2.  Material und Methoden

Untersucht wurden 11 Autopsien und 22 Biopsien von MS-Patienten aus den Jahren 1971 bis 1995, die aus dem neuropathologischen Institut der Universität Göttingen stammten, bzw. von Herrn PD Dr. M. Bergmann, Institut für klinische Neuropathologie des Zentralkrankenhaus Bremen-Ost, Herrn Prof. Dr. H. H. Goebel, Abt. Neuropathologie der Universität Mainz, Herrn Prof. Dr. F. Gullotta, Institut für Neuropathologie der Universität Münster, Herrn Prof. Dr. H. Lassmann, Institut für Neurologie der Universität Wien und Herrn Prof. Dr. U. Zettl, Nervenklinik der Universität Rostock, zur Verfügung gestellt wurden. Die Entnahme der Biopsien erfolgte aus den im MRT oder CT dargestellten Herden. Das Material wurde stereotaktisch oder im Rahmen einer offenen Biopsie (ein Fall) gewonnen, um damit Lymphome, Hirntumore oder eine Toxoplasmose bei klinisch/paraklinisch unklaren Fällen auszuschließen. Als Kontrollen dienten Gewebeproben von vier Feten und fünf Erwachsenen, die im Zeitraum von 1994 bis 1995 im Institut für Neuropathologie der Universität Göttingen seziert wurden. Ferner wurden DNA-Proben von 100 gesunden Kontrollen, 107 MS-Patienten mit einem RR-Verlauf und 49 Patienten mit PP-Verlauf untersucht. Die DNA der Kontrollgruppe wurde aus Blutproben der Blutbank der Charité gewonnen, die DNA der MS-Patienten aus PBMCs (peripheral blood mononuclear cells). Die Proben der RR-MS-Patienten wurden von der Arbeitsgruppe von Frau PD Dr. Frauke Zipp aus der Neurologischen Klinik der Charité Berlin, die Proben von Patienten mit primär progredienter MS von Prof. Dr. Rieckmann aus der Neurologischen Klinik der Universität Würzburg und Prof. Dr. Bein aus dem Institut für Immunologie der Universität Gießen zur Verfügung gestellt.

Durch immunhistochemische Verfahren können Antigene in histologischen Gewebepräparaten mit Hilfe von Antikörpern, Enzymen und Farbsubstraten nachgewiesen werden. Verschiedenste Proteine können durch eine Farbreaktion markiert und sichtbar gemacht werden. Für die vorliegende Arbeit wurden Primärantikörper gegen p53 (DAKO) und MOG (Myelin-Oligodendrozyten-[Seite 23↓]Glycoprotein, Dr. Piddlesden) eingesetzt. Mit der verwendeten APAAP (Alkalische-Phosphatase-anti-alkalische-Phosphatase)-Methode wird das zunächst farblose Farbsubstrat durch einen Enzym-anti-Enzym-Immunkomplex (bestehend aus zwei Molekülen alkalischer Phosphatase und einem dagegen gerichteten Antikörper) umgesetzt, nachdem dieser über einen Sekundärantikörper (anti-mouse-Ig) an den Primärantikörper gebunden hat (Abb. 2.1). Dabei wird im einzelnen wie folgt vorgegangen:

1. Die formalinfixierten und in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitte werden mit Xylol entparaffiniert und mit Hilfe einer absteigenden Isopropylalkoholreihe rehydriert (3mal 100 %, 2mal 90 %, 70 %, 50 % und 30 % für jeweils 5 min).
2. Für den p53-Antikörper ist eine weitere Vorbehandlung nötig. Die Schnitte werden mit Zitronenpuffer (pH 6, bestehend aus Citronensäure-1-hydrat und HCl) für 3mal 5 min in der Mikrowelle gekocht.
3. Vor dem Auftragen des Primärantikörpers werden die Gewebeproben 20 Minuten mit Milchpulver (4 %) inkubiert, um unspezifische Hintergrundreaktionen zu vermeiden.
4. Der Primärantikörper gegen p53 wird im Verhältnis 1:40 mit BSA (0,1 %) verdünnt, auf die Proben pipettiert und für eine Stunde inkubiert. Genauso wird mit dem Sekundärantikörper (Anti-mouse-Ig) und dem APAAP-Komplex verfahren, zwischen den einzelnen Schritten wird mit PBS 3mal vorsichtig gespült, um ungebundene Immunkomplexe zu entfernen. Alle Inkubationen erfolgen bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer. Als Positivkontrolle dient lymphatisches Gewebe der menschlichen Tonsille, für die Negativkontrolle wird anstelle des Primärantikörpers 0,1 % BSA aufgetragen.
5. Nach der Inkubationsphase mit dem APAAP-Komplex werden die Schnitte mit dem Farbsubstrat (bestehend aus 50ml NBT/BCIP-Entwicklungspuffer, 225 μl NBT (5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-Phosphate) und 175 μl BCIP (4-Nitro blue tetrazolium chloride) in 12, 144 g TRIS, 5,844 g NaCl, 10,165 g MgCl₂ und 1 l Aqua bidest.) für ca. 30-60 min lichtgeschützt bei 4°C inkubiert. Sobald eine ausreichende Farbintensität erreicht ist, wird mit PBS gespült.
6. Vor der Inkubation mit dem zweiten Primärantikörper (anti-MOG) über Nacht wird erneut für 20 min mit Milchpulver (4 %) blockiert.

1. Nach dem zweiten Primärantikörper (anti-MOG) werden die Sekundärantikörper (anti-mouse-Ig, 1:40 in 0,1 % BSA) aufgetragen und für 60 min inkubiert, anschließend werden die Schnitte wiederum für 60 min mit dem APAAP-Immunkomplex inkubiert.
2. Als Farbsubstrat dient eine Lösung aus Levamisole (20 mg auf 35 ml Entwicklungspuffer und 12,5 ml Propandiol), Natriumnitrit (10mg auf 250 ml Aqua bidest. Und 100 μl Neofuchsin) und Naphtol-as-Biphosphat (14 mg auf 300μl Dimethylformamid), die mit 1 M Salzsäure auf pH 8,8 eingestellt wird.
3. Nach Entfernung der ungebundenen APAAP-Komplexe durch Spülen mit PBS-Waschpuffer werden die Objektträger mit den Gewebeschnitten für ca. 30 min unter ständiger Bewegung in der Küvette belassen. Sobald eine ausreichende Farbintensität erreicht ist, werden die Gewebeschnitte herausgenommen und mit Aqua bidest. gespült, um die Farbreaktion zu beenden, und mit Aquamont eingedeckt.

	Abb. 2.1: Prinzip der APAAP-Methode

Bei der Methode des In Situ Tailing handelt es sich um ein Verfahren, mit dem DNA-Fragmente sichtbar gemacht werden können. Das Enzym Terminale Transferase katalysiert in einer Template-unabhängigen Reaktion die Verknüpfung von Desoxyribonukleotidtriphosphaten (dNTPs) mit 3´Hydroxylenden von Einzel- oder [Seite 25↓]Doppelstrang-DNA-Molekülen unter Freisetzung von anorganischem Phosphat. Ein Teil der dNTPs ist mit dem Steroidhapten Digoxigenin markiert. Mit Hilfe eines mit alkalischer Phosphatase konjugierten Anti-Digoxigenin-Antikörpers, der in einem späteren Schritt mit einem Farbsubstrat reagiert, können so bei apoptotischem Zelluntergang entstehende DNA-Fragmente sichtbar gemacht werden:

1. Die Gewebeproben werden zunächst mit Proteinase K (50 bzw. 100μg ml^-1) für 15 min bei 37°C inkubiert. Anschließend wird mit eiskaltem TBS 5 min gespült, um die Proteinase zu inaktivieren.
2. Auf die Gewebeproben wird dann der Tailingmix (bestehend aus 60 μl Tailingpuffer, 12 μl CoCl₂, 3 μl DIG-DNA, 1,5 μl Terminale Transferase und 223,5 μl Aqua bidest), der bei einem Volumen von 300 μl für 4 Objekträger ausreicht, aufgetragen. Die Schnitte werden mit einem Deckgläschen bedeckt, um sie vor dem Austrocknen zu schützen und für 60 min bei 37°C inkubiert.
3. Nach Spülung mit TBS und Abschwimmen der Deckgläschen wird mit 100 %igem FCS (fetales Kälberserum) blockiert und der Anti-Digoxigenin-Antikörper (1:250 in 10 %igem FCS verdünnt) aufgetragen und für 60 min bei Raumtemperatur inkubiert.
4. Nach Spülung mit TBS werden die Objekträger für ca. 5-30 min mit dem Chromogen NBT/BCIP lichtgeschützt inkubiert, bis eine ausreichende Farbreaktion erreicht ist.

Die Extraktion der DNA aus heparinisiertem Vollblut bzw. PBMCs erfolgte nach dem QIAamp Blood Kit Protokoll der Firma QIAGEN:

1. Zu 200μl Vollblut bzw. Zellpellet werden 200μl PBS (Phosphate buffered saline) in ein 1,5ml Eppendorfgefäss gegeben.
2. Zugabe von 25μl QIAGEN Proteinase K und 200μl Puffer AL und umgehendes Mischen des Ansatzes durch vortexen für 15sec.
3. Dieser Ansatz wird für 12 h bei 56 °C inkubiert.
4. Zugabe von 200μl Ethanol (96-100 %) und erneutes Mischen.
5. Plazieren einer QIAmp Zentrifugier-Säule in ein 2ml Sammelgefäss und aufbringen der Lösung aus Schritt 4 auf die Säule. Nach Schließen des Deckels Zentrifugation bei 8000 min^-1 für 1 min. Verwerfen des Sammelgefässes samt Inhalt und Plazieren der Säule in sauberes 2ml-Sammelgefäss.[Seite 26↓]
6. Nach vorsichtigem Öffnen der Säule Zugabe von 500μl Waschpuffer AW erneutes Zentrifugieren bei 8000 min^-1 für 1 min und Verwerfen desEluats.
7. Nach Zugabe von 500 μl Puffer AW Zentrifugieren bei 13000 min^-1 für 3 min.
8. Plazieren der Säule in ein neues 1,5 ml Eppendorf-Gefäss nach Verwerfen des 2ml Sammelgefäßes samt Inhalt.
9. Vorsichtiges Öffnen der QIAamp Säule und Zugabe von 200 μl Puffer AE und Inkubation für 1 min bei Raumtemperatur. Zentrifugation bei 8000 min^-1 für 1 min.

Mit der Methode der PCR ist es möglich, gezielt bestimmte DNA-Abschnitte zu vervielfältigen. Voraussetzung dafür ist zunächst die Kenntnis der Bereiche, die die Zielsequenz einrahmen. Komplementär zu diesen können dann Oligonukleotide als Forward- und Reverse-Primer konstruiert werden. Nach Zugabe einer geeigneten DNA-Polymerase, dNTPs, MgCl, eines Puffers sowie der Primer-Oligonukleotide (Tabelle 2.1) kann das gewünschte Fragment mit Hilfe eines Thermocyclers nach folgendem Schema bei variablen Zeiten und Temperaturen vervielfältigt werden:

1. Zunächst wird die doppelsträngige DNA initial 5 min bei 94°C denaturiert.
2. Im Rahmen des nun folgenden Zyklus wird nun nochmals bei 94°C für 1 min denaturiert, um den Primern und der DNA-Polymerase die Anlagerung an die Einzelstränge zu ermöglichen.
3. Bei einer Temperatur zwischen 50 °C-70 °C gibt man den Primern für die Dauer von 45 sec die Möglichkeit, sich an die Einzelstränge anzulagern.
4. Die Synthese des jeweils komplementären Stranges erfolgt bei 72 °C für 1 min.
5. Nach Ende des Zyklus, der 25-35 mal wiederholt wird, gibt man der DNA-Polymerase bei 72 ° C 10 min lang die Möglichkeit, begonnene Stränge zu Ende zu synthetisieren.

Die Annealing-Temperatur in Schritt 3 mußte für jeden Primer individuell festgelegt werden und ist aus Tabelle 2.2. ersichtlich. Um Erfolg und Reinheit der jeweiligen PCR zu überprüfen, erfolgt eine Agarosegelelektrophorese.

Mit Hilfe der SSCP–Analyse ist es möglich, Polymorphismen und Mutationen in DNA-Einzelsträngen schnell und einfach nachzuweisen. Dabei macht man es sich zu Nutze, dass die Einzelstränge unter nicht denaturierenden Gelbedingungen nicht linear, sondern durch intramolekulare Basenpaarungen in gefaltetem Zustand vorliegen. Bereits ein Basenaustausch pro Strang reicht dabei für ein unterschiedliches Laufverhalten aus. Die Spezifität soll bei Fragmenten mit einer Länge von 200 bp annähernd 100 % betragen (Sarkar et al. 1992). Laufzeit, Leistung, Vernetzung und Acrylamidkonzentration müssen für verschiedene DNA-Abschnitte jeweils einzeln optimiert werden (Tabelle 2.3). Um die Auftrennung der Einzelstränge zu verbessern kann Glycerin beigemischt werden.

Die Zubereitung der Polyacrylamidgele erfolgte folgendermaßen:

1. Säuberung der Glasplatten mit Alconox-Spülmittel und Ethanol (100 %).
2. Aufbringen und sorgfältiges Verreiben einer Silan-Chloroform-Lösung (5 %).
3. Nach Einlegen eines Spacers Fixierung der beiden Glasplatten mit Klammern.
4. Zwischen die beiden Glasplatten wird nun die vorbereitete Mischung aus Acrylamid, 2,2´Bisacrylamid, TBE (1 %ig, bestehend aus Trizma, Borsäure und EDTA) und Aqua bidest. gegossen. Zur Einleitung der Polymerisationsreaktion werden als Starter vorher 400 μl APS (Ammoniumpersulfat) und 40 μl TEMED (N,N,N´,N´-Tetramethylethylendiamine) zugegeben.
5. Nach Applikation des flüssigen Polyacrylamidgels Einlegen eines 40fachen Zahnkamms.
6. Die Polymerisation erfolgt bei Raumtemperatur für 60 min.
7. Nach Entfernung der Klammern und Ziehen des Kammes können die Glasplatten in die Elektrophoresekammer gestellt werden und die Proben in die Taschen pipettiert werden.

Nach Abschluß der Elektrophorese werden die DNA-Banden mit Hilfe einer Silberfärbung sichtbar gemacht und die Gele nach Aufziehen auf Papier für zwei Stunden bei 80°C vakuumgetrocknet.

Die Silberfärbung erfolgte nach folgendem Protokoll:

1. Fixieren der DNA im Gel mit 10%iger Ethanollösung für 10 min.
2. Einstellung eines sauren pH-Wertes mit 1 %iger Salpetersäure für 30 sec
3. Einmaliges Spülen mit Aqua bidest.
4. Färbung (Ag-Anlagerung an DNA) mit 0,2 %iger Silbernitratlösung über 20 min.
5. Dreimaliges Spülen mit Aqua bidest.
6. Entwicklung (Fällung des metallischen Silbers) mit 3 %iger NaCO-Lösung bis die Banden sichtbar werden.
7. Stoppen der Färbereaktion mit 10 %iger Essigsäure bis sich Blasen unter dem Gel bilden.
8. Trocknen auf dem Geltrockner für ca. 2 Stunden.

