Biochemical Composition of Protists:
Dependency on Diet and Trophic Mode and
Consequences for their Nutritional Quality

D i s s e r t a t i o n

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum agriculturarum
(Dr. rer. agr.)

eingereicht an der
Landwirtschaftlich-Gärtnerischen Fakultät
der Humboldt-Universität zu Berlin

von
Dipl. Biol. Iola Gonçalves Boëchat

geboren 15.08.1974 in Belo Horizonte (Brasilien)

Präsident

der Humboldt-Universität zu Berlin

Prof. Dr. Jürgen Mlynek

Dekan: Dekan der
Landwirtschaftlich-Gärtnerischen Fakultät:
Prof. Dr. Uwe Jens Nagel

Gutachter:
1. Prof. Nobert Walz
2. Prof. Klaus Hausmann
3. Prof. Carsten Schulz

Tag der mündlichen Prüfung: 15. 02. 2005


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Organisms are chemical entities

and are produced, maintained,

and propagated by chemical reactions,

albeit in the form of highly complex

coupled networks, which are the

product of evolution.

(Sterner & Elser 2002)


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Summary

Variation in the rate at which organic carbon is transferred across trophic levels in aquatic food webs is quite large, which may be partially related to differences in the food quality of planktonic prey organisms. Organic carbon is allocated into various biochemical molecules that differ greatly in their energy content and essentiality for zooplankton predators. Thus, the measurement of the biochemical composition of planktonic organisms is an efficient tool to evaluate their nutritional quality as prey. Among the most important compounds conferring nutritional quality on planktonic prey organisms are essential fatty acids, amino acids, and more recently, sterols. Although it has been widely accepted that heterotrophic protists are an important component linking the microbial and the classical food webs, relative little is known about their biochemical composition and resulting nutritional quality as prey. In this thesis I have considered two main aspects of the biochemical composition of protists: (1) whether the biochemical composition depends on the dietary resources or the trophic mode of the protist; and (2) whether biochemical composition determines nutritional quality of protists as prey for zooplankton.

The fatty acid, amino acid, and sterol composition of four heterotrophic protist species was analysed and compared to the composition of the respective dietary resources. The algivorous ciliates Balanion planctonicum and Urotricha farcta were fed the cryptomonad Cryptomonas phaseolus; the bacterivorous ciliate Cyclidium sp. and the flagellate Chilomonas paramecium were fed bacteria grown on rice corns. The fatty acid and amino acid composition of the heterotrophic protists generally resembled the composition found in their diet. However, the protists accumulated fatty acids and amino acids. B. planctonicum and U. farcta showed higher carbon-specific concentrations of monounsaturated and some polyunsaturated fatty acids than their algal diet C. phaseolus. Moreover, except for tryptophan, valine, and lysine, higher carbon-specific amino acid concentrations were observed in both B. planctonicum and U. farcta than in C. phaseolus. Cyclidium sp. and C.paramecium had higher carbon-specific concentrations of polyunsaturated fatty acids and amino acids than their diet, except for histidine, methionine, and leucine. Cell-specific fatty acid concentrations were generally higher in algivores than in bacterivores, while cellular-specific amino acid concentrations were similar among protists. The sterol composition of the protists was less dependent on dietary composition than the fatty acid and amino acid composition. Ergosterol was the main sterol in the algal diet C. phaseolus, whereas stigmasterol was dominant in its predators B.


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planctonicum and U. farcta. The bacterial diet was rich in cholesterol and sitosterol, whereas cholesterol and stigmasterol were the major sterols in bacterivores Cyclidium sp. and C. paramecium. Higher sterol concentrations in the protists than in their diet indicate sterol accumulation by the protists. Efficient ingestion and assimilation of lipids and amino acids, preferential metabolism of carbohydrated compounds, and synthesis of some biochemicals are mechanisms likely underlying accumulation of biochemical compounds in the heterotrophic protists.

