Ghanaati, Zahra: Die Bedeutung partieller 21-Hydroxylase- und 3-Hydroxysteroiddehydrogenasedefizienzen für die Ätiopathogenese von Fertilitätsstörungen
Die Bedeutung partieller 21-Hydroxylase- und 3beta-Hydroxysteroiddehydrogenasedefizienzen für die Ätiopathogenese von Fertilitätsstörungen
D i s s e r t a t i o n

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)
im Fach Biologie

eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Biologisches Institut der Humboldt-Universität zu Berlin

Diplombiologin Zahra Ghanaati,
geboren am 19.9.1967 in Shiraz/Iran

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Jürgen Mlynek

Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. Bernhard Ronacher

Gutachter:
1. Gutachter: Prof. Dr. Regine Witkowski
2. Gutachter: Prof. Dr. Dr. h. c. Günter Dörner
3. Gutachter: Prof. Dr. Thomas Börner

Tag der mündlichen Prüfung: 12.03.2001

Zusammenfassung

Ziel der Untersuchungen war, zur Klärung der Ursachen einer während der letzten Jahrzehnte erhöhten Frequenz sowohl von PCOS als auch von IO beizutragen. Es war zu ermitteln, ob hormonelle Verschiebungen bei den Patienten nachweisbar und diese durch genetische und epigenetische Faktoren erklärbar sind.

Ausgehend von dem Postulat, daß verminderte 21-OH- und 3beta-HSD-Aktivitäten als prädisponierende Faktoren von PCOS und IO angesehen werden, waren hormonanalytische Untersuchungen zur Ermittlung partieller 21-OH- bzw. 3beta-HSD-Defizienzen durchgeführt worden.

Den eigenen Erfahrungen und Darstellungen der internationalen Literatur entsprechend befaßt sich ein Teil der Methodik mit der Entwicklung einer neuen, der üblichen 17alfa-OHP-Messung überlegenen Methode zur Ermittlung von 21-OH-Defizienzen durch 21-DOF-Bestimmung nach ACTH-Test im Blutplasma.

Wir erhielten bei vier von 21 PCOS-Patientinnen und drei von acht Patienten mit IO erhöhte 21-DOF-, 21-DOF/F- bzw. 17alfa-OHP-Werte nach ACTH-Test, die auf partielle 21-OH-Defizienzen hinweisen. Zusätzlich wurden bei 12 PCOS-Patientinnen erhöhte basale DHEAS- oder DHEAS/F-Werte gefunden, die als Hinweise auf partielle 3beta-HSD-Defizienzen oder 17,20-Lyase-Hyperaktivität gedeutet wurden. In der Stichprobe der IO waren DHEAS oder DHEAS/F-Werte bei vier Patienten erhöht. Da bei vier der 12 Patientinnen mit PCOS und zwei von vier Patienten mit IO genetisch und endokrinologisch gleichzeitig eine partielle 21-OH-Defizienz nachgewiesen wurde, kann bei diesen Patienten eine partielle 3beta-HSD-Defizienz weitgehend ausgeschlossen werden.

Es wurden molekulargenetische Untersuchungen für die 14 häufigsten Mutationen in CYP21 bei Cohorten mit AGS, PCOS und IO durchgeführt.

Die Untersuchung der AGS-Patienten sollte dazu dienen, ein effizientes und schnelles System der Mutationssuche für diagnostische Zwecke zu etablieren. Es wurden die häufigsten, phänotypisch wirksamen Mutationen in CYP21 bei der Mehrzahl dieser Patientengruppe im homozygoten bzw. compound heterozygoten Zustand gefunden und eine deutliche Genotyp-Phänotyp-Korrelation festgestellt.

Auch bei Patientinnen mit PCOS sowie bei IO, bei denen partielle 21-OH-Defizienzen nachweisbar waren, wurden Mutationen in CYP21 gefunden. Die hierbei heterozygot vorliegenden Mutationen waren dieselben, die homozygot oder compound heterozygot bei schweren Formen des AGS gefunden wurden. Es ergab sich eine Korrelation molekulargenetischer und hormonanalytischer Befunde bei AGS, PCOS sowie IO.

