Goeze, Almut: Charakterisierung chromosomaler Imbalancen in Adenokarzinomen der Lunge mit Hilfe der Comparativen genomischen Hybridisierung (CGH)

41

V. Diskussion

Die CGH (Comparative Genomische Hybridisierung) ist ein molekularzytogenetisches Verfahren, welches die umfassende Analyse eines Tumorgenoms auf Über- und Unterrepräsentationen von DNA-Abschnitten ermöglicht. Ziel dieser Untersuchungen ist es, eine Korrelation zwischen Genotyp und Phänotyp herzustellen und damit eine genetische Charakterisierung von Tumoren zu erreichen, die die morphologische Beschreibung ergänzt (Roth et al., 1996). Bereits 1997 umfaßte die Gesamtheit der CGH-Veröffentlichungen Daten von etwa 1500 Tumoren. Dabei lassen sich bereits einige genetische Aberrationen erkennen, die für bestimmte Tumortypen oder Stadien von Tumoren charakteristisch sind. Auf CGH-Daten basierend wurden bereits sechs neue Amplifikationen, ebenso wie ein Locus für ein Krebs-prädisponierendes Syndrom entdeckt (Forozan et al., 1997).

Jeder einzelne Tumor hat sein spezifisches Muster von Veränderungen. Dabei gibt es bei der Gesamtheit der Tumoren Veränderungen, die besonders häufig vorkommen, und andere, die so gut wie nie beobachtet werden. Es handelt sich in jedem einzelnen Tumor um mehrere Veränderungen, die erst in der Summation zu einer Tumorentstehung führen. Einschränkend ist zu bemerken, daß es zwar keine Veränderung gibt, die bei 100% aller Adenokarzinome der Lunge auftritt, und ebenso keine Veränderung absolut spezifisch für das Adenokarzinom der Lunge ist, da sie auch in anderen Tumorarten auftreten kann. Dennoch läßt sich ein häufig wiederkehrendes Muster von Veränderungen nachweisen, die zumindest relativ typisch für das Adenokarzinom der Lunge ist. Einzelne Imbalancen scheinen dabei mit bestimmten morphologischen und biologischen Phänotypen assoziiert zu sein.

Insgesamt zeigten sich trotz der technisch schwierigeren Detektierbarkeit von DNA-Verlusten mehr Deletionen als Überrepräsentationen bei den untersuchten Adenokarzinomen. Dies kann ein Hinweis darauf sein, daß die Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen eine wichtigere Rolle bei der Entstehung von Adenokarzinomen der Lunge spielt als das vermehrte Auftreten von Onkogenen.

Das ähnliche chromosomale Aberrationsmuster von Primärtumoren und den entsprechenden korrespondierenden Metaphasen zeigt die klonale Abstammung der Metastasen vom Primärtumor. Das deutlichere Hervortreten der Veränderungen in den Metastasen kann mit dem geringeren Anteil von Normalgewebe in der Metastase sowie dem Bestehen des Primärtumors aus mehreren Klonen, von denen nur ein Klon in der Metastase auftritt, erklärt werden. Zusätzliche Veränderungen in den Metastasen können durch genetische Instabilität der Tumorzellen auch nach dem vom Primärtumor getrennten Wachstum entstehen.


42

Da besonders bei den Lungentumoren die frühe Metastasierung ein großes Problem darstellt, besteht auch ein Interesse an den Veränderungen, die von dem lokalisierten Primärtumor zur Entstehung von Metastasen führt. Die Ergebnisse beim Vergleich von den nicht-metastasierten zu den metastasierten Primärtumoren bzw. Metastasen könnten einen Hinweis auf Genloci sein, die zur Tumorprogression führen.

1. CGH-Muster von Adenokarzinomen im Vergleich zu anderen Primärtumoren der Lunge

Die für Adenokarzinome der Lunge typischen Veränderungen sind im Kapitel “Ergebnisse aller Primärtumoren“ aufgeführt. Dazu gehören die Überrepräsentationen von 1q, 5p, 8q, 11q13, 17q, 19q und 20q und Deletionen auf den Chromosomenabschnitten 1p, 3p, 4q, 5q, 6q, 8p, 9p, 13q und 18q. Ein Großteil der Veränderungen ist dabei zwar nicht spezifisch für diesen histologischen Typ des Lungenkarzinoms, tritt aber gegenüber dem Plattenepithelkarzinom und Kleinzelligen Karzinomen deutlich häufiger auf.

