Vorher wurden die Zellen auf LB-Agar ausgespatelt, der 50 µg/ml Ampicilin enthielt (Sambrook et al. 1989). Die Insertisolierung erfolgte nach Restriktionsverdau der Plasmide mit den Enzymen BamHI und EcoRI unter Benutzung des QIAquick-Gel-Extraction-Kit (Fa. Quiagen).

Die selbstpräparierte p21c/3 Sonde wurde in Anlehnung an White et al. (1992) in der Southernblot-Analyse eingesetzt.

2.2.3.3 Southernblot-Hybridisierung

Zur effektiven Untersuchung von großen Deletionen bzw. Konversionen des CYP21 wurde die Southernblot-Hybridisierung eingesetzt (Strumberg et al. 1992). Strategisch sollte die Untersuchung zuerst mit einer Trennung beider Gene (CYP21P, CYP21) erfolgen. Dabei wurden 6 µg genomischer DNA unter optimalen Bedingungen mit Restriktionsenzymen Taq I und Bgl II und dazugehörigem Puffer für 3 h bei 65°C bzw. 37°C inkubiert. Danach haben wir die Restriktionsansätze gelelektrophoretisch in einem 8%igen Agarosegel aufgetrennt. Nach der Auftrennung wurden die Gele mittels Vakuum geblottet und DNA auf ein Filter transferiert. Die anschließende In Situ Fragmentierung erfolgte durch eine Behandlung mit 0,25 N HCl und alkalischem Denaturierungspuffer.

Zur Prähybridisierung der Filter wurden 10 ml von der Prähybridisierungslösung, die auch Heringssperma-DNA enthält, in die Flaschen gefüllt, während die Markierungsreaktion ablief. Der Einsatz von Heringssperma-DNA bewirkt auf dem Filter eine Blockierung von unspezifischen Bindungsstellen für radioaktiv-markierte DNA.

Die radioaktive Hybridisierung erfolgte mittels High Prime DNA Labeling Kit (Boehringer Mannheim) nach der Empfehlung des Herstellers. Die folgenden Fragmente wurden nach der Hybridisierung mit der p21c/3 Sonde (White et al. 1992) erzielt: eine 3,7 kb große Bande und eine 10 kb große Bande für das aktive CYP21 und 3,2 kb große Bande und 12 kb große Bande für das Pseudogen. Die Radioautography und die Auswertung erfolgte analog zu 2.2.3.6.

Wie aus Tabelle 3 ersichtlich sind Produkte des ungleiches Crossing Over 30 kb-Deletionen oder 30 kb-Duplikationen. Homozygote 30 kb-Deletionen stellen sich hierbei in der Southern-Blot-Analyse als fehlende Banden und heterozygote 30 kb-Deletionen oder 30 kb-Duplikationen als vom Wildtyp abweichendes Verhältnis der Bandenstärken dar.

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Tabelle 3: Auswertung der Densitomitrie mit Hilfe Phospho Imager mit dem Computerprogramm TINA Version 2.09 (Fuji X, BAS 2000)

Mutation	Relative Intensität 10 : 12 kb Bgl II Signale	Relative Intensität 3,2 : 3,7 kb Taq I Signale
30 kb Deletion (heterozygot)	2 : 1	2 : 1
CYP21/CYP21P Konversion	1 : 1	3 : 1
CYP21P Deletion (heterozygot)	2 : 1	1 : 2
CYP21 Deletion (heterozygot)	1 : 2	2 : 1
CYP21P Deletion	Keine 12 kb Fragment	Keine 3,2 kb Fragment
CYP21 Deletion	Keine 10 kb Fragment	Keine 3,7 kb Fragment

2.2.3.4 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)

Die PCR hat sich als eine geeignete Strategie zur Mutationsnalyse der CYP21-Gene (CYP21, CYP21P) etabliert (Higashi et al. 1988, Owerbach et al. 1990, 1992).

Mit Hilfe der PCR können definierte DNA-Sequenzen des aktiven CYP21 in vitro spezifisch ohne die zu 98% homologen CYP21P-Sequenzen schnell amplifiziert werden. Zur Sequenzsanalyse von Punktmutationen wurde DNA mit Hilfe der PCR amplifiziert. Beide Gensequenzen (CYP21, CYP21P) weisen eine Homologie von mehr als 98% auf. Um Abschnitte des aktiven Gens amplifizieren zu können, ohne zugleich auch das homologe Pseudogen CYP21P zu erhalten, wurde die Reaktionsbedingungen für die PCR entsprechend spezifisch gewählt und mittels eines Computer-Programmes (2.4.) optimiert. Nach der Optimierung der gewählten Bedingungen gelang es, das CYP21 in drei Abschnitten amplifizieren zu können. Die Größe der PCR-Fragmente ließ sich mit Hilfe von Standardmarkern abschätzen. Zur Prüfung der PCR-Amplifikationen kam die Agarosegelelektrophorese zum Einsatz (2.4.2.). Die gelelektrophoretische Auftrennung der jeweiligen Amplifikate ist in den Abbildungen 6 und 7 schematisch dargestellt.

