Aus dem Institut für Neuropathologie
der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

Dissertation

„Mutationsanalyse im p53-Gen bei
Patienten mit Multipler Sklerose“

Zur Erlangung des akademischen GradesDoctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

von

Michael Glas
aus Bayreuth

Dekan: Dekan: Prof. Dr. Joachim W. Dudenhausen

Gutachter:
1. Prof. Dr. med. W. Brück
2. Prof. Dr. med. F. Zipp
3. Prof. Dr. med. P. Rieckmann

Datum der Promotion: 31.10.2003

Inhaltsverzeichnis

• 1.  Einleitung
  • 1.1. Multiple Sklerose
    • 1.1.1. Definition der Multiplen Sklerose
    • 1.1.2. Epidemiologie
    • 1.1.3. Genetische Einflüsse
    • 1.1.4. Klinische Symptomatik und Diagnostik
    • 1.1.5.  Verlaufsformen
    • 1.1.6. Therapie der MS
  • 1.2.  Histopathologie
    • 1.2.1. MS-Plaques
    • 1.2.2. Oligodendrozytenpathologie der MS
    • 1.2.3. Immunpathologie der MS
  • 1.3. Apoptose
    • 1.3.1. Die Apoptosekaskade
    • 1.3.2. Apoptose von T-Zellen in MS und EAE
    • 1.3.3. Apoptose und Oligodendrozyten
  • 1.4. p53
    • 1.4.1. Struktur, Regulation und Funktion
  • 1.5. Aufgabenstellung
• 2.  Material und Methoden
  • 2.1. Material
  • 2.2. Immunhistochemie
  • 2.3. In Situ Tailing
  • 2.4. DNA-Extraktion aus Blutproben
  • 2.5. PCR
  • 2.6. SSCP
  • 2.7. DNA-Extraktion aus Polyacrylamidgelen
  • 2.8. DNA-Sequenzierung
  • 2.9. Bezugsquellen der Reagentien
  • 2.10.  Tabellen
• 3.  Ergebnisse
  • 3.1. Immunhistochemische Detektion von p53 in MS-Läsionen
  • 3.2.  Ergebnisse des SSCP
  • 3.3.  Ergebnisse der Sequenzierung
  • 3.4. Korrelation von Verlaufsformen der MS und p53-Polymorphismen
  • 3.5. Zusammenfassung der Ergebnisse
• 4.  Diskussion
  • 4.1. Die Expression von p53 in Oligodendrozyten bei Multipler Sklerose
  • 4.2. p53-induzierter Zelltod in Tumor- und Autoimmunerkrankungen
  • 4.3. Mögliche Bedeutung der veränderten Expression von p53 in der MS
  • 4.4. Bedeutung von Polymorphismen im p53-Gen für die MS
  • 4.5.  Korrelation der histopathologischen Subtypen mit p53-Expression
• 5. Zusammenfassung
• Literatur
• Danksagung

Tabellen

• Tabelle 2.1: Primersequenzen und Länge der Fragmente
• Tabelle 2.2: Primerannealingtemperaturen
• Tabelle 2.3: SSCP-Gelbedingungen
• Tabelle 3.1: Anteil der p53-exprimierenden Oligodendrozyten
• Tabelle 3.2: Ergebnisse des SSCP
• Tabelle 3.3: Ergebnisse der Sequenzierung

Bilder

• Abb.1.1: Apoptoseregulation schematisch: Im wesentlichen sind zwei Hauptwege der Apoptoseinduktion bekannt. Zum einen führt die Aktivierung von Caspasen via Todesrezeptoren über eine Serie von Protein-Protein-Interaktionen zum programmierten Zelltod. Zum anderen mündet die Freisetzung von Cytochrome C und APAF-1 über die Aktivierung von Caspase-9 in die Caspasenkaskade. Zwischen beiden Pfaden besteht ein intensiver Crosstalk.
• Abb. 1.2: Das p53-Protein kann in drei funktionelle Untereinheiten unterteilt werden. Das Aminoende (rot) ist entscheidend für die Funktion des Proteins als Transkriptionsfaktor. Grün dargestellt ist die DNA-bindende Domäne. Das Carboxylende sorgt für die Oligomerisation des Proteins. Zusätzlich sind die für die Lokalistion des Proteins in den Zellkern massgeblichen Sequenzen dargestellt (gelb)
• Abb. 1.3: Innerhalb der DNA-bindenden Domäne finden sich nahezu alle bekannten Mutationstellen im p53-Gen. Dargestellt ist die Frequenz der Mutationen für einzelne Codons. Mit römischen Ziffern markiert sind die hochkonservierten Anteile des Proteins.
• Abb. 1.4 und 1.5 : p53 gebunden an DNA. In vivo existiert p53 als Tetramer. In vitro ist eine DNA-Bindung auch ohne eine Oligomerisation beschrieben und einzelne Anteile der zentralen Region können mit etwa einem Fünftel der Affinität des intakten Proteins an DNA binden. In der Zelle ist die Tetramerisation jedoch unabdingbar für die adäquate Funktion von p53.
• Abb. 1.6: Modell für Regulation der subzellulären Lokalisation von p53. Assoziation an Mikrotubuli dirigiert p53 in Richtung Zellkern mittels elektrostatischer Wechselwirkungen mit Dynein. Für den Import in den Zellkern sorgt die Bindung des Carboxylendes an Rezeptoren des Zellkerns. Der Export von p53 und MDM2 aus dem Zellkern wird vermutlich durch Ubiquitinierung vermittelt.
• Abb. 1.7: Die für die Regulation der p53-Aktivität durch posttranslatorische Modifikation durch Acetylierung (Ac), Phosphorylierung (P), Sumoylierung (S) und Ubiquitinierung (Ub) massgeblichen Bindungstellen sind hier wiedergegeben.
• Abb. 2.1: Prinzip der APAAP-Methode
• Abb. 2.2: Prinzip des Cycle-Sequencing (schematisch)
• Abb. 3.1-3.3: Entmarkende Läsion vom Muster III. Abb. 3.1.: In der Immunhistochmie für MOG erkennt man Makrophagen mit MOG-positiven Myelinabbauprodukten sowie MOG-positive apoptotische Oligodendrozyten. Abb. 3.2,+3.3: Die Doppelimmunhistochemie für MOG (rot) und p53 (schwarz) zeigt p53-positive Oligodendrozyten. Abb. 3.4-3.6: Entmarkende Läsion vom Typ IV. Die großen Pfeile markieren die Läsionsgrenze. Abb. 3.4: Die in situ Hybridisierung für PLP mRNA zeigt einen Verlust von Oligodendrozyten in der Läsion. Abb. 3.5+3.6: Der Nachweis der DNA-Fragmentation (schwarz) zeigt MOG-positive zugrundegehende Oligodendrozyten (rot) in der dem Plaque benachbarten weißen Substanz. p53 kolokalisiert mit den zugrundegehenden Oligodendrozyten.
• Abb.3.7: SSCP von p53 Exon 5a
• Abb. 3.8: SSCP von p53 Exon 5b: Wildtyp
• Abb. 3.9: SSCP von p53 Exon 6: Wildtyp und heterozygoter Polymophismus
• Abb. 3.10: SSCP von p53 Exon 7: Wildtyp und heterozygoter Polymorphismus
• Abb. 3.11: SSCP von p53 Exon 8: Wildtyp
• Abb. 3.12: Sequenzveränderung des Polymorphismus in Exon 6 (Codon 213)
• Abb. 3.13: Sequenzveränderung des Polymorphismus in Exon 7 (Codon 237)