To evaluate whether the biochemical composition depends on the trophic mode of protist, the fatty acid and sterol composition of autotrophically, mixotrophically, and heterotrophically cultured flagellates of a species from the genus Ochromonas were evaluated. The trophic mode strongly affected the biochemical composition of Ochromonas sp.. Especially the concentrations of polyunsaturated fatty acids decreased from autotrophy, via mixotrophy to heterotrophy. Discriminant analyses identified polyunsaturated fatty acids as the biochemical components which varied the most among Ochromonas sp. of different trophic modes. As several protist species exhibit different trophic modes within the same species (e.g. Ochromonas sp. and other chrysophyceae) – a nutritional flexibility that enables them to subsist under different environmental conditions – a great variability in their nutritional quality is expected for their predators.

The role of the biochemical composition in determining the nutritional quality of heterotrophic protists as prey was tested in population growth and reproduction experiments, using the rotifer Keratella quadrata as model predator. Several polyunsaturated fatty acids, three sterols (desmosterol, ergosterol, stigmastanol), and the amino acid leucine in the heterotrophic protists were significantly correlated with the rotifer’s egg production. However, no correlation was observed between protists’ biochemistry and population growth rates of K. quadrata. Based on the correlative evidences, the effects of single fatty acids on Keratella’s performance were tested by artificially supplementing Chilomonas paramecium with the fatty acids eicosapentaenoic acid (EPA) and docosahexaenoic acid (DHA). The nutritional quality of C. paramecium was significantly enhanced by supplementing the flagellate with DHA. EPA effects were weaker and not significant. However, effects were again only found for the egg production but not for population growth of K. quadrata.

In the present thesis, I provided evidence that the biochemical composition of protists depends on their dietary resources as well as on their trophic mode.


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However, heterotrophic protists exhibited the potential to accumulate or even modify biochemical substances obtained from their diet. Moreover, the biochemical composition of the studied protists influenced the reproduction of a zooplankton predator. My results thus highlight the necessity to incorporate heterotrophic protists into food quality studies, because of their ability to modify the biochemical composition of organic matter at an early stage in aquatic food webs, i.e. at the interface between algae/bacteria and the mesozooplankton. Considering the high energy density and essentiality of some biochemical compounds (such as lipids), small biochemical modifications at this early stage may have profound consequences for matter and energy transfer through the entire food web.


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Zusammenfassung (German)

Die Variation in den Transferraten mit denen organischer Kohlenstoff in aquatischen Nahrungsnetzen auf die nächste trophische Ebenen übertragen wird, ist groß. Dies könnte teilweise auf Unterschiede in der Nahrungsqualität planktischer Beuteorganismen zurückzuführen sein. Organischer Kohlenstoff liegt in den Beuterganismen in Form verschiedener biochemischen Stoffe vor, die sich bezüglich ihres Energiegehaltes und ihrer Essentialität für planktische Räuber unterscheiden. Die Messung der biochemischen Zusammensetzung planktischer Beuteorganismen stellt somit die geeignete Methode zur Bestimmung ihrer Nahrungsqualität dar. Essentielle Fettsäuren, Aminosäuren und seit neuestem auch Sterole sind die am besten untersuchten Kohlenstoffverbindungen, die die Nahrungsqualität planktischer Beuteorganismen bestimmen. Trotz der allgemein akzeptierten Schlüsselstellung heterotropher Protisten als Bindeglied zwischen dem mikrobiellen und dem klassischen Nahrungsnetz ist noch wenig über ihre biochemische Zusammensetzung und ihre daraus resultierende Nahrungsqualität bekannt. In der vorliegenden Doktorarbeit habe ich drei Hauptaspekte der Biochemie von Protisten untersucht, nämlich ob die biochemische Zusammensetzung von Protisten (1) von deren Nahrungsgrundlage und Ernährungsweise abhängt und (2) ihre Nahrungsqualität für räuberisches Zooplankton bedingt.

