Aus der Franz-Volhard-Klinik
Abteilung für Nephrologie und Hypertensiologie
der Medizinischen Fakultät Charité
Campus Berlin-Buch
der Humboldt-Universität zu Berlin

DISSERTATION

Untersuchung zur quantitativen Genexpression
in Primärkulturen humaner Adipocyten
am Beispiel ausgewählter Gene
des Renin-Angiotensin-Systems

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor rerum medicarum
(Dr. rer. medic.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

von
Frau Dipl.-Biol. Kerstin Gorzelniak

aus Berlin

Dekan: Prof. Dr. med. Joachim W. Dudenhausen

Gutachter:
1. Dr. med. A.M. Sharma
2. Prof. Dr. G. Löffler
3. Prof. Dr. rer. nat. S. Klaus

eingereicht:5. September 2001

Datum der Promotion:18. März 2002

Meiner Familie

Inhaltsverzeichnis

• 1 Einleitung
  • 1.1  Allgemeiner Überblick
  • 1.2 Theoretischer Hintergrund
    • 1.2.1  Adipositas
    • 1.2.2 Adipositas-assoziierte Hypertonie
    • 1.2.3 Das Renin-Angiotensin-System
      • 1.2.3.1  Renin
      • 1.2.3.2 Angiotensinogen
      • 1.2.3.3 Angiotensin-Converting-Enzym
      • 1.2.3.4 Angiotensinrezeptoren
    • 1.2.4 Das lokale adipocytäre Renin-Angiotensin-System
    • 1.2.5 Hormonelle Regulation der Genexpression des Renin-Angiotensin-Systems
  • 1.3 Problematik der Adipocytenforschung
  • 1.4 Vorarbeiten
  • 1.5 Problemstellung und Zielsetzung
• 2  Material
  • 2.1  Geräte
  • 2.2 Spezielle Materialien
  • 2.3 Chemikalien
  • 2.4 Primer und Sonden
  • 2.5 Kits
  • 2.6 Enzyme und PCR-Reagenzien
  • 2.7 Lösungen, Medien, Puffer
  • 2.8 Antikörper
• 3  Methoden
  • 3.1  Isolierung und Kultivierung humaner Adipocyten
    • 3.1.1  Adipocytenisolierung
    • 3.1.2 Adipocytenkultivierung
    • 3.1.3 Zellzahlbestimmung bei Adipocyten
    • 3.1.4 Vitalfärbung von Adipocyten
    • 3.1.5 Überprüfung der Isolierungs- und Kultivierungsbedingungen
  • 3.2 RNA-Isolierung
    • 3.2.1  RNA-Isolierungsmethoden
      • 3.2.1.1  Differenzielle Präzipitation
      • 3.2.1.2 Saure Phenol-Chloroform-Extraktion
      • 3.2.1.3 CsCl–Gradienten-Zentrifugation
      • 3.2.1.4 RNA-selektive Silikatmembran
    • 3.2.2 Optimiertes Protokoll zur Isolierung von Gesamt-RNA aus ausdifferenzierten Adipocyten
  • 3.3  Bestimmung der RNA-Konzentration und Integritätsprüfung
  • 3.4 DNase I - Behandlung
  • 3.5 Reverse Transkription
  • 3.6 TaqMan-Real-Time-PCR zur Quantifizierung der Genexpression
    • 3.6.1  Prinzip der TaqMan-PCR
    • 3.6.2 Durchführung der TaqMan-PCR
    • 3.6.3 Auswertung der TaqMan-PCR
    • 3.6.4 Relative Quantifizierung
  • 3.7 Auswahl einer endogenen Kontrolle
  • 3.8 Stimulationsexperimente
  • 3.9 Indirekte Immunfluoreszenz und konfokale Mikroskopie
  • 3.10 Datenverarbeitung und Statistik
• 4  Ergebnisse
  • 4.1  Bestimmung der Zellzahl in Adipocytensuspensionskulturen mit dem R/S 1000
  • 4.2 Bestimmung der Vitalität ausdifferenzierter Adipocyten in einer Suspensionskultur
  • 4.3 Überprüfung der Isolierungs- und Kultivierungsbedingungen
  • 4.4 RNA-Isolierung
  • 4.5 TaqMan-PCR
    • 4.5.1  Auswahl der endogenen Kontrolle
    • 4.5.2 Relative Expressionsstärke der Gene des Renin-Angiotensin-Systems in ausdifferenzierten Adipocyten
  • 4.6 Stimulationsexperimente
  • 4.7 Anstieg der AT1-Rezeptorzahl unter Hydrocortisonstimulation
• 5  Diskussion
  • 5.1  Etablierung eines in vitro Systems zur Durchführung von Genexpressions-untersuchungen an primären humanen Adipocyten
    • 5.1.1  Zellzahlbestimmung in Suspensionskulturen ausdifferenzierter Adipocyten
    • 5.1.2 Vitalitätsbestimmung in Suspensionskulturen ausdifferenzierter Adipocyten
    • 5.1.3 In vitro Kultur
    • 5.1.4 RNA-Isolierung
    • 5.1.5 TaqMan-PCR
    • 5.1.6 Endogene Kontrollen
  • 5.2 Das adipocytäre Renin-Angiotensin-System
    • 5.2.1  Expression eines vollständigen adipocytären RAS
    • 5.2.2 Bedeutung des adipocytären Renin-Angiotensin-Systems
  • 5.3 Hormonelle Regulation des RAS
    • 5.3.1  Glucocorticoidstimulation der Genexpression des Angiotensin II-Rezeptors Typ 1 (AGTR1)
  • 5.4 Schlußfolgerung und Ausblick
• 6  Zusammenfassung
• Abkürzungsverzeichnis
• Literaturverzeichnis
• Danksagung
• Eidesstattliche Erklärung

