Goeze, Almut: Charakterisierung chromosomaler Imbalancen in Adenokarzinomen der Lunge mit Hilfe der Comparativen genomischen Hybridisierung (CGH)

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IV. Resultate

1. Auswertung der Summenkaryogramme

Die Erstellung eines Summenkaryogrammes erfolgte für jeden einzelnen Fall, unabhängig ob es sich dabei um einen Primärtumor oder eine Metastase handelte. Dazu wurde ein spezielles Computerprogramm zu Hilfe genommen, das die Chromosomen hinsichtlich der relativen Kopienzahl analysierte.

Als Deletion wurde dabei diejenigen Veränderungen erfaßt, die bei dem rechnergestützen System auf Grundlage des Student-t-Tests signifikant unter dem Ratio-Wert von 1.0 lagen, als Überrepräsentationen diejenigen Veränderungen, bei denen der Ratio-Wert von 1.0 signifikant überschritten wurde.

1a. Beispielhafte Darstellung am Fall 517-1

Abbildung 1a: Summenkaryogramm des Falles 517-1

In der Abbildung 1a ist das Ergebnis des Falles 517-1 als Summenkaryogramm dargestellt. Die Auswertung erfolgte nach Bearbeitung von 12 einzelnen Metaphasen des Falles. In der Darstellung werden Überrepräsentationen grün und Deletionen rot dargestellt. Rechts neben den Chromosomen sind die Fluoreszenz-Quotientenprofile dargestellt. Die mittlere (grüne) Linie kennzeichnet Gleichgewicht zwischen Tumor- und Normal-DNA, sie entspricht dem Ratiowert 1.0. Die linke Linie kennzeichnet die 50%-Monosomieschwelle (Ratiowert 0.75), die rechte


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Linie die 50%-Trisomieschwelle (Ratiowert 1.25). Die rote Linie, das Ratioprofil, zeigt die Verteilung von Normal- zu Tumor-DNA in diesem Fall auf. Ausschläge des Profils nach links sind mit Deletionen, Ausschläge nach rechts mit DNA-Gewinnen assoziiert.

Abbildung 1b: statistische Darstellung des Falles 517-1

In Abbildung 1b erfolgt die Darstellung desselben Falles in der statistischen Form. Wie bei der vorherigen Darstellung werden die 50%-Monosomie- und Trisomieschwelle sowie Gleichgewicht zwischen Tumor- und Normal-DNA dargestellt. Dabei zeigt die rote Linie wiederum das Ratioprofil, die grünen Linien rechts und links davon geben das 99%-Konfidenzintervall an. Die n-Werte der einzelnen Chromosomen geben die jeweilige Anzahl der in die Auswertung eingegangenen Chromosomen an.


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Abbildung 1c gibt dieselben Ergebnisse wie Abb. 1a und b wieder. Zur Darstellung wurde hier ein Linien-Diagramm gewählt, bei dem die Deletionen links und die DNA-Überrepräsentierungen rechts neben einem Chromosomenideogramm angezeigt werden. Dabei werden die Bereiche, in denen das Ratioprofil einschließlich seines Konfidenzintervalls den Schwellenwert 1 über- beziehungsweise unterschreitet, blau dargestellt, Bereiche, in denen auch der Schwellenwert von 0.5 unter- bzw. von 1.5 überschritten wird, werden rot dargestellt. Diese roten Bereiche bezeichnen wir als sogenannte pronounzierte DNA-Verluste (<0.5) bzw. DNA-Gewinne (1.5). Sie entsprechen in der Regel Mehrfach-Deletionen bzw. Mehrfach-Amplifikationen.

Ergebnisse des Falles 517-1:

Der Fall 517-1 weist Deletionen auf folgenden Chromosomenabschnitten auf: 1p13-31, 2q22-36, 3, 4p, 4q11-26, 5q11.1-22, 6q, 8p, 9p, 12q21-qter, 13q, 15q15-qter, 18q und 20p. Amplifikationen zeigen sich auf folgenden Chromosomen: 1p33-pter und 1q (Maximum: 1q21-q24), 7, 8q, 9q33-qter, 11, 16, 19 und 20q.


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2. Ergebnisse aller Primärtumoren

Abbildung 2: Histogramm von 60 Primärtumoren (Adenokarzinome der Lunge, davon 46 Biopsiefälle und 14 Autopsiefälle)

In Abbildung 2 werden die Ergebnisse aller 60 Primärtumoren als Histogramm dargestellt. Die genetischen Veränderungen sind in Form von Inzidenzkurven entlang der Chromosomenideogramme dargestellt. DNA-Verluste werden links vom Chromosom gezeigt, DNA-Zugewinne rechts. Die erste vertikale Linie vom Chromosomideogramm aus kennzeichnet die 50%-Marke. Wird diese überschritten, bedeutet dies, daß die entsprechende Veränderung in über 50% der bewerteten Tumoren vorliegt. Alterationen mit 99%iger Siginifikanz nach dem Student-t-Test sind blau, jene mit 95%iger Signifikanz sind grün dargestellt. Durch die hohe Anzahl von repetetiver DNA und damit hoher Artefaktrate müssen die Zentromerregionen der Chromosomen 1, 9 und 16 von der Auswertung ausgeschlossen werden.