Im Vergleich zeigten Adenokarzinome signifikant mehr Überrepräsentationen im Bereich der chromosomalen Bande 1q23 und Deletionen der Chromosomenabschnitte 3q, 9q, 10p13, 15q21-22, 19p13.3 und 19q13.2. Die Plattenepithelkarzinome dagegen zeigten einen signifikant höheren Anteil an DNA-Überrepräsentationen auf Chromosom 3q und Deletionen auf den Chromosomenabschnitten 12q13 und 2q36-37 (Petersen I et al., 1997). Die Daten der hier zitierten Arbeit bezüglich der Adenokarzinome waren auch Bestandteil der vorliegenden Dissertation. Vor allem die Überrepräsentation von 3q scheint besonders in Verbindung mit der Überrepräsentation von 12p13 eher zu einem Plattenepithel als zu einem Adenokarzinom zu führen. Die beschriebene Veränderung von 3q trat bei Adenokarzinomen nur in weniger als 40% der Fälle auf (Überrepräsentationen in bis zu 25%), wohingegen es bei Plattenepithelkarzinomen in weit über 50% der Fälle zu einer der häufigsten Veränderungen gehörte.

Die gemeinsamen Veränderungen von Adenokarzinomen und Plattenepithelkarzinomen der Lunge sind beispielsweise die DNA-Gewinne bei 8q24, 11q13und 17q21. Korrespondierende Onkogene in diesen Loci sind c-myc-, cycD1- und ERBB2-.

Auch in Kleinzelligen Lungenkarzinomen (SCLC) gehörte die Überrepräsentation von 3q zu einer der häufigsten Veränderungen. Bei der Untersuchung von 22 Tumoren trat diese Veränderung in 15 Tumoren (68%) dieser Tumorart auf (Petersen I et al., 1997b). In allen SCLC dieser Arbeit war außerdem eine Deletion von 3p vorhanden, eine Veränderung, die auch in anderen Tumorarten häufig auftritt, z.B. in Plattenepithelkarzinomen der Lunge und HNSCC


43

(Head and neck sqamous cell cancer) (Speicher et al., 1995). Dagegen spielt diese Veränderung bei Adenokarzinomen der Lunge eine weniger ausgeprägte Rolle, aber auch bei dieser Tumorart liegt in bestimmten Bereichen (3p21-22) eine Deletion in 62,7 % der Fälle vor.

Weitere wichtige Veränderungen in SCLC: Deletion von Chromosom 10q in 94% und von den Chromosomen 4q, 5q, 13q und 17p in 86% der Fälle. Während die Deletionen von 4q, 5q und 13q bei Adenokarzinomen ebenfalls in über 50% auftreten, sind Deletionen von 10q und 17p in dieser Tumorart weniger bedeutsam, sie treten nur in 30% der Fälle (10q, Max. 10q 21; 40% ) bzw. 20% der Fälle (17p) auf.

2. Adenokarzinome der Lunge im Vergleich zu Adenokarzinomen anderen Ursprungs

Um weitere Hinweise darauf zu bekommen, welche genetischen Veränderungen zur adenoiden Differenzierung führen, ist der Vergleich von Veränderungen in Adenokarzinomen verschiedener Lokalisationen von Bedeutung. Zu den entsprechenden Lokalisationen zählen neben der Lunge Prostata, Pankreas, Colon und Mamma.

Als häufigste gemeinsame Veränderung wurde ein DNA-Gewinn von 1q gefunden, auch in Adenokarzinomen der Prostata (Cher et al., 1996), des Colons (Ried et al., 1996) und der Mamma (Ried et al., 1995). Die bei der vorliegenden Studie gefundene Überrepräsentierung, vor allem im Bereich von 1q22-23, bei der es sich häufig auch um eine high-copy-Amplifikation handelte, könnte einen Hinweis darauf sein, daß sich in dieser Region ein Gen befindet, das zur Differenzierung von Tumoren zu Adenokarzinomen verschiedener Lokalisationen führt. In Plattenepithelkarzinomen der Lunge ist die Überrepräsentation von 1q mit Metastasierung assoziiert (Petersen et al., 2000b). Daher kann vermutet werden, daß diese Aberration mit dem höheren Potential der Adenokarzinome zur Metastasierung assoziiert ist. Eine weitere Veränderung, die auch bei den anderen Adenokarzinomen regelmäßig vorkommt, ist die Überrepräsentation des Chromosoms 20q. Dies wird sowohl für Adenokarzinome des Colons (Ried et al., 1996) als auch des Pankreas (Mahlamaki et al., 1997) erwähnt. Beim direkten Vergleich mit SCC (Petersen I et al., 1997) war diese Veränderung zwar nicht statistisch signifikant häufiger bei Adenokarzinomen, jedoch relativ häufiger bei dieser Tumorart, so daß nicht auszuschließen ist, daß auf diesem Chromosomenarm ein Gen beherbergt ist, das zur adenoiden Differenzierung von Tumoren führt.