Hierzu wurde die Fettsäure-, Aminosäure- und Sterolzusammensetzung von vier heterotrophen Protistenarten untersucht und mit der biochemischen Zusammensetzung ihrer Nahrungsgrundlage verglichen. Die algivoren Ciliaten Balanion planctonicum und Urotricha farcta wurden auf der Cryptomonade Cryptomonas phaseolus kultiviert, der bakterivore Ciliat Cyclidium sp. und der bakterivore Flagellat Chilomonas paramecium auf Bakterienkulturen, die auf Reiskörnern wuchsen. Die Fettsäure- und Aminosäurezusammensetzung der heterotrophen Protisten ähnelte generell der ihrer Nahrung. Es trat jedoch eine Akkumulation von Fettsäuren und Aminosäuren in den Protisten auf. B. planctonicum and U. farcta wiesen höhere kohlenstoffspezifische Konzentrationen von allen einfach ungesättigten und einigen mehrfach ungesättigten Fettsäuren auf als ihre Futteralge Cryptomonas. Weiterhin wurden in B. planctonicum and U. farcta, mit Ausnahme von Tryptophan, Valin und Lysine, höhere kohlenstoffspezifische Aminosäurekonzentrationen gemessen als in Cryptomonas. Cyclidium sp. und C.paramecium wiesen zudem, mit Ausnahme von Histidin, Methionin und Leucin, höhere kohlenstoffspezifische Konzentrationen von mehrfach ungesättigten Fettsäuren und Aminosäuren auf als


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ihr Futter. Bei den algivoren Protisten traten generell höhere zellspezifische Fettsäurekonzentrationen auf als bei den bakterivoren. Die zellspezifischen Aminosäurekonzentrationen der Protisten wiesen keine Unterschiede auf. Die Sterolzusammensetzung der Protisten hing weniger stark von der der Nahrung ab als die Fettsäure- und Aminosäurezusammensetzung. Ergosterol war das wichtigste Sterol der Alge Cryptomonas, wohingegen Stigmasterol das wichtigste Sterol ihrer Räubern B. planctonicum und U. farcta war. Die Bakterienkultur war reich an Cholesterol and Sitosterol, wohingegen bei den bakterivoren Protisten Cyclidium sp. and C. paramecium Cholesterol und Stigmasterol dominierte. Wiederum traten in den Protisten höhere Sterolkonzentrationen als in ihrer Nahrung auf. Eine solche Akkumulation von biochemischen Substanzen kann auf effiziente Ingestion und Assimilation, bevorzugte Umsetzung von Kohlenhydraten oder Synthese zurückzuführen sein.

Weiterhin wurde die Fettsäure- und Sterolzusammensetzung von autotroph, mixotroph und heterotroph kultivierten Flagellaten einer Art der Gattung Ochromonas untersucht, um zu prüfen, ob die biochemische Zusammensetzung von Protisten von ihrer Ernährungsweise abhängt. In der Tat bedingte die Ernährungsweise des Flagellaten Ochromonas sp. stark dessen biochemische Zusammensetzung. Insbesondere die Konzentrationen an mehrfach ungesättigten Fettsäuren waren in autotrophen Flagellaten höher als in mixotrophen und in mixotrophen höher als in heterotrophen. Mittels Diskriminanzanalysen konnte zudem gezeigt werden, daß mehrfach ungesättigten Fettsäuren die biochemischen Substanzen waren, die am stärksten zwischen Ochromonas sp. unterschiedlicher Ernährungsweise variierten. Da einige Protistenarten mit verschiedenen Ernährungsweisen innerhalb derselben Art vorkommen (z.B. Ochromonas spp. und andere Chrysophyceen) – diese Flexibilität ermöglicht es ihnen bei unterschiedlichen Umweltbedingungen zu existieren – ist zu vermuten, daß solche Arten große Unterschiede in ihrer Nahrungsqualität für Räuber aufweisen.

Die Frage, ob die biochemische Zusammensetzung heterotropher Protisten ihre Nahrungsqualität für planktische Räuber bedingt, wurde anhand des Populationswachstums und der Reproduktion der Rotatorie Keratella quadrata, einem wichtigen planktischen Räuber, untersucht. Verschiedene mehrfach ungesättigte Fettsäuren, drei Sterole (Desmosterol, Ergosterol, Stigmastanol) und die Aminosäure Leucin in den Protisten waren signifikant mit der Eiproduktion von K. quadrata korreliert. Es wurden jedoch keine Korrelationen zwischen der Biochemie der Protisten und dem Populationswachstum von K. quadrata gefunden. Zur näheren Untersuchung dieser korrelativen Befunde wurde der [page 6↓]Flagellat Chilomonas paramecium, der eine geringe Nahrungsqualität aufwies, künstlich mit den mehrfach ungesättigten Fettsäuren Eicosapentaensäure (EPA) und Docosahexaensäure (DHA) supplementiert und an K. quadrata verfüttert. DHA erhöhte die Nahrungsqualität von C. paramecium signifikant. Die Wirkung von EPA war schwächer und nicht signifikant. Diese Effekte wirkten wiederum nur auf die Eiproduktion, nicht aber auf das Populationswachstum von K. quadrata.

