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III. Material und Methoden

Mit der Comparativen Genomischen Hybridisierung (CGH), einer molekularzytogenetischen Methode, ist man in der Lage, einen Überblick über die genetischen Veränderungen eines Tumors auf chromosomaler und subchromosomaler Ebene zu erlangen. Die detektierbaren Veränderungen werden dabei entweder als DNA-Gewinn oder DNA-Verlust klassifiziert. Dabei kann ein DNA-Gewinn auf eine Onkogen-Aktivierung, der DNA-Verlust dagegen auf Inaktivierung eines Tumorsuppressor-Gen hinweisen. Das maximale Auflösungsvermögen liegt dabei etwa in der Größenordnung einer chromosomalen Bande (Petersen I et al., 1996). Diese wiederum entspricht einem DNA-Gehalt von 10 Mio. Nukleotiden (10 Megabasen). DNA-Gewinne lassen sich gegenüber Deletionen besser nachweisen, da eine DNA-Sequenz mehrfach amplifiziert sein kann. Insbesondere wenn viele Kopien des Amplicons vorliegen, ist eine Auflösung etwa im Bereich von 100 Kilobasen möglich (Kallioniemi, 1994).

Die Durchführung der CGH gliedert sich in folgende Schritte: Präparation der genomischen Tumor- und Normal-DNA, DNA-Markierung mit Nick-Translation, Metaphasenpräparation, Hybridisierung, DNA-Nachweis und schließlich die Bildverarbeitung mit Untergliederung in Bildaufnahme und Bildauswertung.

1. Tumorkollektiv

Zur Durchführung der Comparativen Genomischen Hybridisierung (CGH) wurde die benötigte Tumor-DNA aus tiefgefrorenem Material gewonnen, welches einerseits von Operationspräparaten, andererseits von Autopsiefällen stammte.

1a. Primärtumoren aus Operationspräparaten

Lfd. Nr.	Code-Nr.	E-Nr.	Geschl.	Alter	Grade	Stage
1	L71	13233.95	m	71	II-III	pT2 pN1
2	L74	15718.95	m	66	III	pT3 pN2
3	L70	16972.95	m	66	III	pT1 pN0
4	L73	19936.95	m	59	II-III	pT2 pN1
5	L79	353.96	m	35	III	pT2 pN1
6	L134	947.96	f	49	II-III	pT1 pN2
Lfd. Nr.	Code-Nr.	E-Nr.	Geschl.	Alter	Grade	Stage
7	L135	2725.96	m	66	II	pT1 pN0
8	L136	2935.96	m	71	II	pT2 pN0
9	L137	3372.96	m	77	II	pT2 pN0
10	L148	8742.96	m	47	III	pT2 pN1
11	L152	9869.96	f	72	II	pT2 pN0
12	L65	10031.96	m	55	III	pT2 pN0
13	L67	10433.96	f	57	I	pT1 pN0
14	L68	10743.96	f	54	II	pT1 pN0
15	L69	11420.96	m	60	III	pT2pN0
16	L154	11562.96	f	57	II	pT2 pN0
17	L155	12007.96	m	61	II	pT2 pN0
18	L156	12256.96	f	76	I	pT2 pN0
19	L158	12425.96	f	68	II	pT1 pN0
20	L160	13188.96	f	55	II	pT1 pN0
21	L161	13300.96	m	70	II	pT1 pN0
22	L80	13319.96	m	55	III	pT2 pN2
23	L162	13378.96	m	63	II	pM1
24	L163	13705.96	m	74	II	pT2 pN0
25	L165	14424.96	f	62	II	pT1 pN2
26	L175	19388.96	m	51	III	pT2 pN2
27	L178	21234.96	m	62	II	pT2 pN0
28	L179	21255.96	m	70	III	pT2 pN0
29	L181	22360.96	m	62	II	pT4 pN0
30	L182	23440.96	m	42	II	pT2 pN2 pM1
31	L184	24208.96	m	62	III	pT2 pN2
32	L185	24430.96	m	60	II	pT1 pN0
33	L186	24402.96	m	54	III	pT1
34	L187	24600.96	w	63	II	pT1 pN0
35	L190	25890.96	m	66	III	pT3 pN1
36	L191	25901.96	m	71	III	pT2 pN0
Lfd. Nr.	Code-Nr.	E-Nr.	Geschl.	Alter	Grade	Stage
37	L192	26378.96	m	65	II-III	pT2 pN1
38	L194	26443.96	m	58	II	pT1 pN0
39	L198	27599.96	m	64	II	pT1 pN2
40	L199	495.97	f	58	II	pT2 pN1 pM1
41	L202	1450.97	m	60	III	pT2 pN1
42	L204	1592.97	m	54	II	pT2 pN2
43	L208	4150.97	w	62	II	pT1 pN1
44	L213	5328.97	w	53	II	pT2 pN0
45	L216	5835.97	w	65	III	pT2 pN0
46	L218	6058.97	m	60	III	pT2 pN2

