1 Einleitung

1.1  Allgemeiner Überblick

↓1

In den letzen Jahren konnte gezeigt werden, daß Fettgewebe nicht nur ein inerter Fettspeicher ist sondern vielmehr ein Organ mit vielfältigen metabolischen, endokrinen, parakrinen und autokrinen Funktionen. 1, 2 Eine der bedeutendsten Entdeckungen in diesem Zusammenhang war die des Leptins, eines spezifisch nur vom Fettgewebe gebildeten Hormons,  3 das an der Regulation der Nahrungsaufnahme und des Energiehaushalts beteiligt ist  4 , 5 und als Maß des Körperfettgehalts gilt.  6

Darüber hinaus exprimieren Adipocyten verschiedene Cytokine (z. B. Interleukine, TNF-α) und Transkriptionsfaktoren (C/EBP- und PPAR–Familie), die an der Regulation des Lipidstoffwechsels (TNF-α, PPARγ2 ) beteiligt sind  7 , 8 , 9 oder die Fettzelldifferenzierung (PPARγ, C/EBPα, -β, -δ) beeinflussen.  10 - 13 Die Synthese von Adipsin (Komplementfaktor D) scheint außerdem auf eine Rolle des Fettgewebes bei der Immunantwort hinzudeuten.  14 - 16 Außerdem konnte in Untersuchungen an Nagetieren und später auch am Menschen die Existenz eines lokalen adipocytären Renin-Angiotensin-Systems (RAS)  17 und die Produktion anderer an der Blutdruckregulation beteiligter Substanzen (Endothelin-1, NO-Synthasen, Prostaglandine) nachgewiesen werden.  2 , 18 - 21 Derart vielfältige Funktionen lassen vermuten, daß das Fettgewebe eine größere Rolle bei der Entstehung von Erkrankungen spielt als bislang angenommen wurde.  2

Abbildung 1: Überblick über diesekretorische Aktivität des Adipocyten.

1.2 Theoretischer Hintergrund

1.2.1  Adipositas

↓2

Adipositas stellt sowohl in den industrialisierten als auch in den nichtindustrialisierten Ländern ein großes Gesundheitsrisiko dar und ist ein wichtiger Risikofaktor für eine Reihe verschiedener Erkrankungen.  22 Als Übergewicht wird eine über das Normalmaß hinausgehende Vermehrung der Körperfettmasse bezeichnet. Aus medizinischer Sicht erlangt Übergewicht dann einen Krankheitswert, wenn damit eine Beeinträchtigung wichtiger Organfunktionen bzw. eine erhöhte Morbidität und Mortalität verbunden ist.

Zur Beschreibung und Klassifikation der Adipositas ist z. Z. die Verwendung des Körpermasseindexes (BMI) am gebräuchlichsten, da er gut mit der Körperfettmasse korreliert.  22 Der BMI ergibt sich aus dem Quotienten des Körpergewichts [kg] und dem Quadrat der Körpergröße [m2] und ist bei Erwachsenen (≥ 18 Jahren) weder geschlechts- noch altersspezifisch.

Aufgrund der Zunahme von Folgeerkrankungen mit ansteigendem BMI werden laut Weltgesundheitsorganisation (WHO) folgende Gruppen unterschieden.  22

↓3

Tabelle 1: Klassifizierung der Adipositas und Risiko für Folgeerkrankungen entsprechend den WHO-Richtlinien von 1997.  22

Adipositas-Grad

BMI [kg/m 2 ]

Risiko für Folgeerkrankungen laut WHO

Normalgewicht

18,5 – 24,9

durchschnittlich

Übergewicht

25,0 – 29,9

leicht erhöht

Adipositas Grad I

30,0 – 34,9

erhöht

Adipositas Grad II

35,0 – 39,9

stark erhöht

Adipositas Grad III

> 40,0

sehr stark erhöht

Zu den pathophysiologischen Veränderungen bei Adipositas gehören insbesondere Hypertonie,  23> Insulinresistenz mit Hyperinsulinämie  24 sowie Hyperlipidämie  25 und Hyperuricämie.  26 Diese Veränderungen werden allgemein unter dem Begriff des metabolischen Syndroms zusammengefaßt.  27 Neben dem metabolischen Syndrom und den daraus resultierenden kardiovaskulären Erkrankungen (Myokardinfarkt, Schlaganfall)  25 gehören auch Erkrankungen der Gallenblase  28 und des Bewegungsapparates  29 sowie eine Reihe bösartiger Tumorerkrankungen (z. B. Mammakarzinom)  30 zu den Adipositas-assoziierten Erkrankungen.

