3 Material und Methoden

Die Gehirne wurden bei Routineautopsien gewonnen (Institut für Pathologie und Neuropathologie der Charité, Humboldt-Universität, Berlin, und Institut für Neuropathologie, Johann Gutenberg Universität, Mainz).
Die Hirnhälften wurden median-sagital getrennt. Die Hippokampusformation wurde beidseits herausgetrennt. Die rechte Hemisphäre und vorderer Hippokampus rechts wurden in 4% Formalin fixiert. Teile der linken Hemisphäre und die gesamte linke Hippokampusformation wurden in Scheiben mittels Isopentan schockgefroren.

Für die Stadieneinteilung nach Braak und Braak [24] wurden Hippokampus (Uncus) mit angrenzendem temporalen Kortex (Area transentorhinalis/entorhinalis) und okzipitaler Kortex mit den Brodmann-Arealen 17 – 19 herangezogen. Die Gewebeblöcke wurden in Polyethylenglycol (PEG) eingebettet und 100µm dick geschnitten. Neurofibrilläre Veränderungen und senile Plaques wurden mittels Versilberung nach Gallyas und nach Campell/Switzer dargestellt [24]. Die Einteilung erfolgte nach Ausbreitung neurofibrillärer Veränderungen (NFV 0 = Keine pathologischen Veränderungen; I/II = Transentorhinale Stadien; III/IV = Limbische Stadien; V/VI = Isokortikale Stadien) und seniler Plaques (Aß 0 = Keine pathologischen Veränderungen; A = Initiale Ablagerungen im basalen Isokortex; B = Ablagerungen in allen isokortikalen Assoziationszentren, Hippokampusformation mäßig betroffen; C = Ablagerungen im gesamten Isokortex und Hippokampus). Darüberhinaus wurden eine Übersichtfärbung mit Hämatoxylin-Eosin und eine Lipofuszinfärbung mit Aldehydfuchsin zur Sicherung der Diagnose sowie zum Ausschluss möglicher anderer Demenzformen/Pathologien angefertigt.

Aus der aus schockgefrorenem Hirngewebe extrahierten genomischen DNA wurde die den Polymorphismus tragende Sequenz auf Exon 4 des APOE-Gens mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) amplifiziert (Primer: TAA gCT Tgg CAC ggC TgT CCA Agg und ACA gAA TTC gCC CCg gCC Tgg TAC AC) [100]. Der PCR-Ansatz enthielt in 50µl 0,5µg genomische DNA, je 50µM dATP, dCTP, dTTP und dGTP, 10µM Primer, 2,5U Taq Polymerase (Perkin Elmers Cetus, Emerville, USA), 2,125mM MgCl₂, 10% Dimethylsulfoxid in dem mit der Taq Polymerase bereitgestellten kommerziellen Puffer. Die PCR wurde in einem T3 Thermocycler der Firma Biometra nach folgendem Protokoll durchgeführt:
Denaturierung 3min bei 94°C, gefolgt von 35 Zyklen
Denaturierung 1min bei 94°C
Annealing 1min bei 59°C
Extension 2min bei 72°C und
Amplifikationsabschluss 10min bei 72°C.
Je 10µl des PCR-Produktes wurden mittels Agarosegel-Elektrophorese aufgetrennt, um die Amplifikatlänge (228 Basenpaare) zu überprüfen. Der Rest des PCR-Produktes wurde einem Restriktionsenzymverdau mit Cfo I (einem Isoschizomer von Hha I) unterzogen. Die DNA-Fragmente wurden mittels Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (PAGE) aufgetrennt unter Verwendung von 12,5% Polyacrylamid-Gelen und mit Ethidiumbromid angefärbt. Anhand des Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus erfolgte die Zuordnung der Proben zu den Genotypen.