1b. Autopsiefälle mit Primärtumoren und ggf. dazugehörigen Metastasen

Lfd. Nr.	Code	E.-Nr.	Geschl.	Alter	Grade	Stage	Metast. (bearb.)
A1	L81	1001-1,2,3	m	68	II	pT4N3M1	2, 3: Nieren bds.
A2	L82	1031-1	w	83	II	pT4N2M0	keine
A3	L85	1043-1	w	73	III	pT3N3M1	keine
A4	L89	1270-1	f	76	II	pT4N2M1	keine
A5	L114	129.1- 2, 3, 4, 7	m	62	III	pT1N3M1	2, 3, 4: Leber; 7: Knochen
A6	L107	13-1, 2, 4	m	55	II	pT4N2M1	2: Nebenniere; 4: Leber
A7	L115	273-1, 2, 4, 5, 6	m	69	III	pT4N3M1	2: Lymphkn.; 4, 5, 6: Leber
A8	L109	348-1, 2, 3, 5	w	61	II	pT3N2M1	2, 3: Leber; 5: Niere
A9	L110	368-1, 2, 3	m	80	II	pT2N2M1	2: Pons; 3: Großhirn
A10	L113	47-1, 4, 5	w	74	II	pT2N3M1	4: Lunge; 5: Knochen
A11	L93	51-1	m	66	II	pT4N3M1	keine
Lfd. Nr.	Code	E.-Nr.	Geschl.	Alter	Grade	Stage	Metast. (bearb.)
A12	L105	481-1, 3, 5, 6	m	64	III	pT4N3M1	3:Nebenniere; 5: Pons; 6: Kleinhirn
A13	L95	517-1,2	w	88	II	pT4N3M1	2: Großhirn
A14	L97	649-1, 4, 6	m	54	II	pT3N3M1	4: Lymphkn.; 6: Knochen

2. Einzelschritte der Comparativen Genomischen Hybridisierung (CGH)

2a. Extraktion der Tumor-DNA

Prinzip: Aus den tiefgefrorenen Tumorproben wurden dünne Gewebsschnitte gewonnen, wobei der erste und der letzte Schnitt für die Histologie gesichert wurde. Die Zellproteine wurden mit Proteinase K verdaut und dadurch die DNA freigelegt. Aus dem Digestionspuffer wurde diese freie DNA mit Hilfe von Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol extrahiert, mit Isopropanol gefällt und mit Ethanol gewaschen, schließlich getrocknet und in Aqua dest. gelöst.

Procedere: Der erste Schritt zu DNA-Gewinnung aus den tiefgefrorenen Tumor-Proben erfolgte mit Hilfe des Cryotoms. Dabei wurden ca. 20 Schnitte mit etwa 30µm Dicke gewonnen und in ein Eppendorf-Tube mit 900µl Digestionspuffer aus 50mM Tris (pH 8.5), 1mol EDTA und 0.5% Tween 20 überführt.

Jeweils der erste und der letzte Schnitt (mit Schichtdicke 5-8µm) wurden auf ein Objektträger gegeben und zur HE-Färbung gegeben, damit die Anzahl der Tumorzellen in dem entsprechenden Gewebsstück histologisch quantifiziert werden konnte.