In der vorliegenden Doktorarbeit konnte gezeigt werden, daß die biochemische Zusammensetzung von Protisten von deren Nahrungsgrundlage und Ernährungsweise abhängt. Heterotrophe Protisten zeigten jedoch auch das Potential von ihrer Nahrung erhalten biochemische Verbindungen zu akkumulieren oder sogar zu verändern. Weiterhin bestimmte die biochemische Zusammensetzung der Protisten die Reproduktionsleistung eines planktischen Räubers. Die Ergebnisse meiner Untersuchungen verdeutlichen somit die Notwendigkeit, heterotrophe Protisten in Studien zur Nahrungsqualität zu berücksichtigen, da sie das Potential besitzen, die biochemische Zusammensetzung organischer Materie schon auf einer unteren Ebene des aquatischen Nahrungsnetzes zu verändern, nämlich beim Übergang zwischen Algen/Bakterien und dem Mesozooplankton. Aufgrund der hohen Energiedichte und Essentialität verschiedener biochemischer Substanzen (wie z.B. Lipiden), können kleine Änderungen in der Biochemie der organischen Materie auf einer so niedrigen trophischen Ebene bereits weitreichende Folgen für den Stoff- und Energiefluß durch das gesamte Nahrungsnetz nach sich ziehen.


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Resumo (Portuguese)

A considerável variação nas taxas de transferência de biomassa carbônica ao longo de níveis tróficos em cadeias alimentares aquáticas provavelmente se deve a diferenças na qualidade alimentar dos organimos planctônicos. O carbono na biomassa se encontra alocado na forma de diferentes compostos bioquímicos, alguns destes considerados essenciais para muitos predadores zooplanctônicos. Desta forma, a composição bioquímica é uma ferramenta eficiente para se avaliar a qualidade nutricional dos organismos planctônicos como presas para o zooplâncton. Dentre os compostos bioquímicos mais bem relatados como determinantes da qualidade nutricional de presas planctônicas, encontram-se os ácidos graxos, aminoácidos e, mais recentemente, esteróis. Embora a importância de protistas heterotróficos como um elo de ligação entre as cadeias microbiana e clássica seja bem reconhecida, pouco se sabe sobre a composição bioquímica e conseqüente qualidade nutricional de protistas heterotróficos. Neste trabalho foram considerados dois aspectos fundamentais da composição bioquímica de protistas: (1) se a mesma depende do recurso alimentar ou do modo trófico do protista e (2) se a composição bioquímica de protistas determina sua qualidade nutricional para predadores zooplanctônicos.

A composição de ácidos graxos, aminoácidos e esteróis de quatro espécies de protistas heterotróficos foi analisada e comparada com a composição de suas respectivas dietas. Os ciliados algívoros Balanion planctonicum e Urotricha farcta foram alimentados com Cryptomonas phaseolus; o ciliado bacterívoro Cyclidium sp. e o flagelado Chilomonas paramecium foram mantidos com bactérias cultivadas em grãos de arroz. A composição de ácidos graxos e aminoácidos dos protistas geralmente refletiu a composição da dieta, mas acumulação de compostos bioquímicos foi observada na maioria dos casos. B. planctonicum e U. farcta apresentaram concentrações (por biomassa de carbono) mais elevadas de ácidos graxos monoinsaturados e alguns poliinsaturados do que a dieta algal. Ainda, exceto por triptofano, valina e lisina, concentrações mais elevadas de aminoácidos foram observados em ambos B. planctonicum e U. farcta do que em Cryptomonas. Cyclidium sp. e C.paramecium apresentaram concentrações mais elevadas de ácidos graxos poliinsaturados e de aminoácidos do que a dieta bacteriana, exceto para histidina, metionina e leucina. Protistas algívoros apresentaram concentrações celulares mais elevadas de ácidos graxos do que bacterívoros, enquanto nenhum padrão foi observado para os aminoácidos. A composição de esteróis, por sua vez, foi mais independente do recurso alimentar. Por exemplo, ergosterol foi o principal eserol em C. phaseolus, enquanto [page 8↓]estigmasterol predominou em B. planctonicum e U. farcta. A dieta bacteriana foi rica em colesterol e sitosterol, enquanto Cyclidium sp. e C. paramecium apresentaram respectivamente colesterol e estigmasterol como principais esteróis. Concentrações mais elevadas de esteróis nos protistas do que em suas dietas sugere novamente a acumulação bioquímica nos protistas. Características metabólicas tais como eficiência de ingestão e assimilação, metabolismo preferencial de carboidratos e biosíntese são prováveis mecanismos explicando a acumulação de compostos bioquímicos nos protistas heterotróficos.