Für die Studie wurden 91 Gehirne nach APOE-Genotyp und neuropathologischem Befund entsprechend der Stadieneinteilung nach Braak ausgewählt. APOE ε4-Allelträgern wurden nach Alter, Geschlecht und Braak-Stadium passende APOE ε3/3 zugeordnet, wobei der Schwerpunkt hierbei auf der Ausbreitung der neurofibrillären Veränderungen lag.
Da die Fälle mit ausgeprägten neuropathologischen Veränderungen (Braak-Stadien NFV III-VI) durch dieses Zuordnungsverfahren signifikant älter waren als solche ohne, wurden zusätzlich 13 APOE ε3-homozygote Fälle höheren Lebensalters mit keinen oder geringen pathologischen Veränderungen (Alter: 76 - 89 Jahre, Braak-Stadien NFV 0 – II, Aß 0 – A) analysiert.

Tabelle 3:
Charakteristik der verwendeten Fälle: ApoE

Tabelle 4:
Charakteristik der verwendeten Fälle: ApoD

Insgesamt wurden 104 Fälle mitteleuropäischer Herkunft ohne bekannte andere neurologische oder psychiatrische Erkrankungen als DAT in diese Studie eingeschlossen. Die Charakteristik der Fälle ist zusammengefasst in Tab. 3 (ApoE) und Tab. 4 (ApoD).

Humane Hirnproben (aus dem Temporallappen) wurden bei Epilepsie-Operationen zur Verfügung gestellt (Klinik für Neurochirurgie der Charité). Diese Proben wurden zerteilt und jeweils ein Teil sofort und der andere nach Lagerung für 24h bei 4°C über Isopentan Schock gefroren. Diese Hirnproben wurden zur Untersuchung des Einflusses der postmortalen Verzögerung auf die Proteinkonzentration herangezogen und wie die übrigen analysiert.
Die Patienten gaben ihre Einwilligung zur wissenschaftlichen Studie an dem entferntem Gewebe.
Die vorliegende Studie wurde entsprechend der Deklaration von Helsinki und den Richtlinien der Ethikkommission der Charité durchgeführt.

Eine ca. 5mm starke Scheibe des mittleren Hippokampus (Höhe der Corpora geniculata) ohne den entorhinalen Kortex wurde unter flüssigem Stickstoff gemörsert. Das Gewebspulver wurde in vorgekühltem Extraktionspuffer I (50mM Tris/HCl ph 7,4; 1mM EDTA; 1mM ß-Mercaptoethanol; 150mM NaCl; 0,5% Triton X100; Complete® Protease-Inhibitor-Cocktail, Boehringer-Mannheim, Germany) unter Verwendung eines motorisierten Rotor/Stator-Homogenisators homogenisiert. Nach einer zehnminütigen Inkubation auf Eis wurden die Proben einer differentiellen Zentrifugation bei 4°C unterzogen: 10min, 3000 x g und 20min, 20000 x g. Die Überstände und Pellets wurden gesammelt und bei - 80°C gelagert.

Um möglicherweise gebundene Apolipoproteine aus der Pelletfraktion zu lösen, wurden beide Pelletfraktionen einem weiteren Extraktionsschritt unterzogen. Beide Pellets wurden durch Vortexen in Extraktionspuffer II (50mM Tris/HCl ph 7,4; 0,5% Triton X100; 1% SDS) gelöst, für 10min auf 95°C erhitzt, auf Eis gestellt und für 15min bei 4°C mit 1000 x g zentrifugiert. Die Überstände wurden abgenommen und bei - 80°C gelagert. Bei den meisten Proben blieb nach der zweiten Extraktion kaum Pellet übrig.

Der Überstand der ersten Extraktion wird als Präparation 1 (Präp 1) bezeichnet, der Überstand der Pelletextraktion als Präparation 2 (Präp 2).

Der Gesamtproteingehalt wurde mittels BCA Protein Assay Reagent Kit®, Pierce, USA, nach den Angaben des Herstellers in Mikrotiterplatten bestimmt. Die Methode beruht auf photometrischer Messung eines Bicinchoninsäure - Cu¹⁺ - Komplexes nach Biuret-Reaktion. Alle Proben wurden dreifach bestimmt und der Mittelwert als Gesamtproteinkonzentration der Untersuchung zugrunde gelegt.