Zur Freisetzung der DNA aus dem Zellverband wurde dem Digestionspuffer anschließend 30µl Proteinase K (aus einer 20mg/ml Stammlösung) hinzugefügt, der Verdau mit Hilfe dieses Enzyms erfolgte bei 50°C für ca. 20 Stunden. Bei Bedarf, also wenn danach noch Gewebsverband sichtbar war, erfolgte erneute Proteinase K-Zugabe und Verdau für einige Stunden.

Zur Extraktion der DNA wurden der Probe 900µl Phenol:Chloroform:Isoamoylalkohol hinzugefügt, die Probe gut durchmischt (10 Minuten im Schüttler) und anschließend 20 Minuten bei 14000 U/Minute zentrifugiert. Dabei löste sich die DNA in der oberen Phase, wohingegen die anderen Zellbestandteile im unteren Bereich zurückblieben.

Der Überstand mit der DNA wurde in ein neues Eppendorf-Tube überführt und ein weiterer Extraktionsschritt mit Phenol:Chloroform:Isoamoylalkohol nach dem obigen Prinzip durchgeführt. Ein weiteres Mal wurde Chloroform:Isoamylalkohol (24:1) eingesetzt.

Anschließend erfolgte die Fällung der gelösten DNA mit Hilfe von Isopropanol. Der Probe wurden 90µl 3M NaCl und 1000µl Isopropanol zugefügt und nach Mischung 30 Minuten bei minus 80°C gelagert. Danach erfolgte die Zentrifugation bei 4°C und 13000 U/Minute. Am Boden wurde ein aus DNA bestehendes Pellet sichtbar.

Die Lösung wurde dekantiert, das Pellet anschließend mit 300µl 70% Ethanol gewaschen, erneut wurde zentrifugiert und dekantiert und das Pellet getrocknet.

Zuletzt wurde die Tumor-DNA in 100µl Aqua ad iniectabile gelöst und anschließend die DNA-Konzentration photometrisch gemessen.

2b. DNA-Konzentrationsmessung mit „GeneQuant“ Photometer

Prinzip: die unterschiedliche Lichtbrechung von Wasser im Vergleich zum Wasser mit gelöster DNA (bei einer Wellenlänge von 260nm) wurde ausgenutzt.

Procedere: Die Messung erfolgte in einer Verdünnung von 1: 20, es wurden 5µl Probe und 95µl aqua ad iniectabile benutzt und der Konzentrationswert der ursprünglichen DNA-Probe vom Gerät berechnet. Als Eichlösung wurde aqua ad iniectabile ohne weitere Zusätze eingesetzt.

Die Absorption für die DNA-Konzentration wurde bei 260nm gemessen, als Kontrolle der Reinheit der DNA-Probe wurde außerdem auch noch die Absorption bei 280nm gemessen, bei Ratio-Werten (Verhältnis Absorption bei 260nm / Absorption bei 280nm ) um 1,8 konnte von einer ausreichenden Reinheit der DNA-Probe ausgegangen werden.

Proben mit DNA-Konzentrationen von mindestens 150nm/µl und einem ausreichenden Grad an Reinheit wurden zur weiteren Bearbeitung benutzt.

2c. Nick Translation

Prinzip: Die Nick-Translation diente der unterschiedlichen Markierung der Tumor- und der Normal-DNA.

Nach Behandlung mit DNase zum Erstellen von DNA-Einzelstrangbrüchen, sogenannten Nicks, wurden bei der Reparatur mit DNA-Polymerase Nukleotide in der Doppelstrang-DNA durch ähnliche mit der Haptene isotopisch markierte Nukleotide (Biotin bzw. Digoxigenin) ersetzt .

Außerdem wurden die DNA-Stränge fragmentiert, da für die weitere Verarbeitung DNA-Stränge von einer Länge von 100-500 Basenpaaren benötigt wurden.

Reagenzien: Für die Tumor-DNA wurde Biotin-dUTP als modifizierte Nukleotide, für normal-DNA Digoxigenin-dUTP (beide von Böhringer-Mannheim) eingesetzt.