Für Pankreaskarzinome wurden folgende Veränderungen durch verschiedene Studien identifiziert: Überrepräsentationen auf den Chromosomenarmen 8q, 11q, 12p, 17q und 20q sowie DNA-Verluste auf 9p, 15q und 18q. (Solinas-Toldo et al., 1996; Malhamäki et al., 1997).


44

Mit Ausnahme von Überrepräsentationen auf dem Chromosomenarm 12p sind dies alles Veränderungen, die auch bei der vorliegenden Studie häufig bei Adenokarzinomen der Lunge gefunden wurden.

3. Kandidatengene in häufig deletierten Regionen

Auf einigen der häufig von DNA-Verlusten betroffenen Chromosomenabschnitten sind bereits Tumorsuppressorgene bekannt.

Folgende Tumorsuppressorgene gehören dazu:

4. Kandidatengene in häufig überrepräsentierten Regionen

Für folgende bereits bekannte Genlokalisationen von Onkogenen konnten in der vorliegenden CGH-Studie häufig Überrepräsentationen gefunden werden:

CycD1 ist auf 11q13 lokalisiert und ist eine Kinase, die über Hyper-Phosphorylierung des Retinoblastoma-Proteins und daraus resultierender Freisetzung von Transkiptionsfaktoren die Replikation von S-Phase-Genen einleitet. Vor allem metastasierte (pN+/pM1) Adenokarzinome zeigten diese Veränderung, was auch mit Ergebnissen vereinbar ist, die diese Überrepräsentation mit einer schlechten Prognose assoziieren (Tanaka et al., 1998; Betticher et al., 1996).


47

5. Unterschiede zwischen metastasierten und nicht-metastasierten Tumoren

Eines der wichtigsten Kriterien für die Prognose eines Tumors ist die Abwesenheit oder das Vorhandensein von Metastasen. Besonders bei Adenokarzinomen der Lunge bestehen häufig bereits bei Diagnosestellung Metastasen, oft sind dieses noch Mikrometastasen, die diagnostisch nicht erfaßt werden können. Daher besteht sicherlich auch klinisch ein Interesse daran, welche genetischen Veränderungen eines Tumors zur Metastasierung führen kann, um so verschiedene Patienten einer jeweils adäquaten Therapie zuzuführen und die Prognose für den einzelnen Patienten besser abschätzen zu können.

Bei der vorliegenden Studie wird versucht, durch Vergleich von nicht-metastasierten Primärtumoren mit metastasierten Primärtumoren und Metastasen Chromosomenbereiche zu erfassen, auf denen potentiell für die Metastasierung verantwortliche Tumorsuppressorgene oder Onkogene lokalisiert sind.

Allgemein ist zu sagen, daß insgesamt die Veränderungen bei den metastasierten Tumoren etwas häufiger sind als bei nicht-metastasierten. Das läßt sich in der Abbildung 3 daran erkennen, daß die Gesamtheit der roten Flächen (für Veränderungen, die bei metastasierten Tumoren überwiegen stehend) etwas größer ist als die der grünen Flächen (für Veränderungen, die bei nicht-metastasierten Tumoren überwiegen stehend). Außerdem sind häufig Chromosomenabschnitte, die bei der metastasierten Gruppe häufiger von Deletionen betroffen sind, bei der nicht-metastasierten Gruppe häufiger von Überrepräsentationen betroffen und umgekehrt. Optisch erkennbar zeigt sich deshalb oft eine rote Fläche auf der einen Seite und eine grüne Fläche auf der anderen Seite des Chromosomenideogramms. Beispiele hierfür sind das Überwiegen von metastasierten Tumoren bei Deletionen auf Chromosom 4q (rote Fläche), dagegen liegen bei Überrepräsentationen vorwiegend nicht-metastasierte Tumoren vor (grüne Fläche).