Die Extraktion von DNA-Banden aus einem Polyacrylamidgel ist notwendig, um den vermuteten Polymorphismus bzw. die Mutation in DNA-Strängen später mit Hilfe einer Sequenzierung nachweisen zu können. Ein zusätzlicher Vorteil dieser Methode besteht darin, dass der jeweilige Einzelstrang nun in nahezu reiner Form ohne größere Verunreinigung mit der vorher vorhandenen genomischen DNA vorliegt.

Die Isolierung und Aufreinigung geschieht mit Hilfe des QIAGEN Purification Kits wie folgt:

1. Möglichst exaktes Ausschneiden der Banden und Einbringen in je ein vorher beschriftetes 500 μl Eppendorfgefäss mit einem sterilen Skalpell.
2. Zugabe von 100 μl Diffusionspuffer bestehend aus jeweils 25 μl Ammoniumacetat (0,5 M), Magnesiumacetat (10 mM), EDTA (1 mM, pH 8) und SDS (0,1 %, Sodiumdodecylsulfate).
3. Inkubation bei 50°C für 30 min im Thermomixer.[Seite 29↓]
4. Zentrifugieren des Ansatzes bei 13000 min^-1 für 1 min.
5. Zugabe von 300 μl Puffer QG als pH-Indikator.
6. Aufbringen des Ansatzes ohne die Gelbande auf QIAGEN Zentrifugiersäule, Hineinstellen in 2 ml Sammelgefäss und Zentrifugieren bei 13000 min^-1 1 min. Verwerfen des Filtrats.
7. Waschen der DNA durch Zugabe von 750 μl Puffer PE (bestehend aus 20 mM NaCl, 2mM Tris-HCl in Ethanol) und zweimaliges Zentrifugieren unter zwischenzeitlichem Verwerfen des Filtrats bei 13000 min^-1 für 1 min.
8. Plazieren der Säule in ein vorher beschriftetes 1,5 ml Eppendorf-Gefäss und Zugabe von 30μl Puffer EB(bestehend aus 10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8,5). Inkubation für 1 min bei Raumtemperatur. Herauslösen der DNA aus dem Filter durch erneutes Zentrifugieren bei 13000 min^-1 für eine min.

Die so gewonnene DNA kann ohne weitere Aufbereitung für die nun folgende PCR zur Vervielfältigung für die nachfolgende Sequenzierung (4facherAnsatz, sonst wie oben) verwandt werden.

Nach erfolgter erfolgreicher PCR (Prüfung durch Agarosegelelektrophorese) müssen die DNA-Proben nun von noch vorhandener genomischer DNA und sonstigen Verunreinigungen mit Hilfe des QIAGEN Purification Kit befreit werden:

1. PCR-Produkt mit 175 μl Puffer PB (bestehend aus 3M Guanidin-Thiocyanat, 10mM Tris-HCl, 5% Ethanol, pH 6,6) versetzen und auf Reinigungssäule aufbringen. Zentrifugieren bei 13000 min^-1 für eine min. Verwerfen des Filtrats.
2. Zugabe von 750 μl Puffer PE und zweimaliges Zentrifugieren unter zwischenzeitlichem Verwerfen des Filtrats bei 13000 min^-1 für 1 min.
3. QIAGEN-Säule in vorher beschriftetes Eppendorfgefäss stellen und Zugabe von 30 μl Puffer EB. Inkubation bei Raumtemperatur für 3 min. Zentrifugieren bei 13000 min^-1 für 1 min.

Die so gereinigte DNA kann nun ohne weitere Aufbereitung dem nun folgenden Cycle-Sequencing zugeführt werden.