O modo trófico – autotrofia, mixotrofia, heterotrofia – afetou consideravelmente a composição bioquímica dos protistas. Foram analisadas as composições de ácidos graxos e esteróis do flagelado Ochromonas sp. crescendo como autótrofo, mixotrófico e heterotrófico. Em especial as concentrações de ácidos graxos poliinsaturados apresentaram uma pronunciada redução à medida em que o modo trófico passou da autotrofia, via mixotrofia, para a heterotrofia. Segundo as análises discriminantes, ácidos graxos poliinsaturados foram o parâmetro bioquímico variando mais intensamente entre Ochromonas sp. de diferentes modos tróficos, assim como entre diferentes espécies de protistas heterotróficos. O fato de que uma única espécie protista (como Ochromonas sp. e outras chrysophyceae) é capaz de exercer diferentes modos tróficos – uma flexibilidade nutricional que confere à essa espécie a capacidade de viver em diferentes ambientes – uma considerável variação na composição bioquímica, e por conseguinte, na qualidade nutricional pode ser esperada por um predador desta espécie.

O papel da composição bioquímica em determinar a qualidade nutricional de protistas heterotróficos foi testada durante experimentos de crescimento populacional e reprodução, usado o rotífero Keratella quadrata como predador-modelo. O conteúdo de vários ácidos graxos poliinsaturados, três esteróis (desmosterol, ergosterol, and stigmastanol) e do aminoácido leucina nos protistas heterotróficos correlacionou-se significantemente com a produção de ovos do rotífero. No entanto, nenhuma correlação foi observada com as taxas de crescimento populacional de K.quadrata. Com base nas evidências correlativas encontradas, os efeitos limitantes de ácidos graxos (EPA e DHA) sobre a performance de Keratella foram testados por meio de suplementação artificial de Chilomonas paramecium. A qualidade nutricional de C. paramecium foi elevada através da suplementação com ácido docosahexaenóico (DHA). Os efeitos da suplementação com ácido eicosapentaenóico (EPA) foram mais fracos e não-significantes. Como encontrado anteriormente, os efeitos limitantes só foram [page 9↓]observados com relação a produção de ovos, mas não com o crescimento populacional dos rotíferos.

O presente trabalho fornece evidência de que a composição bioquímica de espécies protistas depende da natureza do recurso alimentar assim como do modo trófico do protista. No entanto, protistas heterotróficos exibiram o potencial para acumular ou até mesmo modificar componentes bioquímicos obtidos em sua dieta. Ainda, a composição bioquímica das espécies protistas analisadas influenciou a reprodução de um predador zooplanctônico. Os resultados aqui apresentados sobre a composição bioquímica em protistas heterotróficos enfatizam a necessidade de se incorporar esses organismos em estudos de qualidade alimentar, devido à sua habilidade em modificar a composição bioquímica em um estágio inicial da cadeia trófica aquática, isto é, na interface localizada entre alga/bactéria e o mesozooplâncton. Tendo em vista o elevado conteúdo energético e o papel essencial de alguns compostos bioquímicos (como lípides), pequenas modificações bioquímicas num estágio inicial da cadeia podem afetar profundamente a transferência de matéria e energia ao longo da cadeia trófica.

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20.05.2005