- Spezifische Amplifikationen homologer Sequenzen in CYP21:

Für die Computer gestützte Trennung der CYP21-Gene erwiesen sich 3 Primer-Sets (Tabelle 4) für unsere Untersuchungen als geeignet: Die Primer P2 und P5 decken den Teil in Exon 3 des CYP21 ab, in dem CYP21P eine Deletion von 8 bp aufweist. Aus diesem Grund lagern sich diese Primer nur an die CYP21-Sequenz, was eine selektive Amplifikation dieses Gens ermöglicht.

Tabelle 4: Verwendete PCR-Primer zur DNA-Amplifikation

Primer	Sequenz (5‘ -3‘)	Position	Art des Primers
P1	GgA cAc TAT Tgc cTg cAg A	1378 - 1397	Sense
P2	AgT AgT cTc ccA Agg AcA	2376 - 2394	Antisense
P3	GTg gTg cTg Aac Tcc AA	1979 - 1996	Sense
P4	GcA TcT ccA cgA TgT gA	3053 - 3070	Antisense
P5	CcT gTc cTT ggg AgA cTA cT	2374 - 2394	Sense
P6	TcA gAT cTc Atc AcT ggT TcT ggc c	4369 - 4394	Antisense

Tabelle 5: Mutationen und deren Positionen auf dem CYP21, die in Stichproben von PCOS und idiopathischer Oligospermie untersucht wurden. Die Nukleotidpositionen sind gemäß CYP21-BANK, M12792, M23280 angegeben.

Nukleotid-Position	Exon/Intron Position	Sequenz-Veränderung	Aminosäure-Austausch	Referenz
1767	Exon 1	CcG - cTg	Pro30 - Leu	Tusie et al. 1991
2333	Intron 2	AA/Ac - Ag	Splice Mutation	Higashi et al. 1988
2385-2392	Exon 3	Gag AcT Ac	8 bp deletion	Higashi et al. 1988
2677	Exon 4	Atc - Aac	Ile236 - Asn	Amor et al. 1988
3361	Exon 7	GTg TTg	Val281 - Leu	Speiser et al. 1988
3672	Exon 8	Cag - Tag	Gln318- stop	Globerman et al. 1988
3736	Exon 8	CgT cAT	Arg339 - His	Helmberg et al. 1992
3786	Exon 8	Cgg-Tgg	Arg356 - Trp	Chiou et al. 1990

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4256

Intron 9

Ccc - Tcc

Pro453 - Ser

Helmberg et al. 1992 Owerbach et al. 1992

PCR-Amplifikation Nr. I

In der ersten PCR wurden die ersten beiden Exons und Introns sowie die ersten 30 bp des Exons 3 von CYP21 beginnend 5‘ von der TATAA-Box spezifisch amplifiziert. Das PCR-Produkt wies eine Länge von 1000 bp auf.

Die Sequenz des 5`-Primers (P1) enthielt in drei Positionen einzelne Nukleotide, in denen sich CYP21 von CYP21P unterscheidet. Die Sequenz des 3‘-Primers (P2) wurde in der Region gewählt, in der das Pseudogen im 3. Exon eine Deletion von 8 bp aufweist.

Die Auftrennung erfolgte in einem 0,8%igen Agarosegel bei einer Spannung von 80 V und einer Laufzeit von 1,5 Stunden in 1 x TAE-Laufpuffer. Als DNA-Standardmarker wurde die 1 kb-Leiter eingesetzt.

PCR-Amplifikation Nr. II

Diese Amplifikation ist für die Sequenz in CYP21 spezifisch und umfaßt einen Bereich von 1000 bp im Exon 3 beginnend bis in das Intron 6. Die Besonderheit dieser Amplifikation liegt darin, daß lediglich ein Primer (P4) des Primerpaares für diese Sequenz spezifisch ist, während beide CYP21-Gene die Sequenz des anderen Primer (P3) gemeinsam haben.

Die 3´-Primerregion liegt im 6. Exon und hat drei Thymidinmoleküle, die im Pseudogen gegen drei Adenosinmoleküle ersetzt sind. Die 5´-Primerregion liegt im 3. Exon, dessen Sequenz beide CYP21-Gene gemeinsam haben, weshalb der 5´-Primer nicht zwischen den beiden Genen differenziert.