Weitere Reagenzien:

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• DNTPs (normale Nukleotide): dATP, dCTP, dTP je 0.5mM, dTTP 0.1mM (Böhringer Mannheim)
• NT: Reaktionspuffer 10x: 0.5 M Tris pH 8, 50mM MgCl², 0.5mg/ml BSA
• ß-ME (beta-Mercaptoethanol) 0.1M
• Enzyme: -DNase (3mg/ml) Böhringer Mannheim (Verdünnung mit H²O 1:2000) -Pol (Kornberg DNA Polymerase) Böhringer Mannheim
• EDTA 0.5M, pH 8.0
• SDS 20%

Procedere: Je Probe wurden 5µg DNA eingesetzt, die ursprüngliche DNA-Konzentration durch Zugabe von H²O so verdünnt, daß diese 5µg in dem 50µl umfassenden Probenansatz (davon 31µl DNA-Probe und H²O) vorhanden waren.

Es wurden je Probe je 5µl NT, ß-ME, dNTPs sowie 2µl Biotin-dUTP, bzw. bei normal-DNA Digoxigenin-dUTP, und je 1µl der beiden Enzyme DNase und Polymerase zusammenpippetiert. Um einen vorzeitigen Beginn der Enzymreaktion zu verhindern, geschah dies auf Eis. Die Inkubation erfolgte für (zunächst) 30 Minuten im 15°C warmen Wasserbad.

Nach der Inkubationszeit wurde ausgetestet, ob bereits die optimale Fragmentlänge vorlag. Dazu wurden je Probe 5µl entnommen und mittels Agarosegel-Elektrophorese nach unterschiedlicher Fragmentlänge getrennt. Die Proben wurden während der Zeit bei -20°C gelagert, um die Enzymaktivität auszuschalten.

Wenn durch die Elektrophorese bestätigt wurde, daß die optimale Fragmentlänge vorlag, wurde die Reaktion endgültig gestoppt durch die Zugabe von 2.5µl EDTA und 2.5µl SDS.

Bei dem Vorliegen von noch zu langen Fragmenten wurden erneut Enzyme hinzugegeben und eine weitere Inkubation erfolgte. Beim Vorliegen von bereits zu kurzen Fragmenten wurde die Probe verworfen. Die Länge richtete sich nach dem Verteilungsmuster in der Elektrophorese.

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2d. Chromosomenpräparation aus Blutlymphozyten eines gesunden Spenders

Prinzip: Einem gesunden Spender wurde Blut entnommen und mit Heparin versetzt, welches dann als Kultur mit Zusatz von Antibiotika, L-Glutamin und Phythämagglutinin angesetzt wurde. Nach 72 Stunden wurden die Zellteilungen durch das Spindelzellgift Colcemid gestoppt. Das Serum wurde abgesaugt, die Erythrozyten schließlich hämolysiert durch Zugabe von 0.075 M KCl. Die verbleibenden Lymphozyten wurden mehrmals mit einem Fixativ aus Methanol:Eisessig = 3:1 gewaschen. Schließlich erfolgte das Auftropfen auf Objektträger, die für die Hybridisierung benötigt wurden.

Reagenzien: Für die Kultivierung von Blutlymphozyten in einer 250 ml Zellkulturflasche:

• 40ml RPMI Medium 1640 mit Penizillin/Streptomycin (zur Unterdrückung des Wachstums einer möglichen Begleitflora) und L-Glutamin
• 8ml steril filtriertes fötales Kälberserum (20% FKS)
• 400µl Phytohaemagglutinin (PHA, 1.2mg in 5ml Bidest gelöst; dieses übt einen Proliferationsreiz auf Lymphozyten aus)
• 2ml heparinisiertes Vollblut

Procedere: Die Kultur wurde für 72 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden 400µl (10µl/ml) des Zellgiftes Colcemid hinzugefügt, um die Lymphozyten, die sich nach dieser Zeit in der mitotischen Zellteilung befanden, in der Metaphase zu fixieren. Nach dem Transfer in 2 Röhrchen mit 50ml Fassungsvermögen erfolgte eine weitere Inkubation für 20 Minuten bei 37°C im Wasserbad.

Nach Zentrifugation bei 1000rpm für 10 Minuten wurde der Überstand abgesaugt (bis auf 5ml), das Pellet mit den Zellkernen resuspendiert und schließlich, zunächst tropfenweise, 35ml vorgewärmtes KCl (0.075M, 37°C) hinzugefügt (dadurch Hämolyse der Erythrozyten).