Allerdings konnten bei der Mehrzahl der Fälle mit PCOS und mit IO weder Mutationen noch hormonelle Auffälligkeiten hinsichtlich partieller 21-OH-Defizienzen gefunden werden. Die jedoch bei vielen Patientinnen gefundenen erhöhten DHEAS- und DHEAS/F-Werte stimmen mit Untersuchungen überein, die parallel starke Zunahmen der Häufigkeit der Hemmung des Enzyms 3ß-HSD bzw. der Aktivierung der 17,20-Lyase bei PCOS-Patientinnen und der Prävalenz des PCOS selbst bei nach 1955 geborenen Frauen und von Spermatogenesestörungen bei nach 1960 geborenen Männern fanden. Die Ursache hierfür wird in der Beeinflussung der adrenalen und gonadalen Steroidhormonsynthese vor allem durch das Umweltteratogen DDT und seine Metaboliten gesehen. Weiterhin wurde der Umweltfaktor Streß diskutiert. Für die Ätiopathogenese der untersuchten Fertilitätsstörungen werden materno-fetale Mechanismen postuliert, worauf unsere sowohl molekulargenetischen als auch hormonanalytischen Befunde hinweisen.

Insgesamt bestätigen die Ergebnisse unserer Arbeit die These, daß Leben auf der Interaktion von Genen und Umweltfaktoren beruht und daß Hormone dabei als Mediatoren wirken.

In gen- oder umweltbedingten unphysiologischen Konzentrationen können sie während kritischer Entwicklungsphasen des neuroendokrinen Systems als Teratogene wirken und zu lebenslangen Reproduktionsstörungen führen.

Abstract

This paper describes a mutational and hormonal screening in a cohort of 21 patients ultrasonically diagnosed with PCO. Our data show single heterozygous base pair CYP21 mutations in 4 patients. The four women with PCOS and CYP21 mutations also displayed clear signs of partial 21-hydroxylase deficiency through a significant rise in 21DOF or 17alfa-OHP plasma levels after ACTH stimulation. Azziz et al. have reported several heterozygous mutations in hyperandrogenic women with LO-CAH. Other studies report several heterozygous point mutations in hyperandrogenic woman who, however, were not examined for polycystic ovaries.The correlation between the hormone profiles and genetic screening results found with our patients underscores the latter‘s usefulness with PCOS patients. In contrast to the hormone profile, genetic screening is not influenced by external factors. The frequency of heterozygous CYP21 mutations is higher (19%) than in the normal population (5-8%), suggesting a link with PCOS in some cases.

The ratio of LH/FSH was significantly raised in 43% of the cases. Most importantly, basal plasma DHEA-S levels and DHEA-S/F ratios were clearly increased, higher than the means +2SD in controls. This suggests a partial 3beta-hydroxysteroid dehydrogenase deficiency or 17,20 lyase hyperactivity. Other authors, however, were not able to find mutations in the corresponding genes. This could be explained by the fact that the DDT metabolite o,p‘DDD is a strong inhibitor of 3beta-HSD, and that DDT and its metabolites may be able to activate the 17,20 lyase, a cytochrome P450 enzyme. Furthermore, DDT has some oestrogen activity, and its perinatal administration can produce a PCOS-like syndrome in rats.

Very significantly, there has not only been an approximately fourfold increased prevalence of PCO in women borne since 1955 in eastern Germany, following a massive prenatal exposure to DDT, but also a notable shift in the hormone profiles of those affected. A predominance of 3beta-HSD deficiencies and 17,20 lyase hyperactivity (70%) vs. 21-hydroxylase deficiency (23%) has emerged, in contrast with 21-hydroxylase deficiencies in 70% vs. 3beta-HSD deficiencies or 17,20 lyase hyperactivity in 14% for those born earlier than 1955. Similar results were obtained in this study for women with PCOS born since 1955, suggesting that the prenatal exposure of high amounts of DDT and its metabolites indeed appear to be responsible - at least in part - for the major increase in PCO and PCOS.