PCR-Amplifikation Nr. III

Die dritte PCR-Amplifikation überschneidet sich mit der zweiten und liefert ein Produkt von 2000 bp. Die 5‘-Primerregion liegt am Ende von Exon 10. Die Sequenz des 5‘-Primers beinhaltet wiederum jene Region von Exon 3, in der das Pseudogen CYP21P gegenüber dem CYP21 eine Deletion von 8 bp aufweist. Die 3‘-Primerregion im Exon 10 ist bei beiden CYP21-Genen identisch, was dazu führen kann, daß der entsprechende DNA-Strang des Pseudogens amplifiziert wird. Er bleibt jedoch einzelsträngig und kann so vom gewünschten doppelsträngigen PCR-Produkt unterschieden werden. Insgesamt entsprechen alle gelelektrophoretisch aufgetrennten PCR-Amplifikate (I, II und III) den geforderten Standards. In nachfolgender Tabelle 6 sind die optimierten PCR-Bedingungen der einzelnen Fragmente des CYP21 noch einmal im Zusammenhang dargestellt.

Tabelle 6: Optimierte PCR-Bedingungen der Fragmente in CYP21

PCR Nr.	Thermoprofil/Zyklen		DNA- Konz.	Mg2-	Länge/Exon
I	96°C -5 min 94°C-1 min,58°C-1 min,72°C-2min 72°C-10min	1x 30x 1x	3ng/µl	1,5mM	1000 bp/ Ex. 1,2, 30 bp v. Ex. 3
II	96°C -4 min, 94°C-1 min,56°C-1 min,72°C-2min 72°C-10min	1x 30x 1x	3ng/µl	1,5mM	1000 bp/ Ex. 3,4,5
III	96°C -5 min, 94°C-1 min,60°C-1 min,72°C-2min 72°C-10min	1x 30x 1x	3ng/µl	1,5mM	2000 bp/ Ex. 4-10

2.2.3.5 Mutationsanalyse der 8 bp-Deletion im Exon 3 mittels PCR

Zur Mutationsanalyse der 8bp-Deletion im Exon 3 des CYP21 haben wir zuerst mittels PCR Tabelle 6 CYP21-spezifische Fragmente (ca. 130 bp und 138 bp) unter Einsatz eines korrespondierenden Primers für die 8bp-Deletion beginnend vom Exon 3, in Anlehnung an Rumsby et al. (1993) amplifiziert Tabelle 7 . Anschließend wurden die PCR-

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- Kontrolle der PCR-Produkte

Die Kontrolle der Amplifikate fand in einem 0,8-1,5%- igen Agarose-Gel, in welchem Ethidiumbromid (0,05µg/ml, Boehringer) gelöst war, statt (s. Anhang). Dazu wurde das Agarosegel in einer Elektrophoresekammer (Hybaid), die mit 1 x TAE-Puffer gefüllt war, mit den vorbreiteten Proben (5µl des PCR-Produktes und 3µl 0,01%- igem Bromphenolblau-Probenpuffer) beladen. Außerdem führten wir stets einen DNA-Längenstandard mit. Bei einer Spannung von 70 Volt ließen wir die Proben so lange im Gel laufen, bis die Größe des amplifizierten Fragmentes dem Längenstandard zugeordnet werden konnte. Die Amplifikate wurden auf einem Transilluminator (320 nm, Stratagene) durch das im DNA-Doppelstrang interkalierende und unter UV-Strahlung fluoreszierende Ethidiumbromid sichtbar gemacht und durch ein Foto dokumentiert.

Die Auswahl der spezifischen Amplifikate, die in Sequenzierreaktionen Einsatz fanden, ist in Tabelle 6 zusammengefaßt.

2.2.3.6 Allelspezifische Oligonukleotid-Hybridisierung (ASO)

Die ASO wurde zur Untersuchung von Punktmutationen in CYP21 in Anlehnung an die von Helmberg et al. (1992) publizierte Vorschrift durchgeführt.

CYP21-Spezifische Oligonukleotide wurden mit Hilfe des Computerprogramms Oligo 4.0 (Primer analysis software, copyright 1989-1991, Wojciech Rychik) ausgewählt.

Die radioaktive Markierung des Primers erfolgte durch 5´-Phospholyrung mit Hilfe von [-33P]-dATP. Dabei wurde in einer durch das Enzym T4-Polynukleotid-Kinase katalysierten Reaktion die -33P-Phosphatgruppe der ATP auf die 5´-terminale Hydroxylgruppe des Oligonukleotides übertragen.

Markierungssansatz:

0,25 µl	Primer (50µM)
1 µl	T4-Kinase (10U/µl)
1 µl	10x Kinasebuffer
2,5 µl	[33P]-dATP
ad.	10µl Aqua bidest

Der Ansatz wurde 60 min bei 37°C inkubiert. Anschließend erfolgte eine Enzyminaktivierung für 10 min bei 95°C. Der kinasierte Primer wurde bis zu seinem Einsatz in der Hybridisierung bei -20°C gelagert.