Anschließend erfolgte wiederum eine Inkubation für 25 Minuten bei 37°C im Wasserbad gefolgt von Zentrifugation, Absaugen des Überstandes bis auf 5ml und Resuspension des Pellets. Der nächste Schritt bestand in der langsamen Zugabe von zunächst 2ml Fixativ aus Methanol : Eisessig im Verhältnis 3:1, das restliche Auffüllen auf 40ml mit dem Fixativ konnte dann schneller erfolgen. Diese Waschphase (Inkubation, Zentrifugation, Absaugen des Überstandes, Resuspension des Pellets und schließlich Zugabe von Fixativ) wurde so lange durchgeführt (mindestens 3 mal), bis das Pellet richtig weiß war. Nachdem der Überstand nochmals abgesaugt worden ist, erfolgte dann der Transfer in 15ml Röhrchen, in denen (diesmal mit 10ml Fixativ und Absaugen des Überstands bis auf 2ml) nochmals die oben beschriebenen Waschschritte erfolgten.

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2e. Hybridisierung

Prinzip: Die unterschiedlich markierten DNA-Fragmente (Normal-DNA: Digoxigenin-markiert, Tumor-DNA: Biotin-markiert, jeweils Fragmente von ca. 100-500 Basenpaaren) wurden in gleichen Teilen gemischt und auf normale Metaphasenchromosomen hybridisiert, wo sie um homologe Bindungsstellen konkurrierten. Beim Überwiegen bestimmter DNA-Sequenzen in der Tumor-DNA (Amplifikationen), erfolgte die Bindung an die entsprechende chromosomale DNA häufiger im Vergleich zur Normal-DNA, beim Fehlen bestimmter Sequenzen (Verlust von genetischem Material im Tumor) erfolgte die Bindung seltener.

Procedere: Vor Beginn der eigentlichen Hybridisierung erfolgte zunächst die Fällung und Resuspendierung in Hybridisierungslösung. Anschließend erfolgte sowohl die Denaturierung der DNA-Fragmente als auch die der späteren Träger-Chromosomen zur Umwandlung von der doppelsträngigen DNA zur einsträngigen DNA. Bei der Vorhybridisierung des DNA-Fragmentgemisches erfolgte die Blockung der hochrepetetiven DNA-Abschnitte (vor allem der Centromer-Regionen) mit Hilfe von humane Cot1-DNA.

e. DNA Fällung und Resuspendierung in Hybridisierungslösung

• Reagenzien:
• 10µl Tumor-DNA (Biotin-markiert)
• -10µl Normalgewebs-DNA (Digoxigenin-markiert)
• -1µl salmon sperm DNA (Herring)
• -5,1µl 3M Natriumacetat
• -150µl 100% Ethanol
• -500µl 70% Ethanol (zum Waschen)
• -5µl Formamid
• -10µl Master mix (MM)

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e. Denaturierung der genomischen DNA und Vorhybridisierung

Procedere: Die im vorangegangenen Schritt gelöste DNA wurde für 5 Minuten bei 77°C denaturiert, danach kurz zentrifugiert und anschließend für mindestens 1 Stunde bei 37°C vorhybridisiert.

e. Inspektion und Denaturierung der Chromosomen

Reagenzien: -120µl Denaturierungslösung aus 70% Formamid und 2xSSC

-Aufsteigende Alkoholreihe (70%, 90% und 100%) zur Entwässerung

Procedere: Die Objektträger mit den späteren Trägerchromosomen wurden im Phasenkontrast-Mikroskop betrachtet und auf deren Qualität überprüft (ausreichende Anzahl von Metaphasen ohne Zytoplasmasaum und Schrumpfungsartefakte, wenig nichtchromosomales Material im Bereich der Chromosomen) und die besten Bereiche ausgewählt und markiert.