Tabellen

• Tabelle 1: Klassifizierung der Adipositas und Risiko für Folgeerkrankungen entsprechend den WHO-Richtlinien von 1997.  22
• Tabelle 2: Endkonzentration der für die TaqMan-Real-Time-PCR verwendeten Primer und Sonden, sowie die jeweilige Länge der amplifizierten Sequenz.
• Tabelle 3: Endogene Kontrollen der „Human Endogenous Control Plates“ (Fa. PE Biosystems)
• Tabelle 4: Untersuchte Stimuli auf die Genexpression der verschiedenen endogenen Kontrollen.
• Tabelle 5: Vergleich der verschiedenen Methoden zur Isolierung von Gesamt-RNA aus ausdifferenzierten Adipocyten.
• Tabelle 6: Relative Genexpression der RAS-Gene und des Leptingens in humanen Adipocyten.

Bilder

• Abbildung 1: Überblick über diesekretorische Aktivität des Adipocyten.
• Abbildung 2: Schema des Renin-Angiotensin-System
• Abbildung 3: Prinzip der TaqMan-PCR. A: Primer-Extension (R = Reporter, Q = Quencher), B: Ausbildung der Y-förmigen Sekundärstruktur, C: Sondenhydrolyse, D: Abschluß der Polymerisation.
• Abbildung 4: Schema eines TaqMan-Amplifikationsplot.
• Abbildung 5: Prinzip der konfokalen Mikroskopie.
• Abbildung 6: Zellsuspension humaner Adipocyten (1,1 x 105 Zellen / ml) verteilt über zwei Gitter der Durchflußzählkammer des R/S 1000. Methylenblau-Färbung, 40-fache Vergrößerung.
• Abbildung 7: Zellzahl in Abhängigkeit von der Verdünnung. Angegeben sind für drei unabhängige Experimente Mittelwerte ± Standardabweichung; n = 6 bzw. n = 3 (*); die Korrelationskoeffizienten (nach Pearson) sind R = 1,000 (a, b) bzw. R = 0,998 (c), das Bestimmtheitsmaß der Regressiongeraden R ² = 0,999 (a), R ² = 0,997 (b) bzw. R ² = 0,996 (c) und die Signifikanzniveaus p < 0,001 (a, b) bzw. p = 0,002 (c)
• Abbildung 8: Vitalfärbung ausdifferenzierter Adipocyten mit Acridinorange. A: vitale Adipocyten mit grünen Zellkernen; B: Adipocyten mit nachlassender Vitalität (Zellkerne gelb-orange); C: Absterbende Adipocyten mit orange bis roten Zellkernen. 20-fache Vergrößerung.
• Abbildung 9: Gelelektrophorese der isolierten RNA. Es wurden jeweils 3 µg Gesamt-RNA (a) vor bzw. (b) nach der DNase I-Behandlung aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Zu sehen sind die 18S- und 28S-rRNA-Banden und die DNA-Kontaminationen (Pfeile).