Keywords:
heterozygous mutations, partial 21-hydroxylase deficiency, partial 3ß-hydroxysteroid dehydrogenase deficiency, Polycystic Ovary Syndrome (PCOS)


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Inhaltsverzeichnis

TitelseiteDie Bedeutung partieller 21-Hydroxylase- und 3-Hydroxysteroiddehydrogenasedefizienzen für die Ätiopathogenese von Fertilitätsstörungen
Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis
1 Einleitung
1.1Das Adrenogenitale Syndrom (AGS)
1.1.1Historisches über AGS
1.1.2Klinische Formen des AGS
1.1.3Diagnostik des AGS
1.1.4beta-Hydroxysteroid-Dehydrogenase (3beta-HSD)-Defizienz
1.1.5Hormonanalytischer Nachweis der 3ß-HSD-Defizienz
1.1.6Häufigkeit und Vorkommen des AGS
1.2Das Polyzystische Ovar-Syndrom (PCOS)
1.2.1Definition und klinische Symptome des PCOS
1.2.2Häufigkeit des PCOS
1.2.3Ursachen und Diagnostik des PCOS
1.2.4Hormonbefunde bei PCOS
1.3Idiopathische Oligospermie
1.3.1Allgemeines über Fertilitätsstörungen des Mannes
1.4Aufgabenstellung
2 Stichprobenauswahl und Methodik
2.1Die Patientenkollektive
2.2Molekulargenetische Untersuchung
2.2.1Vorbemerkung
2.2.2Mutationsanalyse in CYP21
2.2.3Verfahrensschritte
2.2.3.1Präparation genomischer DNA aus Citrat- oder EDTA-Vollblut
2.2.3.2Präparation von Plasmid-DNA aus E.coli
2.2.3.3Southernblot-Hybridisierung
2.2.3.4Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)
2.2.3.5Mutationsanalyse der 8 bp-Deletion im Exon 3 mittels PCR
2.2.3.6Allelspezifische Oligonukleotid-Hybridisierung (ASO)
2.2.3.7DNA-Sequenzierung
2.3Fluoreszenz -In Situ- Hybridisierung (FISH) und Chromosomenuntersuchung
2.4Hormonanalytische Untersuchungen
2.4.1Vorbemerkung:
2.4.2-OH-Defizienz
2.4.3beta HSD-Defizienz
2.4.4Statistische Auswertung der Ergebnisse der Hormonanalysen
3 Ergebnisse
3.1Mutationen bei den Patienten mit AGS
3.2Ergebnisse der Untersuchungen bei der PCOS-Stichprobe
3.2.1Molekulargenetische Befunde
3.2.2Hormonanalysen
3.3Konventionelle Chromosomenanalysen und FISH- Analyse bei der PCOS-Stichprobe
3.4Idiopathische Oligospermie
3.4.1Mutationsanalyse
3.4.2Hormonanalytische Untersuchungen der Stichprobe idiopathische Oligospermie
3.5Vergleiche der molekulargenetischen und hormonanalytischen Befunde
4 Diskussion
4.1Überblick
4.2Stellungnahme zur Auswahl hormonanalytischer Methoden
4.3Stellungnahme zur Auswahl molekulargenetischer Methoden
4.4Mutationen im Bereich CYP21
4.4.1Rekombinationen
4.4.2Genkonversionen
4.4.3Hybridgene
4.4.4Punktmutationen
4.4.5Die Charakterisierung der gefundenen Mutationen in CYP21 in ihrer Häufigkeit
4.4.6Genotyp-Phänotyp-Korrelation bei AGS
4.4.7Mögliche Erklärungen für die phänotypische Variabilität beim AGS
4.5Diskussion der PCOS-Befunde
4.5.1Adrenale Enzymdefizienzen bei PCOS
4.5.2Interpretation der Molekulargenetik
4.6Diskussion der Befunde bei idiopathischer Oligospermie
5 Zusammenfassung
Bibliographie Literaturverzeichnis
Anhang A Materialien
Danksagung
Selbständigkeitserklärung