Anschließend wurden 120µl Denaturierungslösung sowie ein Deckglas aufgebracht. Die Denaturierung erfolgte bei 77°C für 60-70 Sekunden im Wärmeofen. Dann wurde das Deckglas entfernt und die Präparate wurden in Küvetten mit 70%, gefolgt von 90% und schließlich 100% Ethanol entwässert und anschließend luftgetrocknet.

e. Eigentliche Hybridisierung

Procedere: Von der nach der Vorhybridisierung kurz zentrifugierten Hybridisierungslösung der genomischen DNA wurden je 12µl auf die markierten Bereiche (1 oder 2 pro Objektträger) aufgebracht und mit einem 18x18 mm Deckglas abgedeckelt, die Ränder wurden dabei mit rubber cement abgedichtet. Die endgültige Hybridisierung erfolgte dann bei 37°C für 3 Tage, wobei die Objektträger in einer Metallschale mit Deckel im Wasserbad gelagert wurden.

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2f. DNA-Nachweis (Detektion)

Prinzip: Nach der Hybridisierung wurden die nicht an die Trägerchromosomen gebundenen Bestandteile durch mehrere Waschvorgänge vom Objektträger entfernt.

Die Hauptfunktion dieses Arbeitsschrittes war das Einbringen der unterschiedlichen Fluorochrome zur späteren Unterscheidung der Tumor- und Normal-DNA unter dem Fluoreszenzmikroskop. Dabei wurden markierte Antikörper eingesetzt, wobei FITC-Avidin an Biotin, welches zur Markierung der Tumor-DNA benutzt wurde, anti Dig-Rhodamin dagegen an Digoxigenin, welches zur Markierung der Normalgewebs-DNA benutzt wurde, gebunden hat. Als drittes Fluorochrom wurde DAPI eingesetzt, welches die Chromosomen so einfärbte, daß sie später anhand unterschiedlicher Banden beim Karyotypisieren voneinander unterschieden werden konnten. Als Schutz wurden die Präparate am Ende mit DABCO-Lösung versehen und mit einem Deckglas abgedeckt.

Reagenzien:

• Formamid / 2xSSC im Verhältnis 1:1
• 0.1xSSC
• 4xSSC / 0.1% Tween 20
• 3% BSA in 4xSSC / 0.1% Tween 20
• Fluorochrome: -DAPI (4.6-diamino-2-phenylindol-dihydorchlorid) 0.2mg/ml1:5000 mit H²O verdünnt (Lösung in Küvette) -Fluorescein-Avidin dcs (Vector Laboratories) -anti-Dig-Rhodamin (Stammlösung: 200µg/ml bidest, Boehringer Mannheim)
• Gebrauchslösung: -8 µl Fluorescein-Avidin und 16 µl anti-Dig-Rhodamin auf 1 ml 3% BSA- Lösung

Procedere: Die Objektträger wurden 3x3 Minuten bei 37°C in einer Küvette mit Formamid / 2xSSC im Verhältnis 1:1, anschließend in neuer Küvette mit 0.1xSSC 3x3 Minuten bei 60°C gewaschen. Die Lagerung bis zum nächsten Schritt erfolgte in 4xSSC / 0.1% Tween 20.

Pro Objektträger wurden 125µl 3% BSA-Lösung aufgetragen, ein Deckglas aufgelegt, die anschließende Aufbewahrung für 15 Minuten erfolgte in feuchtem Milieu bei 37°C. Danach wieder Lagerung bis zum nächsten Schritt in 4xSSC / 0.1% Tween 20.

Ab dem nächsten Schritt erfolgte die weitere Verarbeitung in möglichst lichtarmer Umgebung.

Herstellung der Gebrauchslösung: Fluorochrome Fluorescein-Avidin und anti-Dig-Rhodamin wurden bei 13000rpm bei 4°C zentrifugiert, anschließend 8 bzw. 12µl in 1ml BSA-Lösung

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Von der Gebrauchslösung wurden jeweils 125µl auf jeden Objektträger aufgebracht, anschließend wieder Abdeckelung mit Deckglas und Lagerung für 15 Minuten bei 37°C im feuchten Milieu.

Anschließend erfolgte ein weiterer Waschschritt: 3x3 Minuten bei 45°C in Küvette mit 4xSSC / 0.1% Tween 20.

