3.  Ergebnisse

Für die vorliegende Studie wurden MS-Fälle mit aktiv-demyelinisierenden Läsionen des Subtyps I und II mit Oligodendrozytenerhalt (sechs Fälle mit 15 Läsionen) und des Subtyps III und IV (16 Fälle mit 33 Läsionen) mit einem Verlust von Oligodendrozyten untersucht. Mittels immunhistochemischer Detektion konnte p53 in MS-Läsionen in Oligodendrozyten nachgewiesen werden. In den Fällen des Subtyps I und II fanden sich nur einige wenige p53-positive Oligodendrozyten. Ungefähr 4% der MOG-positiven Oligodendrozyten exprimierten auch p53. Dagegen fand sich in Fällen mit Oligodendrozytenverlust ein weitaus höherer Anteil p53-positiver Oligodendrozyten, nämlich 41,2% (Tabelle 3.1). Diese p53-positiven Zellen konnten in allen Stadien der Demyelinisierung nachgewiesen werden, mit der größten Anzahl in aktiv demyelinisierenden und remyelinisierenden Läsionen. Da der immunhistochemische Nachweis von p53 bei normalen Konzentrationen in Oligodendrozyten nicht gelingt, kann daraus auf eine vermehrte Expression von p53 in diesen Zellen geschlossen werden. In Muster-III-Läsionen ist die Demyelinisierung mit einem apoptotischen Untergang von Oligodendrozyten assoziiert. Hier fanden sich die p53-positiven Oligodendrozyten im aktiv-demyelinisierenden Bereich der Läsionen, in denen gleichzeitig Oligodendrozyten durch Apoptose zerstört wurden. In Fällen des Musters IV mit primärem Untergang von Oligodendrozyten in der weißen Substanz, die den Plaque umgibt (PPWM), zeigte sich eine DNA-Fragmentierung in Oligodendrozyten in der PPWM zusammen mit einer ausgeprägten Expression von p53 (Abb. 3.1-3.6).

Tabelle 3.1: Anteil der p53-exprimierenden Oligodendrozyten

	Abb. 3.1-3.3: Entmarkende Läsion vom Muster III. Abb. 3.1.: In der Immunhistochmie für MOG erkennt man Makrophagen mit MOG-positiven Myelinabbauprodukten sowie MOG-positive apoptotische Oligodendrozyten. Abb. 3.2,+3.3: Die Doppelimmunhistochemie für MOG (rot) und p53 (schwarz) zeigt p53-positive Oligodendrozyten. Abb. 3.4-3.6: Entmarkende Läsion vom Typ IV. Die großen Pfeile markieren die Läsionsgrenze. Abb. 3.4: Die in situ Hybridisierung für PLP mRNA zeigt einen Verlust von Oligodendrozyten in der Läsion. Abb. 3.5+3.6: Der Nachweis der DNA-Fragmentation (schwarz) zeigt MOG-positive zugrundegehende Oligodendrozyten (rot) in der dem Plaque benachbarten weißen Substanz. p53 kolokalisiert mit den zugrundegehenden Oligodendrozyten.

Untersucht wurde die DNA von 100 Kontrollen sowie von 107 Patienten mit RR-MS und 49 Patienten mit PP-MS. Dabei beschränkte man sich auf die Exone der DNA- bindenden Region (Exon 5-8). Tabelle 3.2 zeigt die Ergebnisse der SSCP-Analyse der verschiedenen Exone des p53-Proteins. Lediglich in Exon 6 und 7 fanden sich Polymorphismen. Hier zeigte sich in der Häufigkeit des Auftretens kein signifikanter Unterschied zwischen Kontrollen und RR-MS- bzw. PP-MS-Patienten (Abb. 3.7-3.11).

Tabelle 3.2: Ergebnisse des SSCP

	Abb.3.7: SSCP von p53 Exon 5a

	Abb. 3.8: SSCP von p53 Exon 5b: Wildtyp

	Abb. 3.9: SSCP von p53 Exon 6: Wildtyp und heterozygoter Polymophismus

	Abb. 3.10: SSCP von p53 Exon 7: Wildtyp und heterozygoter Polymorphismus

	Abb. 3.11: SSCP von p53 Exon 8: Wildtyp

Die Sequenzierung des Polymorphismus in Exon 6 zeigte, dass es sich um den bereits bekannten Polymorphismus in Codon 213 handelte, der mit einer Prävalenz von bis zu 11% in der Bevölkerung auftritt (Carbone et al. 1991) und in der vorliegenden Untersuchung stets in heterozygoter Form auftrat (Abb. 3.12). Die Base Adenin im Wildtyp ist durch die Base Guanin im Polymorphismus ersetzt. Aus dem Codon CGA wird so das Codon CGG. Da beide für die Aminosäure Arginin codieren, entsteht durch diese Veränderung kein Shift auf Ebene der Aminosäuresequenz. Das p53-Protein wird demzufolge durch diese Veränderung auf Ebene der DNA-Sequenz auch nicht in seiner Sequenz/Primärstruktur verändert.

In Exon 7 war in einem Kontrollfall in Codon 237 die Base Adenin im Wildtyp durch die Base Guanin im Polymorphismus ausgetauscht (Abb. 3.13). Dieser Polymorphismus lag ebenfalls in heterozygoter Form vor. Aus dem Codon AAC wird so das Codon AGC. Auf Ebene der Aminosäuresequenz wird die Aminosäure Asparagin durch die Aminosäure Serin ersetzt (Tabelle 3.3).

Tabelle 3.3: Ergebnisse der Sequenzierung

	Abb. 3.12: Sequenzveränderung des Polymorphismus in Exon 6 (Codon 213)

	Abb. 3.13: Sequenzveränderung des Polymorphismus in Exon 7 (Codon 237)

Vergleicht man die relative Häufigkeit des Auftretens von Sequenzveränderungen in Kontrollen und MS-Patienten sowie in den verschiedenen Verlaufsformen (RR- bzw. PP-MS), so ergibt sich kein Unterschied. Die gefundenen Polymorphismen scheinen dementsprechend also keinen Einfluss auf die Verlaufsform der MS zu besitzen.

Es besteht eine signifikante Assoziation zwischen Oligodendrozytendestruktion und Expression von p53 in Oligodendrozyten in MS-Läsionen (p<0,0001; Fisher´s exact Test). Eine mögliche Ursache für das vermehrte Vorkommen von p53 in Oligodendrozyten in bestimmten MS-Läsionen könnten Mutationen im p53-Gen sein. Da diese Feststellung alleine keine Aussage über einen kausalen Zusammenhang zwischen Oligodendrozytenverlust und p53-Expression zuläßt, wurden Blutproben von MS-Patienten und Kontrollen auf das Auftreten von p53-Polymorphismen hin untersucht. Zumindest in der Region für der für die Funktion des Proteins wichtigsten Abschnitte (Exon 5 – Exon 8) fanden sich keine Unterschiede zwischen den verschiedenen Populationen.