Eine Veränderung, die gehäuft bei den metastasierten Tumoren auftrat, ist die Deletion von 3p22-p25. Andere Arbeiten weisen darauf hin, daß besonders in Adenokarzinomen der Lunge LOH von verschiedenen Bereichen von 3p mit einer geringeren Überlebensrate einhergehen (Mitsudomi et al., 1996), was unter anderem auch auf einem höheren Potential zur Metastasierung begründet sein kann. Dabei wurde allerdings nur ein Teil des bei der vorliegenden Studie betroffenen Abschnittes betrachtet.

Eine weitere wichtige Deletion, die signifikant häufiger bei metastasierten als bei nicht-metastasierten Adenokarzinomen auftrat, ist auf dem Chromosomenabschnitt 17p12-p13, wo auch p53 lokalisiert ist. Insgesamt ist dieser Bereich in Adenokarzinomen der Lunge zwar nur relativ selten von einer Deletion betroffen, wenn er betroffen ist, handelt es sich jedoch meist um


48

metastasierte Tumoren bzw. um Metastasen. Für p53 steht weniger die Inaktivierung durch Deletion im Mittelpunkt der Forschung als vielmehr die Inaktivierung durch Mutationen. Ist p53 in NSCLC von Mutationen betroffen, so geht das mit einer schlechteren Prognose mit geringerer Überlebensrate und aggressiverem Wachstum einher (Marchetti et al., 1998; Huang et al., 1998). Inwieweit auch die Inaktivierung durch Deletion eine Rolle für Überlebensrate, Wachstumsaggressivität und Metastasierung eine Rolle spielt, wird sich in Zukunft noch zeigen.

Ebenso war die Region 20p12 häufiger bei metastasierten Tumoren von Deletionen betroffen. Auch bei Plattenepithelkarzinomen des Halsbereiches (HNSCC) wurde in der Region 20p11-12 signifikant häufiger bei metastasierten als bei nicht-metastasierten Karzinomen eine Deletion gefunden (Bockmühl et al., 1997). Ob sich in diesem Bereich ein Tumorsuppressorgen befindet und welche Bedeutung es im Zellzyklus und bei der Metastasierung hat, wird anderen Studien vorbehalten bleiben.

Auch Überrepräsentationen traten auf bestimmten Chromosomenabschnitten signifikant häufiger bei metastasierten Tumoren bzw. Metastasen auf. Dazu gehörte z.B. die Region 11q12-q13, somit auch der Bereich, der CycD1 codiert. Wie bereits erwähnt, wurde diese Veränderung ebenfalls mit einer schlechteren Prognose assoziiert (Tanaka et al., 1998; Betticher et al.,1996).

Ob sich hinter den anderen von Überrepräsentationen betroffenen Regionen Onkogene verbergen und welche Bedeutung diesen von der Entwicklung eines nicht-metastasierenden zum metastasierenden Tumor zukommt, kann diese Studie nicht zeigen. Sie kann lediglich als Ansatz dienen, um nach Onkogenen und deren Bedeutung in den entsprechenden Bereichen, also 1q21, 14q11.1-q13, 5q24 und 20q12-13.1, zu suchen.

Folgende Regionen waren bei nicht-metastasierten Primärumoren signifikant häufiger von einer Überrepräsentation betroffen: 3p12-p14, 4q26-q28 und 5p14. Häufiger von einer Deletion betroffen war Chromosom 19, insbesondere der Bereich 19p13.1-p13.3. Diese Ergebnisse legen die Vermutung nahe, daß durch noch unbekannte Mechanismen diese Veränderungen einen gewissen Schutz vor Metastasierung bieten.


49

6. Aussicht

6a. Die CGH in der genetischen Tumordiagnostik

Im Rahmen von Klonalitätsanalysen kann die Methode hilfreich zur Differenzierung zwischen einem Zweittumor und einem Tumorrezidiv sein. Im Falle eines Rezidivs würde sich das Muster an Veränderungen beim Vergleich der beiden Tumoren sehr ähneln, beim Auftreten eines Zweittumors würden sich die Muster in einem höheren Grad unterscheiden.