Schließlich wurden die Objektträger für 5 Minuten in eine Küvette mit DAPI-Lösung gebracht und anschließend in Küvette mit H²O bidest überführt. Zum Abschluß wurde je Objektträger 35µl DABCO aufgetragen, die Präparate mit einem Deckglas abgedeckt und bis zur Bildaufnahme am Fluoroszensmikroskop in einer Präparatemappe bei 4°C aufbewahrt.

3. Bildaufnahme und rechnergestützte Auswertung

3a. Bildaufnahme am Fluoreszenzmikroskop

Zur Aufnahme der Metaphasenpräparate wurde benötigt: ein Fluoreszenzmikroskop mit einem 63er-Ölimmersionsobjektiv und selektiven Filtersätzen für DAPI, FITC und TRITC, eine CCD (charge coupled divice)-Kamera und ein Rechner mit entsprechender Software.

Prinzip: Im Präparat wurde zunächst eine geeignete Metaphase aufgesucht. Dabei sollten die Chromosomen möglichst gut gespreitet sein, im Aufnahmefeld möglichst keine hellen Artefakte oder Kerne liegen, die Metaphasen nach Möglichkeit vollständig und ohne übereinanderliegende Chromosomen sein. Mit Hilfe eines rechnergestützten und mit einer CCD-Kamera ausgerüsteten Fluoreszenzmikroskops wurden nacheinander 3 monochrome Bilder aufgenommen, ein Bild pro Fluoreszenzkanal. Die Belichtungszeit richtete sich dabei nach der Signalintensität der einzelnen Fluorochrome. Die CCD-Kamera kodierte das Fluoreszenzsignal als Graustufenbild mit einer Größe von 768x768 Pixel, im Computer wurde das als TIFF-File gespeichert, wobei die Fluoreszenzintensität in 256 (8 bit) Graustufen quantifiziert wurde. Pro Präparat wurden 10-15 Metaphasen (jeweils mit 3 Bildern: FITC (repräsentiert Tumor-DNA), TRITC (repräsentiert Normal-DNA) und DAPI (zur späteren Identifizierung der Chromosomen) aufgenommen.

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Fluoreszenzmikroskop: Zeiss Axiophot mit einem 63er-Ölimmersionsobjektiv (Plan NEOFLUAR Ölobjektiv 63fach, N:A:1,25, Zeiss, Oberkochen) und selektiven Filtersätzen.

Filtersätze:

-für DAPI: Zeiss Filtersatz 02 (i.e. Exitation G365, Strahlenteiler FT 395, Emission LP 420)

-für FITC: Zeiss Filtersatz 10 (i.e.Exitation BP 450-490, Strahlenteiler FT 510, Emission LP 420)

-für TRITC: Chroma Filtersatz plus Exzitation Filter des Zeiss Filtersatzes 15 (i.e. Exzitation BP 546/12, Strahlenteiler FT 565, Emission BP 570-650)

-CCD-Kamera (charge coupled divice-Camera): gekühlte CCD-Kamera Photometrics (Tucson, Arizona, USA)

-Rechner und Software: Computer der Firma Macintosh mit Softwareprogramm NU200 2.0

3b. Bildverarbeitung

-3b. Erstellung eines CGH-Karyogrammes (Programm: CGH)

-3b. Erstellung eines Summenkaryogrammes und Ratioprofils eines Falles (Programm: CGH eval)

-3b. Erstellung von Superkaryogrammen und Histogrammen einer Tumorart (Programm: CGH super)

-3b. Vergleich von Histogrammen unterschiedlicher Subtypen einer Tumorart (Programm: CGH Java super)

Die CGH-Software wurde auf der Grundlage des AMBA-Systems und des Karyotypisierungsmoduls KARYOTYP (IBSB GmbH, Berlin) entwickelt und auf einem PC unter Windows implementiert (Roth et al. 1996).

b. Erstellung eines CGH-Karyogrammes (Programm: CGH)

Prinzip: die drei monochromen Bilder, die den drei Fluoreszenzarten DAPI zur Chromosomenidentifikation, FITC als Tumor-DNA präsentierend und TRITC als Normal-DNA präsentierend entsprachen, wurden übereinandergelegt, eine optische Verschiebung bei Bedarf korrigiert. Innerhalb der Metaphasen unterschiedlich starke Signale eines Fluorochromes (FITC bzw. TRITC) bedeutete ein Überwiegen dieses Fluorochromes an bestimmten Stellen. Durch die Berechnung des RATIO-Bildes (Darstellung des relativen Fluoreszenzprofiles, berechnet aus