Die PCR-Produkte wurden auf einen Nylonmembran-Filter transferiert und mit den radioaktiv markierten spezifischen Oligonukleotiden für CYP21P und CYP21 hybridisiert. Die Filter wurden danach zusammen mit Verstärkerfolien und einem Röntgenfilm in eine Röntgenkassette gelegt und bei Raumtemperatur exponiert. Die Belichtungszeit variierte je nach Signalstärke zwischen 1 und 14 Tagen. Die Filmentwicklung erfolgte anschließend in einer automatischen Enwicklungsapparatur (Agfa).

Nach der anschließenden Autoradiographie erfolgte die Auswertung auf dem Phospho Imager mit einem Computerprogramm (Fujix. Bas 2000, TINA 2,09).

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Tabelle 7: Auswahl der verwendeten sense (s)- und antisense (as)- Primer für CYP21. Hyb: Hybridisierungstemperatur, WT: Wildtyp, Mut: Mutation, seq: Sequenzierung, splln2: Splice-Site-Mutation

Oligonukleotide	Sequenzen 5‘--------------------------3‘	Einsatz	Mutation
264b (s)	CCTGTCCTTGGGAGACTAT	PCR, seq.	5‘ primer exon 3
263b(as)	GAGACTACTCCCTGCTCTG	PCR, seq.	3‘ primer exon 3
304 (s)	GAAGAAGGTCAGGCCCTC	Seq.	spl. Intron 2
276 (s)	GGGGCTCTTGAGCTATAAGTGG	PCR, seq.	TATA-box
274 (as)	TCCTTGGGAGACTACTCCT	PCR, seq.	3‘ primer exon 3
5 (s)	TCCTTGGGAGACTACTCCT	Hyb,56°C	5‘ primer exon 3 8bp
287 (s)	CTGCAGACAAGCTGGTGT	PCR	5‘ primer exon 3
288 (as)	GAGCAGCTGACCCAGGAG	PCR	3‘ primer exon 3
260 (s)	AGAACTACCCGGACCTGT	PCR	5‘ primer exon 3
261 (as)	TTCTGTGAGGTAAGGCTG	PCR	3‘ primer exon 3
155 (as)	CCAGCCGGGTACCTCAGTT	PCR	3‘ primer, 3‘ Region
111 (s)	CCACCTCCCGCCTCTTG	Hyb, 63°C	CYP21, P30L
112 (s)	CCACCTCCTGCCTCTTG	Hyb, 63°C	CYP21P, P30L
62 (s)	AGCCCCCAACTCCTCCT	Hyb, 63°C	CYP21,splln2
67 (s)	AGCCCCCACCTCCTCCT	Hyb, 66°C	CYP21, splln2
57 (s)	AGCCCCCAGCTCCTCCT	Hyb, 65°C	CYP 21P, spl. Intron 2
121 (s)	CTGTCGTTGGTCTCTGCTC	Hyb, 60°C	CYP 21P, 8bp
51 (s)	CAGCATCATCTGTTAC	Hyb, 51°C	CYP21, I172N
52 (s)	CAGCATCAACTGTTAC	Hyb, 50°C	CYP21P, I172N
29 (s)	GATCACATCGTGGAGATGCA	Hyb, 58°C	CYP21, cluster exon 6
120 (s)		Hyb, 62°C	CYP21P, cluster exon 6
63 (s)	AAGGGCACGTGCACATG	Hyb, 58°C	CYP21, V281L
58 (s)	AAGGGCACTTGCACATG	Hyb, 59°C	CYP21P, V281L
206 (as)	CTGATCGGTGGCACTGA	Hyb, 58°C	CYP21, WT, G292S
140 (as)	TCCTGATCAGTGGCACT	Hyb, 60°C	CYP21, Mut., G292S
64 (s)	GTGGTTTTTTTGCTTC	Hyb, 60°C	CYP21, 1760insT
59 (s)	GTGGTTTTTTTTGCTTC	Hyb, 57°C	CYP21P, 1760insT
65 (s)	AGCGACTGCAGGAGGAG	Hyb, 60°C	CYP21, Q318X
60 (s)	AGCGACTGTAGGAGGAG	Hyb, 62°C	CYP21P, Q318X
205 (s)	TACAAGGACCGTGCAC	Hyb, 57°C	CYP21, WT, R339H
92 (s)	CAAGGACCATGCACGG	Hyb, 57°C	CYP21, Mut., R339H
207 (s)	GAGGTGCTGCGCCTGC	Hyb, 66,5°C	CYP21, R356W
208 (s)	GTGCTGCGCCTGTGG	Hyb, 63,5°C	CYP21P, R356W
216 (s)	CTTCACGCTGCTGCCCTC	Hyb, 64°C	CYP21, WT, P453S
215 (s)	CTTCACGCTGCTGTCCTC	Hyb, 63°C	CYP21, Mut., P453S
218 (s)	CGGGGGATGGGGGC	Hyb, 57°C	CYP21, WT,2675G/C
217 (s)	CCGGGATGGGGGCC	Hyb, 57°C	CYP21, Mut., 2675G/C