1.2.2 Adipositas-assoziierte Hypertonie

Adipositas gehört zu den wichtigsten Risikofaktoren für die Entwicklung der Hypertonie. So zeigt z. B. die NHANES III Studie eine Zunahme der Hypertoniehäufigkeit mit dem Grad der Adipositas von 23 % bei Normalgewichtigen auf 48 % bei Adipositas Grad I und auf 60 % bei Adipositas Grad II.  31

↓4

Als Pathomechanismen der Adipositas-induzierten Hypertonie werden vor allem eine gesteigerte Sympathikusaktivität, Insulinresistenz und eine erhöhte Aktivität des Renin-Angiotensin-Systems (RAS) diskutiert.  23 Die Steigerung der Sympathikusaktivität bei Adipositas, die u. a. mit erhöhten Katecholamin-Plasmaspiegeln bei adipösen Hypertonikern einhergeht,  32 wird wahrscheinlich durch die Kombination von Hyperinsulinämie  33 , 34 und Hyperleptinämie  35 , 36 verursacht.  2

Eine der zentralen Störungen, die bei Adipositas auftritt, ist die Rechtsverschiebung der renalen Drucknatriurese-Kurve. So benötigen Adipöse vergleichsweise höhere Blutdruckwerte als normalgewichtige Individuen, um gleich große Natriummengen auszuscheiden. Diese Adipositas-assoziierte Natriumretention wird durch eine verstärkte tubuläre Natriumresorbtion hervorgerufen, die höchstwahrscheinlich durch die gesteigerte Sympathikus-Aktivität, aber auch durch einen gesteigerten intrarenalen Druck bewirkt wird.  37

Einen Zusammenhang von Adipositas und gesteigerter Aktivität des Renin-Angiotensin-Systems (RAS) konnte in einer Vielzahl von Studien belegt werden. So sind sowohl die Angiotensinogen-Plasmaspiegel,  38 - 42 als auch die Plasma-Renin-Aktivität  43 - 45 und die Plasma-Aktivität des Angiotensin-Converting-Enzyms (ACE)  38 positiv mit dem BMI assoziiert. Auch konnte die Expression verschiedener RAS-Gene in Adipocyten gezeigt werden.  46

1.2.3 Das Renin-Angiotensin-System

↓5

Das systemische Renin-Angiotensin-System (RAS) hat einen wichtigen Anteil sowohl an der Kurzzeit- als auch an der Langzeitregulation des arteriellen Blutdrucks. So aktivieren Faktoren, die den arteriellen Blutdruck senken, indem sie das effektive Blutvolumen verringern (z. B. Niedrig-Salz-Diät, Diuretika, Blutverlust) oder den peripheren Gesamtwiderstand reduzieren (z. B. Vasodilatatoren), die Renin-Freisetzung aus dem juxtaglomerulären Apparat der Niere.

Das proteolytische Enzym Renin spaltet aus dem von der Leber synthetisierten und ins Plasma freigesetzten Angiotensinogen (AGT) das Dekapeptid Angiotensin I (Ang I) ab. Dieses wird dann durch das Angiotensin-Converting-Enzym (ACE), das größtenteils an der luminalen Oberfläche des Endothels lokalisiert ist, in das stark vasokonstriktorisch wirksame Oktapeptid Angiotensin II (Ang II) umgewandelt (Abb. 2).

Abbildung 2: Schema des Renin-Angiotensin-System

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Zirkulierendes Angiotensin II kann über eine Reihe von Mechanismen die Homöostase des Kreislaufs beeinflussen und zu einer Erhöhung des Blutdrucks führen. So trägt es durch Verstärkung des peripheren Gesamtwiderstandes zur Kurzzeitregulation des arteriellen Blutdrucks bei. Indem Angiotensin II direkt, aber auch indirekt durch Stimulation der Aldosteron-Freisetzung die Ausscheidung von Wasser und Na+-Ionen in der Niere verringert, leistet es auch einen Beitrag zur Langzeitstabilisierung des arteriellen Blutdrucks.