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Mit Hilfe der DAPI-Darstellung wurde die Abgrenzung von Chromosomen zu Hintergrund festgelegt, anschließend sich eventuell berührende Chromosomen voneinander getrennt und die Chromosomen schließlich alle in ihrer Längsrichtung angeordnet. Die Karyotypisierung erfolgte mit Hilfe spezifischer Eigenschaften der Chromosomen im DAPI-Bild (Größe der Chromosomen, Verhältnis von langem zu kurzem Arm und spezifische Banding-Muster).

b. Erstellung eines Summenkaryogramms und Ratioprofils eines Falles (Programm: CGH eval)

Zur Unterdrückung von Rauscheffekten und lokalen Artefakten und um statistisch signifikante Aussagen zu erhalten, mußte über mehrere Metaphasen eines Falles gemittelt werden. Ziel dieses Arbeitsschrittes war die Mittelung von 10-15 inzwischen zu Karyogrammen sortierten Metaphasen eines Falles mit dem Ergebnis als sogenanntes Summenkaryogramm.

Prinzip: Die in den einzelnen Metaphasen zum Teil morphologisch sehr unterschiedlichen Chromosomen mußten zunächst einmal geometrisch transformiert werden, um dann homologe Chromosomen miteinander vergleichen zu können. Dazu wurde eine Achse durch jedes Chromosom gelegt und anschließend begradigt. Die vom Computer durchgeführten Vorgänge wurden nochmals kontrolliert, bei einer fehlerhaften Verlegung der Achse wurde das betreffende Chromosom von der weiteren Auswertung ausgeschlossen. Schließlich wurden die Chromosomen auf eine Einheitslänge und Einheitsbreite normiert, um dann mit den weiteren homologen Chromosomen des Falles zu einem „Einheitschromosom“ zusammengefaßt, welches die manifesten genetischen Veränderungen der entsprechenden Chromosomenklasse repräsentiert. Die gemeinsame Darstellung aller so ermittelten Einheitschromosomen erfolgte in einem CGH-Summenkaryogramm. Die Darstellung entspricht dabei der des RATIO-Profiles der Karyogramme der einzelnen Metaphasen: Amplifikationen im Tumor werden grün dargestellt, Deletionen rot und ein ausgewogenes Verhältnis erscheint blau. Dabei ist zu bemerken, daß die CGH als alleinige Untersuchungsmethode nur eine Aussage über die relative Veränderung der DNA-Kopienanzahl ermöglicht. Ein rein tetraploider Tumor würde beispielsweise in einer CGH-Analyse keine Veränderungen aufweisen.

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b. Erstellung von Superkaryogrammen und Histogrammen einer Tumorart (Programm: CGH super)

In diesem Programm wurden die Summenkaryogramme der einzelnen Fälle zu einem Superkaryogramm verarbeitet, um zu ermitteln, ob bestimmte Veränderungen spezifisch für bestimmte Tumorarten sind. Man erhielt ein Muster von genetischen Veränderungen der bearbeiteten Tumorart bzw. -untergruppe. Dabei wird in unserer Arbeitsgruppe ein statistisches Verfahren zur Festlegung der DNA-Imbalancen angewandt. Es beruht auf der Anwendung eines Student t-Test, um zu überprüfen, ob die Abweichung des Ratioprofils von dem Normalzustand, repräsentiert durch den Ratio-Wert 1.0, statistisch signifikant ist oder nicht (Roth et al., 1996).

b. Vergleich von Histogrammen unterschiedlicher Subtypen einer Tumorart (Programm CGH java super)

Mit dem Programm CGH java super konnten zwei verschiedene Gruppen verglichen werden. Als Unterscheidungsmerkmal der Gruppen konnte beispielsweise die histologische Differenzierung (z.B. Adenokarzinom versus SCC) oder das Tumorstadium (nicht metastasierte versus metastasierte Tumoren) gewählt werden. Statistisch wurden die beiden Gruppen mit Hilfe des ²-Tests verglichen.

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