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Tabelle 8: Ausgewählte Sequenzierprimer. Nukleotidpositionen gemäß CYP21-Bank, M12792; M23280, V = Vorwärtsprimer, R = Rückwärtsprimer

Primer	Sequenz (5‘-3‘)	Position	Zweck	Punkt Mutation
P 7 R	CAA ggT ggA gcc TgT AgA Tg	1829-1849	Detektion v. 1767: C-T	Pro30Leu
P 8 V	Ccc Acc TcA gcc TcA AAg Tg	2170-2190	Detektion v. 2333: AA/AC-AG	12-Splice 8bpDel
P 9 R	Tac TTT cAg TTc Agg AcA A	2760-2779	Detektion v. 2677: T-A	Ile172Asn
P 10 V	GgA AgA ggg cTc Tgg AcA gc	3327-3347	Detektion v. 3361: G-T	Val281Leu
P 11 V	Ggc Tgc Tgg ggc Agg AcT	3620-3638	Detektion v. 3672: C-T	Gln318stop
P 12 R	Gcg gTg ggg cAA ggc TAA g	3801-3820	Detektion v. 3736: G-A Detektion v. 3786: C-T	Arg339HisArg356Trp
P 13 V	Tcc ccA ccc Acc TgT ccA c	4091-4110	Detektion v. 4256: C-T	Pro453Ser

2.2.3.7 DNA-Sequenzierung

Zur Untersuchungen von Punktmutationen (Tabelle 5) wurden die Amplifikate (2.2.3.6.) mit dem Sequenzierkit von USB (United States Biochemical, USA) nach der enzymatischen Kettenabbruchmethode von Sanger et al. (1977) sequenziert. Mit diesem Kit kann dopelsträngige DNA direkt sequenziert werden. Durch ein radioaktiv markiertes Nukleotid (³³P--dATP) konnten die Fragmente auf einem Röntgenfilm (X-Omat AR von Kodak) sichtbar gemacht werden.

Ein Überblick über verwendete Reagenzien bei der Sequenzierungsreaktion ist in der Tabelle 9 wiedergegeben.

Enzymatische Vorbehandlung des PCR-Produktes:

Nach der Konzentrationsbestimmung des Amplifikates mittels Massenstandard (Promega) wurden ca. 4 -7 µl Exonuclease I (10 U) mit 1 µl Alkalischer Phosphatase (2 U, Shrimp Alkaline Phosphatase) versetzt und bei 37°C für 15 min inkubiert, um den Überschuß an dNTP und Primern zu beseitigen. Danach erfolgte zur Inaktivierung der Enzyme eine Inkubation der Proben für 15 min bei 80°C.

Annealing des Primers:

Zur eisgekühlten, vorbehandelten Probe wurden 5-10 pmol/µl Primer hinzugefügt und Aqua bidestillata auf ein Volumen von 10 µl aufgefüllt. Nachdem die Probe gemischt und kurz zentrifugiert worden war, erfolgte die Denaturierung bei 100°C für 2-3 min. Danach wurde die Probe sofort für mindestens 5 min in Eiswasser gelagert, um das Annealing des Primers zu ermöglichen. Die ausgewählten Sequenzierprimer sind in Tabelle 3 dargestellt.

Markierungsreaktion (Labeling):

Zur eisgekühlten (annealten) Probe wurden 2 µl 5 x Reaktionspuffer (Reaction Buffer), 1 µl DTT, 2 µl 1 : 5 verdünnter Labeling Mix,. 0,5 µl ³³P--dATP (NEN-Du Pont) und 2 µl Sequenase (3,2 U) hinzugefügt. Dann wurde die Mixtur geschüttelt, zentrifugiert, 5 min lang bei Raumtemperatur aufbewahrt und anschließend mit 1 µl Mangan-Puffer (Mn Buffer) versetzt. Mit der Sequenase (Version 2.0 DNA Polymerase, USB) werden durch Mangan eine bessere Bandenuniformität und das Lesen bis an den Primer heran erreicht.