• Abbildung 10: RT-PCR-Produkte der Pyruvat-Dehydrogenase Amplifikation. PDH-mRNA (102 bp), genomische PDH-DNA (185 bp). 1-3: Amplifikation nach DNase I-Verdau; 1) Saure Phenol-Chloroform-Extraktion, 2) RNA-selektive Membran, 3) Differentielle Präzipitation, L: 100-bp-Leiter; 4-9: Amplifikation verschiedener Proben der CsCl-Gradienten-Zentrifugation ohne vorherigen DNase I-Verdau,  P: Positivkontrolle für DNA-Kontaminationen (genomische DNA humaner Leukozyten).
• Abbildung 11: Relative Veränderungen der Genexpression ausdifferenzierter Adipocyten nach 12-stündiger hormoneller Stimulation bezogen auf unstimulierte Adipocyten (Kalibrator).
• Abbildung 12: Relative Veränderungen der Genexpression während der Adipocytendifferenzierung bezogen auf undifferenzierte Präadipocyten (Kalibrator).
• Abbildung 13: Exemplarischer TaqMan Plot der RAS-Gene in unstimulierten humanen Adipocyten.
• Abbildung 14: Relative AGT-, ACE- bzw. AGTR1-Genexpression ausdifferenzierter Adipocyten während 24-stündiger Stimulation bezogen auf die Genexpression unstimulierter Adipocyten des entsprechenden Zeitpunktes.
• Abbildung 15: Dosis-Wirkungskurve der AGTR1-Expression ausdifferenzierter humaner Adipocyten nach 24-stündiger Stimulation mit Hydrocortison. Angegeben sind Mittelwerte ± Standardabweichung der normalisierten Genexpression relativ zur unstimulierten Kontrolle. n = 3. Der Vergleich zwischen den Dosisgruppen erfolgte mittels ANOVA und nachfolgendem multiplen t-Test nach Bonferroni. * p ‹ 0,05 vs. unstimulierte Adipocyten; ^# p ‹ 0,05 vs. 1 nM, 10 nM 100 nM, 100 µM Hydrocortison; ⁺ p ‹ 0,05 vs. alle anderen Hydrocortisonkonzentrationen.
• Abbildung 16: Relative REN - bzw. AGTR2 -Expression nach 24 Stunden bezogen auf unstimulierte Adipocyten (Kalibrator). Angegeben sind Mittelwerte ± Standardabweichung; n = 4; UN (unstimuliert), Hy (100 µM Hydrocortison), In (1 µM Insulin), E (1 µM 17-β -Estradiol), T3 (1 µM Triiodo-L-Thyronin ), Ang II (1 µM Angiotensin II).
• Abbildung 17: Indirekte Immunfluoreszenzdetektion des AT1-Rezeptors in ausdifferenzierten humanen Adipocyten nach 1 bzw. 3-tägiger Stimulation mit Hydrocortison. A : Konfokalmikroskopische Bilder repräsentativer Zellen. B : Immunfluoreszenzintensitäten unstimulierter und stimulierter (100 µM Hydro-cortison) Adipocyten nach 1 bzw. 3 Tagen Inkubatuion. Angegeben sind Mittelwerte ± Standardabweichung der Immunfluoreszenzintensität von je 20 fixierten Zellen pro Gruppe. Der Vergleich zwischen den Dosisgruppen erfolgte mittels ANOVA und nachfolgendem multiplen t-Test nach Bonferroni. * p ‹ 0,001 vs. unstimulierte Adipocyten (Tag 1 und 3) und stimulierte Adipocyten (Tag 1).