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Klinische Symptome, die häufig mit PCOS einhergehen (Quelle: Leidenberger, 1992).
Tabelle 2: Ursachen für Fertilitätsstörungen des Mannes nach einer Studie am Institut für Reproduktionsmedizin der Universität Münster; n=5000 (Niedschlag 1992)
Tabelle 3: Auswertung der Densitomitrie mit Hilfe Phospho Imager mit dem Computerprogramm TINA Version 2.09 (Fuji X, BAS 2000)
Tabelle 4: Verwendete PCR-Primer zur DNA-Amplifikation
Tabelle 5: Mutationen und deren Positionen auf dem CYP21, die in Stichproben von PCOS und idiopathischer Oligospermie untersucht wurden. Die Nukleotidpositionen sind gemäß CYP21-BANK, M12792, M23280 angegeben.
Tabelle 6: Optimierte PCR-Bedingungen der Fragmente in CYP21
Tabelle 7: Auswahl der verwendeten sense (s)- und antisense (as)- Primer für CYP21. Hyb: Hybridisierungstemperatur, WT: Wildtyp, Mut: Mutation, seq: Sequenzierung, splln2: Splice-Site-Mutation
Tabelle 8: Ausgewählte Sequenzierprimer. Nukleotidpositionen gemäß CYP21-Bank, M12792; M23280, V = Vorwärtsprimer, R = Rückwärtsprimer
Tabelle 9: Überblick über verwendete Reagenzien bei der Sequenzierungsreaktion
Tabelle 10: Art und Methoden der in Laboren der Charité durchgeführten Hormonalysen mit entsprechenden Referenzwerten (* vor ACTH, **vor und nach ACTH ). Die Konzentrationen der Steroidhormone: F, 21-DOF, A, DHEA und DHEAS wurden mit laborinternen Methoden des Institutes für Experimentelle Endokrinologie der Charité bestimmt.
Tabelle 11: Verteilung der die Krankheit verursachenden Allele bei den kaukasischen Patienten mit 21-OH-Defizienz in der AGS-Studie (n = 62).
Tabelle 12: Beispiele für die gefundene Genotyp-Phänotyp-Korrelation in der AGS-Studie.SVS: Patienten mit Salzverlussyndrom , SV: Patienten mit leicht virilisierender Form LO: Patienten mit late onset
Tabelle 13: die wichtigsten klinischen Befunde und Ergebnisse der Mutationsanalyse des CYP21 bei den PCOS-Patientinnen.
Tabelle 14: Basal- und ACTH-stimulierte Werte der PCOS-Patientinnen für 21-DOF, F, 17-OHP und errechneten Q1 = 100 x 21-DOFT / FT, T = nach ACTH-Test mit MW sowie SD der Kontrollgruppe, als Hinweise auf 21-OH-Defizienzen; *) > MW + 1SD, **) > MW + 2SD, ***) > MW + 3SD
Tabelle 15: Meßwerte für DHEAS, A basal und nach ACTH-Test und ermittelte Quotienten Q2 = DHEASb/Fb , bei Patientinnen mit PCOS mit MW und SD der Kontrollgruppe, als Hinweise auf partielle 3ß-HSD-Defizienzen
*) > MW + 1SD, **) > MW + 2SD , ***) > MW + 3SD
Tabelle 16: Basal- und ACTH-stimulierte Werte für 21-DOF, F, 17alpha-OHP und errechneten Q1 = 100 x 21-DOFA/FA , bei Patienten mit idiopathischer Oligospermie und der Kontrollgruppe sowie Ergebnisse des Mutationsscreenings für CYP21 (A = nach ACTH-Test). **) >MW + 2 SD
Tabelle 17: Meßwerte für DHEAS, A basal und nach ACTH-Test und ermittelte Quotienten Q2=DHEASb /Fb ,Q3 = DHEASb/Ab x 1000 bei Patienten mit idiopathischer Oligospermie sowie MW und SD der Kontrollgruppe; **) >MW + 2 SD
Tabelle 18: Ergebnisse der hormonanalytischen und molekulargenetischen Untersuchungen der Stichproben von PCOS und idiopathischer Oligospermie (IO), (+): 3beta-HSD-Defizienz unwahrscheinlich, da 21-OH-Defizienz vorhanden.
Tabelle 19: Punktmutationen in CYP21, die mit einer 21-OH-Defizienz einhergehen (Quelle: Strachan, 1994).