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Tabelle 9: Überblick über verwendete Reagenzien bei der Sequenzierungsreaktion

Reagenzien	Zusammensetzung und Konzentrationen
Exonuclease I	10 U/µl in 29 mM Tris-Salzsäure (pH-Wert 7,5), 5 mM 2-Mercaptoethanol, 50% Glycerol
Shrimp Alkaline Phosphatase	2 U/µl mM Tris-Salzsäure (pH-Wert 7,6), 1 mM Magnesium- chlorid, 0,1 mM Zinkchlorid, 50% Glycerol
Reaction Buffer	200 mM Tris-Salzsäure (pH-Wert 7,5), 100 mM Magnesiumchlorid, 250 mM Natriumchlorid
DTT	Dithiothreitol, 0,1 µM
Labeling Mix	7,5 M 7-deaza-dGTP, 7,5 µM dCTP, 7,5 µM dTTP
Sequenase	1,6 U/µl mit anorganischer Pyrophosphatase(2 U/µl) in 20 mM Tris-Salzsäure (pH-Wert 7,5), 2 mM Dithiothreitol, 0,1 mM EDTA, 50% Glycerol
Mangan Buffer	Mangan-Puffer, 0,15 Natriumisocitrat, 0,1 µM Manganchlorid
Stop Solution	95% Formamid, 20 mM EDTA, 0,05% Bromphenolblau, 0,05% Xylencyanol
Termination Mix	80µl dreier Deoxynukleotide, 80 µl des entsprechenden Didesoxynukleotids, 80 µM 7-deaza-dGTP und 50 mM Natriumchlorid

Kettenabbruchmethode:

Diese Methode beruht darauf, daß die Polymerisation der DNA in vitro an einem Einzelstrang immer dann abgebrochen wird, wenn die Elongation durch ein 2‘,3‘-Didesoxy-nucleosid-5‘-triphosphat (ddNTP) verhindert wird. Demgemäß wurden für eine Sequenzierung vier verschiedene Reaktionen mit jeweils einem anderen ddNTP durchgeführt. In die bereits mit einem entsprechenden Volumen von 2,5 µl Terminationsmix (ddA oder ddG oder ddT oder ddC) vorbereiteten und bei 37°C inkubierten Eppendorfgefäße wurden jeweils 3,5 µl der radioaktiv markierten Probe im gleichen zeitlichen Abstand hinzugegeben und danach für ca. 7 min inkubiert. Dann wurden 4 µl 2 x Stop-Lösung (Stop-Solution) stets im gleichen zeitlichen Abstand hinzupipettiert.

Sequenziergel:

Für die elektrophoretische Auftrennung der entstandenen Fragmente wurde ein 8%iges denaturierendes Polyacrylamidgel (s. Anhang) zwischen zwei vorbereitete, durch zwei 0,35 mm dicke Spacer getrennte Glasplatten (SA 60, Life technologies) gegossen, die durch ein Klebeband abgedichtet und mit einem Haifischkamm versehen waren. Die Glasplatten waren vorher mit Spülmittel, Aqua bidestillata und Ethanol gereinigt worden. Dann wurde die größere der beiden Platten mit einem Gemisch aus 5 ml 100%igem Ethanol, 175 ml 10%iger Essigsäure und 10 µl Haftsilan (Merck) benetzt und 5 min danach mit Aqua bidestillata und Ethanol abgerieben. Die andere Platte wurde mit 5 ml Gel-Slick (AT Biochem) benetzt und nach 5 min mit Aqua bidestillata poliert.

Das Gel wurde in eine Elektrophoresekammer (Gibco BRL) eingespannt und bei 70-80 Watt und maximal 3000 Volt auf ca. 50°C vorgeheizt, wobei als Puffer der 20 x Glycerol-Tolerant-Puffer (1 : 50 verdünnt, USB) Verwendung fand. Dann wurden 2,5 - 3 µl der vier Nukleotidgemische bei 70 - 80°C denaturiert und parallel aufgetragen (meist ACGT von links nach rechts). Der Elektrophoreselauf wurde bei 70 - 80°C gestartet. Anhand des Farbstoffes Xylencyanol konnte abgeschätzt werden, wie weit die Proben im Gel gelaufen waren.

Nach der Elektrophorese wurden die Platten voneinander getrennt, wobei die Platte mit dem darauf haftenden Sequenziergel für 20 min in 10%iger Essigsäure fixiert und sodann in Aqua bidestillata gewaschen wurde. Anschließend erfolgte das Trocknen des Gels bei 75°C für eine Dauer von 30 min. Zuletzt wurde es in einer Röntgenfilmkassette (Rego) unter einem Film (X-Omat) plaziert, wobei der Film mindestens 12 Stunden exponiert wurde. Nach dem Entwickeln des Filmes konnte die Sequenz des PCR-Produktes direkt abgelesen werden.