Die Proben wurden mittels Sodiumdodecylsulfat(SDS)-PAGE unter Verwendung von 15% Polyacrylamidgelen unter reduzierenden Bedingungen aufgetrennt [71]. Einander zugeordnete Fälle wurden auf nebeneinander liegenden Bahnen analysiert. Zwei Hirnhomogenate, die nach dem gleichen Protokoll extrahiert worden waren (Präp 1), wurden als externer Standard (ES) auf jedes einzelne Gel aufgetragen. Eine angefärbte Molekulargewichtsleiter (Rainbow™ Coloured protein molecular weight markers, Amersham Pharmacia Biotech, UK) wurde ebenfalls mit aufgetragen. Für ApoE war das Antigen verfügbar (Recombinantes humanes ApoE, Panvera) und wurde bei einigen Gelen mit aufgetragen. Die aufgetrennten Proteine wurden elektrophoretisch auf Polyvinylidenfluorid (PVDF) Membranen (Immobilon-P, Millipore, USA) geblottet.
Die Membranen wurden 1h bei Raumtemperatur in TBST (20mM Tris/HCl ph 7,6; 150mM NaCl; 0,1% Tween) gewaschen. Für den immunologischen ApoD-Nachweis wurde 10% Magermilchpulver zugesetzt. Nach dem Blockieren wurden die Membranen bei 4°C über Nacht mit dem Primärantikörper inkubiert. Die verwendeten Antikörper sind in Tab. 5 aufgelistet. Nach dem Waschen wurden die Membranen für 2h bei Raumtemperatur mit einem Meerrettichperoxidase-konjugierten Sekundärantikörper (s. Tab. 5) inkubiert. Die immunoreaktiven Proteinbanden wurden mittels Chemilumineszenz (Meerrettichperoxidase/Wasserstoffperoxid katalysierte Oxidation von Luminol) detektiert (Western Blot Chemiluminescence Reagent Renaissance® NEL 102, NEN™ Life Science Products, USA; Hyperfilm™ECL™, Amersham Pharmacia Biotech, UK). Die entwickelten Filme wurden mit einem Epson Expression™ 1680 Pro Densitometer (Epson, Japan) gescannt. Die Proteinbanden wurden als Relative optische Densität (ROD) (einheitsfrei) mit der frei erhältlichen NIH-Image free software quantifiziert.
Alle Proben wurden mindestens dreifach bestimmt.
Unterschiedliche Probenverdünnungen wurden analysiert, um für jedes der bestimmten Apolipoproteine die optimale Gesamtproteinauftragsmenge, die eine lineare Signalentwicklung garantiert, zu bestimmen (Daten nicht gezeigt).

Tabelle 5:
Verwendete Antikörper

Die statistische Datenanalyse wurde in Excel und mit BIAS, einem PC-basierten Statistikprogramm [1], durchgeführt.
Es wurden multiple Vergleiche durchgeführt unter Verwendung des Kruskal-Wallis-Tests mit Alpha-Korrektur nach Holm. Ein Holm-korrigiertes p £ 0,05 (p*) wurde als statistisch signifikant angesehen.
Für Vergleiche zweier unabhängiger Gruppen wurde der zweiseitige Wilcoxon-Mann-Whitney-U-Test (signifikant: p ≤ 0,05) verwendet.
Um die Beeinflussung der Apolipoproteinwerte durch andere Faktoren als die DAT-assoziierten Veränderungen einschätzen zu können, wurde eine mögliche Korrelation der Apolipoproteinwerte zum Alter und zum postmortalen Intervall unter Annahme einer einfachen linearen Regression berechnet (Grafische Darstellung in Excel, Partielle Korrelation in BIAS).
Für die Auswertung der Daten des Pilotversuchs zum Einfluss der postmortalen Verzögerung auf den Proteingehalt der Proben wurde der Student t-Test verwendet (Signifikanzniveau auch 5%).