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Steriodhormonsysthese der Nebennierenrinde
Abbildung 2: Polyzystisches Ovar (links) und Schnittbild durch ein polyzystisches Ovar (rechts) mit zahlreichen subkapsulären Zysten (Quelle: Schmidt-Matthiesen/Hepp, 1998)
Abbildung 3: Transvaginalsonographische Darstellung des rechten Ovars bei einer 34jährigen Patientin mit PCOS: Durchmesser des Ovars 3,58 cm; typischer Follikelkranz und multiple Follikel kleiner als 10 mm. Zu erkennen ist eine angedeutete Verdickung der Tunica albuginea (Quelle; Frauenpoliklinik, Charité-HUB, 1998).
Abbildung 4: Pathogenese des PCOS modifiziert nach Barnes et al. 1994.
Abbildung 5: Schematische Darstellung der molekulargenetischen Methodik zur Untersuchung der CYP21(CYP21P / CYP21)
Abbildung 6: Gelelektrophoretische Auftrennung von PCR-Produkt Nr. I (1000 bp)
Abbildung 7: Gelelektrophoretische Auftrennung von PCR-Produkt Nr. II (1000 bp)
Abbildung 8: Gelelektrophoretische Auftrennung von PCR-Produkt Nr. III (2000 bp)
Abbildung 9: Schematische Darstellung der 30kb-Deletionen (links) und Genkonversionen (recht) in CYP21. Die genomische DNA wurde nach der Spaltung mit Restriktionsenzymen Taq I (3,2kb bzw. 3,7kb) und BglII (10kb bzw.12kb) unter Einsatz einer p21a/3c-Sonde hybridisiert. Die Auswertung erfolgte mittels Phospho-Imager mit dem Computerprogramm TINA Version 2.09 (Fuji X, Bas 2000). Signale für 30kb-Deletion (links): BgII: 10kb: 12kb = 2 : 1 und TaqI :3,2kb: 3,7kb = 2 : 1. Signale für Genkonversionen (rechts): BgII: 10kb : 12kb = 1 : 1 und TaqI:3,2kb : 3,7kb = 3 : 1 (PSL: photostimulated luminescence).
Abbildung 10: Autoradiogramm und Schematische Darstellung der Mutationsanalyse der 8-bp-Deletion im Exon 3 des CYP21 bei Patienten mit AGS.
Abbildung 11: Autoradiogramm der ASO-Hybridisierung von Exon 1 mit P30L Mutation bei einer AGS-Patientin mit nichtklassischer Form (late onset)
Abbildung 12: Ausschnitt aus CYP21 aus der Sequenzanalyse PCR II. Mit P8 als Sequenzierprimer detektierte Splice-Mutation bei einem Patient mit idiopatischer Oligospermie. Die Pfeile kennzeichnen die Punktmutation.
Abbildung 13: Ausschnitt aus CYP21 (Exon 4). Sequenzanalyse PCR II mit P 10 als Sequenzierprimer. Mutation Ile172Asn. Der Pfeil kennzeichnet die Punktmutation.
Abbildung 14: Die durch Alu-PCR amplifizierte und mittels Nick-Translation mit Biotin markierte YAC-Sonde wurde bei Verwendung von 300 ng Proben-DNA, 50 µg menschlicher COT-1 DNA und 50 µg Heringssperma-DNA pro Objektträger CISS hyridisiert. DAPI-Färbung ermöglichte die Lokalisation des FITC-Signals in der spezifischen Chromosomenregion.
Abbildung 15: Zwei alternative Stoffwechselwege von 17alpha-OHP zu F (nach Milewicz et al. 1984)

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Fri Sep 20 16:34:31 2002