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2a. Veränderungen, die in über 50% der Fälle auftraten

Folgende Veränderungen traten bei einem Konfidenzintervall von 99% in über 50% der Fälle auf:

Deletionen:

3p21-p24

(Maximum: 3p22-p21: 37 Fälle; 61,7%)

 

3p12-p14

(Maximum: 3p13/12: 34 Fälle; 56,7%)

 

4p14

(30 Fälle; 50,0%)

 

4q13-q34

(Maximum: 4q26-q28: 38 Fälle; 63,3%)

 

5q14-q23

(Maximum: 5q15: 32 Fälle; 53,3%)

 

6q14-q24

(Maximum: 6q14: 35 Fälle; 58,3%;

 

 

6q16: 36 Fälle; 60,0%;

 

 

6q22: 36 Fälle; 60,0%)

 

8p21

(30 Fälle; 50,0%)

 

9p13-p23

(Maximum: 9p21-p13: 38 Fälle; 63,3%)

 

9q12-q21

(Maximum: 9q12: 34 Fälle: 56,7%

 

 

9q21: 36 Fälle: 60,0%)

 

13q14-q32

(Maximum: 13q21: 41 Fälle; 68,3%

 

 

13q31: 41 Fälle; 68,3%)

 

15q21

(Maximum: 34 Fälle; 56,7%)

 

18q22

(30 Fälle; 50,0%)

 

 

 

Überrepräsentationen:

1q21-q43

(Maximum: 1q22-q23: 44 Fälle; 73,3%)

 

5p14-p15

(Maximum: 5p15.1-2: 35 Fälle; 58,3%)

 

5p13

(Maximum: 33 Fälle; 55,0%)

 

8q22-qter

(Maximum: 8q23-q24.1: 37 Fälle; 61,7%)

 

11q13

(31 Fälle; 51,7%)

 

17q21

(32 Fälle; 53,3%)

 

17q24-q25

(31 Fälle; 51,7%)

 

19q13.1

(30 Fälle; 50,0%)

 

20q11.2-q13.2

(Maximum: 40 Fälle; 66,7%)


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2b. Weitere häufige Veränderungen (>30%; <50%):

Deletionen:

1p31-p21

(Maximum 29 Fälle, 48,3%)

 

2q22-q33

(Maximum 2q32: 20 Fälle; 33,3%)

 

5q33

(28 Fälle; 46,7%)

 

10p

(Maximum: 10p12: 18 Fälle; 30%)

 

10q

(Maximum: 10q21: 24 Fälle; 40%)

 

18q

(Maximum: 18q22: 30 Fälle; 50,0%)

 

21p-q22

(Maximum: 28 Fälle; 46,7%)

 

 

 

Überrepräsentationen:

1p34-pter

(Maximum: 1p36.1: 25 Fälle; 41,7%)

 

6p

(Maximum: 6p22: 21 Fälle; 35,0%;

 

 

Maximum: 6p21.2: 27 Fälle; 45%)

 

14

(Maximum: 14q32; 21 Fälle; 35,0%)

 

15q23-24

(Maximum: 17 Fälle; 28,3%)

 

18p11.2

(17 Fälle; 28,3%)

 

19

(Maximum:19q13.1: 30 Fälle; 50,0%)

 

22q

(Maximum: 22p11.2: 25 Fälle; 41,7%)

2c. Chromosomenabschnitte, die auffällig selten eine Überrepräsentation aufwiesen:

3p, 4, 5q, 6q, 8p, 9p, 10, 13 und 21


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3. Vergleich von metastasierten und nicht-metastasierten Tumoren

Die häufig schon frühe Metastasierung stellt ein großes Problem in der Gruppe der Adenokarzinome der Lunge dar. Um Hinweise auf Ursachen für die Metastasierung zu finden, diente unter anderem der Vergleich von Tumoren ohne Metastasen (Stadien N0M0) mit Tumoren, bei denen auch Metastasen gefunden wurden (Stadien N+ und /oder M+) bzw. mit Metastasen dieser Tumoren.

Abbildung 3a (oben) und 3b (unten): Differenzhistogramme N+ und/oder M+ versus N0M0


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In Abbildung 3a wird ein Differenzhistogramm gezeigt, bei der die Gruppe der nicht metastasierten Primärtumoren (grün) mit der Gruppe der Metastasen (10 Fälle) und metastasierten Primärtumoren, von denen kein DNA-Material der Metastasen selbst vorlag (23 Fälle), also insgesamt 33 Fälle (rot), verglichen.

In Abbildung 3b wird die Gruppe der nicht-metastasierten Primärtumoren mit den metastasierten Primärtumoren verglichen. Es werden dieselben Fälle zugrundegelegt wie in Abb. 3a, es gehen lediglich bei den Fällen, bei denen auch Material von Metastasen vorlag, ebenfalls nur die Primärtumoren in den Vergleich ein. Dabei ähneln sich die Ergebnisse des Vergleichs, die Unterschiede treten jedoch beim Vergleich, in denen zum Teil Metastasen in die Auswertung eingehen, deutlicher hervor.