Die DNA-Sequenzierung erfolgte nach der Methode nach Sanger mit farbmarkierten ddNTPs. Die DNA-Polymerase verlängert dabei während des Cycle-Sequencing die Forward- und Reverse-Primer entlang der einzelsträngigen Matrize solange, bis durch den Einbau eines Didesoxynukleotids anstelle eines normalen Nukleotids ein zufälliger Strangabbruch erfolgt. Es entstehen so unterschiedlich lange DNA-Stränge an deren Ende sich jeweils eines der vier unterschiedlich markierten Didesoxynukleotide befindet. Das Prinzip des Cycle-Sequencing ist in Abb. 2.2 verdeutlicht.

Nach erfolgreichem Cycle-Sequencing muss die amplifizierte DNA nochmals gereinigt werden um unerwünschte PCR-Reagentien zu entfernen:

1. Zubereitung einer Sephadex-Lösung mit 55 mg Sephadex und 700 μl Aqua bidest. je Probe. Ansatz bei 4°C für 12 h quellen lassen.
2. Aus obigem Ansatz werden je 700 μl in eine Säule pipettiert und zur Entfernung etwaiger Luftblasen nach Anbringen von Boden und Deckel gevortext.
3. Inkubation bei Raumtemperatur für einige Minuten, bis eine Phasentrennung sichtbar wird.
4. Nach Abnehmen von Boden und Deckel Plazieren der Sephadex-Säule in ein 2 ml Auffanggefäss und Zentrifugation bei 3000 min^-1 für 2 min. Verwerfen des Filtrats.
5. Plazieren der Sephadex-Säule in ein vorher beschriftetes 1,5 ml Eppendorf-Gefäss. Aufbringen der Probe auf den Sephadex-Säule. Zentrifugieren bei 3000 min^-1 für 2 min.
6. Inkubation der Probe bei 70 °C in Thermomixer bei geöffnetem Deckel bis die Flüssigkeit verdunstet ist.

Die anschließende Sequenzierung wurde mit dem ABI PRISM^TM 377 Trennsystem durchgeführt.

Vorbehandlung der Glasplatten:

1. Reinigung mit Alconox-Detergenz und Spülen mit Aqua bidest.
2. Nachbehandlung mit 10 %igem Isopropanol.
3. Nach dem Trocknen Auflegen der Spacer und Zusammensetzen der Glasplatten.

Ansetzen des 4.5 %igen Polyacrylamidgels/6M Harnstoff:

1. Mischen der 30 %igen Acrylamidlösung (7,5 ml) mit 10 %igem TBE-Puffer (6 ml) und bidest. Wasser (23 ml).
2. Unter Erwärmen Lösung des Harnstoffs (18 g).
3. Filtrieren und Entgasen durch einen 0,2 μm Filter.
4. Überführen der Lösung in ein 150 ml Becherglas.
5. Zugabe von 20 μl TEMED und 350 μl APS (10 %ig).
6. Gießen der Lösung zwischen die vorbereiteten Glasplatten und Einsetzen eines Kammes. Anschließend Polymerisation über 1 h.

Nach dem Einsetzen der Glasplatte in den Sequenzierapparat und dem Einbringen des 1 %igen TBE-Laufpuffers in die vorgesehenen Kammern kann mit dem Auftragen der Proben begonnen werden:

1. Lösung der Proben in 2 μl Formamid-EDTA-Lösung (25 mM, pH 8,0).
2. Inkubation bei 90 °C für 2 min in Thermomixer.
3. Abkühlen der Proben auf Eis.
4. Auftragen von 1 μl pro Probe auf das Gel.

	Abb. 2.2: Prinzip des Cycle-Sequencing (schematisch)

Tabelle 2.1: Primersequenzen und Länge der Fragmente

Tabelle 2.2: Primerannealingtemperaturen

Tabelle 2.3: SSCP-Gelbedingungen