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2.3 Fluoreszenz -In Situ- Hybridisierung (FISH) und Chromosomenuntersuchung

Der Anlaß für die konventionelle Chromosomenanalyse und die FISH-Analyse war der Nachweis einer Translokation [t(2;10)(q13;q26)] bei zwei Schwestern mit PCOS (persönliche Mitteilung: Jutta Wirth, Max-Planck Institut, Berlin-Dahlem) wurden deshalb die PCOS-Patienten unserer Stichprobe daraufhin untersucht. Bei den Männern mit idiopathischer Oligospermie gehörte die Chromosomenanalyse zur klinischen Diagnostik der behandelnden Einrichtung. Bei den AGS-Patienten wurde auf eine Chromosomenanalyse verzichtet.

Das Ziel war, eine weitere Patientin mit der Translokation mit einem der beiden Bruchpunkte erfassen zu können.

Die Sonde für die FISH-Analyse (10q26: 3 cM) wurde vom Max-Planck-Institut zur Verfügung gestellt. Diese Untersuchungen wurden mit Zustimmung der Patientinnen durchgeführt.

300 - 500 ng Proben-DNA (YAC-Sonde 972a1) wurden mit Digoxigenin-11-dUTP (Boehringer-Mannheim) über Nick-Translation (Sambrook et al. 1989) markiert. Die CISS-(Chromosomen-in situ-Suppressions-) Hybridisierung wurde nach Protokoll von Lichter et al. (1988) unter Zugabe von 50 µg Cot 1-DNA- (Boehringer Mannheim), Kaninchen-anti-Maus-IgG-FITC (Fluorescein-Isothiocyanat) und Ziege-anti-Kaninchen-IgG-FITC (beide von Sigma) nach dem Protokoll von Pinkel et al. (1988) durchgeführt. Die Gegenfärbung der Metaphasechromosomen erfolgte mit Propidiumjodid (rot) und 4,6-Diamino-2-Phenylindol-Dihydrochlorid (blau). Die Präparate wurden in 90% Glycerin- 0,1% Phenylendiamin-Gemisch eingebettet. Zur Auswertung benutzten wir ein ZEISS Axiophot-Fluorenszenzmikroskop. Die Bilder wurden mit Hilfe einer digitalen hochauflösenden Kamera (Nu 200, Photometrics) unter Verwendung der SmartCapture^TM FISH-Software (Vysis GmbH, Stuttgart) aufgenommen.

2.4 Hormonanalytische Untersuchungen

2.4.1 Vorbemerkung:

Vor den molekulargenetischen Untersuchungen wurden bei den Stichproben mit PCOS und idiopathischer Oligospermie zunächst die hormonanalytischen Befunde mit Hilfe des ACTH-Tests erhoben.

2.4.2 -OH-Defizienz

Hinweise auf Funktionsstörungen der NNR können durch Anregung mit intravenös injiziertem synthetischen ACTH und Messung von Hormonparametern im Blutplasma erhalten werden. Spezifische Enzymdefizienzen sind durch den Konzentrationsanstieg von Zwischenstufen der Steroidsynthese in einer nach dem Test gewonnenen Blutprobe über den als normal geltenden Bereich gekennzeichnet. Basis für die in der vorliegenden Arbeit gewonnenen hormonanalytischen Hinweise auf partielle Defizienzen des adrenalen Enzyms 21-OH ist die Messung von 21-DOF-Konzentrationen in Blutplasmaproben nach ACTH-Injektion.

Die Analyse von Steroid- und Peptidhormonen erfolgte in Laboratorien des Institutes für Experimentelle Endokrinologie des Universitätsklinikums Charité der Humboldt-Universität zu Berlin. Tabelle 10 gibt die im Plasma oder Serum gefundenen Hormonwerte mit den dabei zur Anwendung gekommenen Verfahren und den gültigen Referenzwerten in SI-Einheiten wieder.

Um der Tagesrhythmik der Kortisolsekretion für die Untersuchungen relevanter Steroidhormone Rechnung zu tragen, war es notwendig, zuvor festgelegte Standardbedingungen einzuhalten. So mußten alle ACTH-Tests vormittags zwischen 7.30 und 11.00 Uhr erfolgen.

Die Patienten wurden über Vorgehensweise, Zweck und mögliche Nebenwirkungen der Untersuchung aufgeklärt und gaben mit ihrer Unterschrift die Zustimmung zur Durchführung und anonymen wissenschaftlichen Auswertung der Ergebnisse. Vor den Blutentnahmen wurden die Patienten gebeten, sich mindestens 10 Minuten auf einer Untersuchungsliege auszuruhen. So sollte ein streßbedingter Anstieg des Cortisols möglichst gering gehalten werden. Der Entnahme von Cubitalvenenblut in Monovetten der Fa. SARSTEDT schloß sich die langsame, intravenöse Injektion eines Gemisches aus 0,25 mg Synacthen® und 10 ml 0,9%iger NaCl-Lösung (Synacthen® der Fa. CIBA PHARMA, Wirkstoff: Tetracos-actid-hexaacetat-synthetisches Polypeptid mit ACTH-Wirkung) an. Eine Stunde post injectionem erfolgte nochmals eine Venenblutentnahme.