Ebenso wie beim Histogramm (s. Abb.2) werden DNA-Verluste und -Zugewinne links bzw. rechts vom Chromosomenideogramm als Inzidenzkurven dargestellt. Die weißen Bereiche zwischen Chromosomenideogramm und farbigen Bereichen zeigen die Anzahl der Veränderungen auf, die in beiden Tumoruntergruppen vorhanden sind, die farbigen Bezirke beziehen sich auf die Veränderungen, die im Vergleich zur anderen Tumorgruppe vermehrt vorkommen (rot: in mehr % der Fälle Veränderungen in metastasierten Primärtumoren/Metastasen; grün: in mehr % der Fälle Veränderungen in nicht-metastasierten Primärtumoren). Dunkelgraue horizontale Balken geben die Bereiche an, in denen Unterschiede von 99% Signifikanz im chi2-Test zwischen den beiden Tumorklassen bestehen, hellgraue horizontale Balken die entsprechenden Bezirke mit 95% Signifikanz.

Der Abbildung liegen die Histogramme der beiden Unterklassen mit 99% Signifikanz-Grenzwert nach dem Student-t-Test zugrunde.

Folgende Unterschiede konnten zwischen den beiden Unterklassen auch beim Zugrundelegen anderer Auswertungsverfahren wie beispielsweise feste Schwellenwerte (0.75/1.25; 0.85/1.15; 0.9/1.1) oder andere statistische Parameter wie Gaussverteilung statt Students-test; Konfidenzintervall 95% statt 99%) ermittelt werden. Diese Auswertungsschemata sind auch zugänglich über unsere Internet-Seite http://amba.charite.de/cgh.


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3a. Veränderungen, die gehäuft bei metastasierten Primärtumoren/Metastasen auftraten:

Deletionen:

3p22-p25

 

4p13-p15.1

 

8p

 

17p12-p13

 

20p12

Überrepräsentationen:

1q21

 

11q12-q13

 

14q11.1-q13

 

15q24

 

20q12-13.1

3b. Veränderungen, die gehäuft bei nicht-metastasierten Primärtumoren auftraten:

Deletionen: 19p13.1-p13.3

Überrepräsentationen:

3p12-p14

 

4q26-q28

 

5p14


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4. Primärtumoren und dazugehörige Metastasen

In zehn Fällen wurden aus Autopsiematerial jeweils der Primärtumor und bis zu 4 Metastasen analysiert. Als Beispiele dafür sollen der Fall 368 mit 2 Gehirnmetastasen und der Fall 481 mit einer Nebennierenmetastase und 2 Gehirnmetastasen stehen.

Abb. 4a-c: Summenkaryogramme des Falles 368 (a: Primärtumor; b: Metastase Pons; c: Großhirnmetastase)

Abb. 4a

Abb. 4b

Abb. 4c


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Wie in Abbildung 4a-c zu sehen ist, in denen die Summenkaryogramme (Erklärung vom Aufbau eines Summenkaryogrammes siehe Erläuterungen zu Abbildung 1a) vom Primärtumor und den beiden Gehirnmetastasen abgebildet sind, zeigen die Metastasen im Großen und Ganzen dasselbe Muster wie der Primärtumor. Allerdings treten die Veränderungen in den Summenkaryogrammen der Metastasen deutlicher hervor, und auch einige zusätzliche Veränderungen sind erkennbar, wie zum Beispiel die DNA-Überrepräsentation vom Chromosomenabschnitt 4q und 7q in der zweiten Metastase.

Abbildung 4d: Liniendiagramm des Falles 481 mit Primärtumor, Nebennierenmetastase, Großhirnmetastase und Kleinhirnmetastase

Abbildung 4d zeigt das Linien-Diagramm zum Fall 481. Dabei handelt es sich um den Primärtumor, eine Nebennierenmetastase und 2 Gehirnmetastasen. In der ersten Position neben dem Chromosomenideogramm werden jeweils die Veränderungen des Primärtumors (1) gezeigt, dann folgt die Darstellung von den Veränderungen von Nebennierenmetastase (2), Großhirnmetastase (3) und Kleinhirnmetastase (4). Daraus folgt die Anordnung: 4, 3, 2, 1, Chromosomenideogramm, 1, 2, 3, 4. DNA-Verluste werden wiederum auf der linken Seite jedes Chromosomenideogrammes, DNA-Gewinne auf der rechten Seite dargestellt.

Auch bei dieser Darstellung ist zu erkennen, daß sich das Muster von Veränderungen in Primärtumor und Metastasen gleicht und nur leichte Unterschiede vorhanden sind. Das heißt, die CGH-Analyse weist eindeutig auf einen klonalen Ursprung der Tumoren hin.


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Thu Sep 14 12:27:57 2000