Ähnliches gilt für die Zuordnung von Metastase und Primärtumor. Wie gezeigt wurde, ist das Muster der Veränderungen in Primärtumor und Metastase sehr ähnlich. Bei einem Patienten mit zwei Primärtumoren unterschiedlicher Lokalisation kann diese Methode also hilfreich sein bei der Zuordnung der Metastase zu einem der beiden Tumoren. Außerdem wäre es gegebenenfalls möglich, zu unterscheiden, ob eine Metastase dem bekannten Primärtumor zuzuordnen ist, oder ob bei dem Patienten ein bisher unentdeckter Zweittumor vorliegt.

Die Hauptbedeutung liegt jedoch in der Möglichkeit, das gesamte Genom eines Tumors betrachten zu können und nicht nur punktuelle Veränderungen zu diagnostizieren. Wie bereits von unserer Arbeitsgruppe gezeigt wurde (Petersen et al., 2000a; Petersen et al., 2000b, Schwendel et al., 1997) und wie auch durch diese Arbeit gestützt, können CGH-Untersuchungen dazu beitragen, Kandidatenregionen für Gene zu identifizieren, die möglicherweise metastasierungs-relevante Gene beherbergen. Unsere Untersuchungen wie die anderer Arbeitsgruppen (z.B. Gronwald et al 1997) haben zu einem besseren Verständnis der genetischen Mechanismen im Rahmen der Metastasierung beigetragen.

Es ist daher anzunehmen, daß die CGH auch in Zukunft zu der Aufdeckung weiterer relevanter chromosomalen Imbalancen und damit zur Identifizierung neuer Tumor-assoziierter Gene beitragen wird.

Die Methode ist inzwischen als Screening-Methode in der Krebsforschung etabliert (Forozan et al., 1997). Konzeptionell hat sie zudem den Weg eröffnet für die Entwicklung anderer "Genome-Scanning"-Methoden, wie z.B. der Microarray-Technologie, die ebenso auf der Co-Hybridisierung unterschiedlich Fluoreszenz-markierter Test- und Referenzproben basieren (Brown & Botstein 1999; Pollack et al., 1999).

Eine Aufnahme der CGH in die Routinediagnostik bleibt jedoch unwahrscheinlich, da diese Methode sehr arbeitsintensiv und zeitaufwendig ist. In Einzelfällen wurde jedoch gezeigt, daß die Methode durchaus zur Diagnosefindung beitragen kann, wie z.B. bei der Differenzierung von abnormalen Fällen von Mesotheliomen und Lungentumoren (Bjorkqvist et al., 1998).


50

6b. Weitere Untersuchungen

Für einzelne der besonders häufig von Veränderungen betroffenen Regionen sind bereits Onkogene oder Tumorsuppressorgene bekannt, für die meisten chromosomalen Regionen trifft das jedoch nicht zu. Beispielsweise gilt dies für die sehr häufig von Überrepräsentationen betroffenen Regionen 1q21-q43, 5p14-p15, 17q24-q25 und 19q13.1. Es liegt die Vermutung nahe, daß in diesen Regionen entweder Onkogene oder aber andere Tumor-assoziierte Gene lokalisiert sind, deren Fehlfunktion mit einer erhöhten Kopienzahl des sie beherbergenden Chromosomenregion einher gehen. Um neue Kandidatengene zu identifizieren, haben wir kürzlich Bibliotheken differentiell exprimierter Gene in Lungenkarzinomen etabliert (Petersen et al., 2000c). Eines dieser Gene, die in der Kandidatenregion 1q24-q25 lokalisiert ist, konnten wir mittlerweile vollständig charakterisieren. Passend zu den CGH-Daten scheint die Überexpression des sogenannten humanen Calcyclin-bindenden Protein mit der Tumorprogression assoziiert zu sein (Petersen et al., 2000d). Die Charakterisierung vieler weiterer Gene, insbesondere auch der Tumorsuppressor-Gene, die in den häufig deletierten Regionen lokalisiert sind, steht jedoch noch aus. Die CGH Untersuchungen stellen dabei eine Basis für die Selektion der vielversprechenden Kandidatengene dar.


[Titelseite] [1] [2] [3] [4] [5] [6] [Bibliographie] [Abkürzungsverzeichnis]

© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.

DiML DTD Version 2.0
Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML - Version erstellt am:
Thu Sep 14 12:27:57 2000