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- hormonanalytische Charakterisierung

Neben der Konzentrationsbestimmung von 21-DOF wurden Kortisolkonzentration nach dem ACTH-Test gemessenen und das Verhältnis von 21-DOF zu Kortisol (F) nach dem ACTH-Test errechnet.

T = 60 min nach 0,25 mg ACTH (1-24) i.v.

Die Verwendung von Q₁ ist sinnvoll, weil bei einer vorliegenden 21-OH-Defizienz von einem im Vergleich zum 21-DOF-Anstieg schwächeren Anstieg des Kortisols im ACTH-Test ausgegangen werden muß und somit durch die Bildung eines Quotienten der Posttestwert aus beiden Parametern eine bessere Diskriminierung zwischen Normalwerten und Werten, die auf eine Enzymdefizienz hinweisen, möglich ist.

Durch Anwendung dieses Quotienten erhielt Dörner (1991) Hinweise auf eine partielle 21-OH-Defizienz.

2.4.3 HSD-Defizienz

Erhöhte Basalwerte für DHEAS gelten als Marker für nichtklassische bzw. partielle 3-HSD-Defizienzen (Bongiovanni, 1962). Zusätzlich wurde der Quotient:

ausgewertet.

b = Basalwert

Psychischer Dauerstreß und andere Einflüsse können infolge der Anregung der NNR-Funktion zu erhöhten Werten für DHEAS und damit zu falsch positiven Hinweisen auf eine 3-HSD-Defizienz führen. Durch Verwendung von basalen Kortisolwerten in Q₂, die bei psychischem Streß erhöht sind, werden falsch positive Hinweise auf eine 3-HSD-Defizienz eliminiert.

Wie einleitend beschrieben, liegt die 3-HSD in Form von zwei Isoenzymen-TypI und TypII- vor. Die bisher beschriebenen Defizienzen des Enzyms betreffen immer die adrenal/gonadal wirksame 3-HSD-TypII, so daß ein Teil des in der NNR überproduzierten DHEA peripher durch die 3-HSD-TypI zu Androstendion umgesetzt wird. Für Androstendion können deshalb trotz einer partiellen 3-HSD-Defizienz normale oder sogar erhöhte Konzentrationen gefunden werden, so daß eine Quotientenbildung aus DHEAS und Androstendion zur Diagnostik der 3-HSD-Defizienz nicht sinnvoll wäre.

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Tabelle 10: Art und Methoden der in Laboren der Charité durchgeführten Hormonalysen mit entsprechenden Referenzwerten (* vor ACTH, **vor und nach ACTH ). Die Konzentrationen der Steroidhormone: F, 21-DOF, A, DHEA und DHEAS wurden mit laborinternen Methoden des Institutes für Experimentelle Endokrinologie der Charité bestimmt.

Hormone	Bestimmungsmethoden	Referenzwerte (basal)
Cortisol**	Kompetitive Proteinbindungsmethode	140-500 nmol/l
17-OHP**	125J RAA Kit (ImmuChem,ICN Biomedicals)	0,9-6,5 nmol/l
21-DOF**	Extraktion Säulenchromatographie an Celit, RIA	2,6-5,8 nmol/l
Androstendion*	Extraktion, Säulenchromatograghie an Celit, RIA	2,6-5,,8 nmol/l
DHEA*	Extraktion, RIA	8-44 nmol/l
DHEAS*	Solvolyse, Extraktion,RIA	2,3-8µmol/l
Testosteron*	Enzymimmunassay mit Magnettrenntechnik (Serono)	9-35 nmol/l
LH*	Immunenzymometrischer Assay mit Magnettrenntechnik (Serono)	1,5-10 mIU/ml
FSH*	Immunenzymometrischer Assay mit Magnettrenntechnik (Serono)	1-14 mIU/ml

2.4.4 Statistische Auswertung der Ergebnisse der Hormonanalysen

Die untersuchten Probandengruppen (PCOS und idiopathische Oligospermie, weibliche sowie männliche Kontrollen) stellten unabhängige Stichprobenkollektive dar.

Als Normalbereich wurde der Mittelwert + 2SD der Kontrollen gewertet. Die Steroidkonzentrationswerte der Probanden wurden mit dem Normalbereich der Kontrollgruppen zur Feststellung einer Enzymdefizienz verglichen. Einzelwerte von Kontrollpersonen, die bedeutend höher oder niedriger als der Normalbereich (>>MW + 2SD oder <<MW - 2SD) erschienen, wurden mit dem Dixon-Ausreißer-Test geprüft und nicht in die Berechnung einbezogen, wenn der Wert ein Ausreißer war.

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