Neben dem klassischen endokrinen System, bei dem alle Komponenten des Renin-Angiotensin-Systems und seiner Produkte in der Blutbahn zirkulieren und über den Blutstrom zu ihren Zielorganen transportiert werden, sind in den letzten Jahren lokale RAS in diversen Organen (z. B. Gehirn, Testis, Fettgewebe, Herz, Gefäße Niere, Nebenniere und Plazenta) beschrieben worden.  47 Die Bedeutung dieser Systeme, die die meisten Komponenten des Renin-Angiotensin-Systems lokal bilden, ist noch nicht vollständig geklärt. Untersuchungen an transgenen Tieren stützen jedoch die Hypothese, daß diese lokalen Systeme eine pathogenetische Rolle bei der Entwicklung bestimmter Hochdruckformen spielen, sowie an den Hochdruck-assoziierten Endorganschäden beteiligt sind.  48 , 49

Je nach Lokalisation der RAS-Komponenten und ihrer Herkuft wird zwischen extrinsischen und intrinsischen Systemen unterschieden. Es ist bekannt, daß ACE auf der Oberfläche vaskulärer Endothelzellen im gesamten Blutkeislauf präsent ist und das Renin in andere Gewebe aufgenommen werden kann.  50 - 52 Daher erfolgt die Konversion von AGT zu Angiotensin I und die Bildung von Angiotensin II aus zirkulierendem und lokal gebildetem Angiotensin I wahrscheinlich hauptsächlich innerhalb oder an der Oberfläche der Blutgefäßwände (extrinsisch).  50 , 53 , 54 Die physiologische Bedeutung intrinsischer lokaler Renin-Angiotensin-Systeme, in dem alle Komponenten von der lokalen Expression des REN-, AGT- und ACE-Gens stammen, ist dagegen noch umstritten. Zwar exprimieren eine Reihe verschiedener Gewebe wie Blutgefäße, Herz, Niere oder Fettgewebe die mRNAs der Schlüsselenzyme, und Zellkulturen dieser Gewebe produzieren Renin, AGT, ACE und / oder Angiotensin I und II; ihre Expression ist jedoch relativ niedrig. Auch hat es den Anschein, daß kein einzelner Zelltyp des jeweiligen Gewebes alle Komponenten exprimiert.  46 , 47 , 55 , 56

↓7

Nachfolgend werden die einzelnen Komponenten des Renin-Angiotensin-Systems näher charakterisiert.

1.2.3.1  Renin

Hauptbildungsort des zirkulierenden Renins sind die juxtaglomerulären Zellen in der Wand der afferenten Arteriole der Nierenglomeruli.  57 Renin ist ein 37 - 40 kD großes Glykoprotein aus der Familie der Aspartyl-Proteasen mit einer begrenzten Anzahl an Substraten. Sein natürliches Substrat ist das zirkulierende α2–Globulin Angiotensinogen, welches am aminoterminalen Ende gespalten wird.

Bei der Renin-Bildung wird zunächst ein aus 406 Aminosäuren (AS) bestehendes Präproenzym synthetisiert, aus dem durch Abspaltung von 23 AS Prorenin, die inaktive Vorstufe des Renins gebildet wird. Das 340 AS lange aktive Renin entsteht durch Abspaltung von weiteren 43 AS durch ein bisher noch unbekanntes Enzym. Es wird jedoch überwiegend Prorenin sezerniert,  56 das wahrscheinlich nicht nur eine inaktive Vorstufe darstellt, sondern möglicherweise selbst eine vasodilatatorische Funktion hat.  57 Die Prorenin-Konzentration in der Zirkulation ist ca. zehnmal höher als die des aktiven Renins, dessen Halbwertszeit etwa 15 Minuten beträgt.

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Für das humane Renin-Gen ist ein einziger Locus auf Chromosom 1q32 bekannt, der 10 Exons und 9 Introns enthält und sich über 12,5 kb erstreckt. Die Promotor-Region enthält cis-wirkende Elemente für Progesteron, cAMP und Glucocorticoide. Die Renin-Expression wird in Niere, Herz und Nebenniere durch Natrium-Depletion und β-adrenerge Rezeptoren stimuliert, während Angiotensin II durch einen negativen Rückkoppelungsmechanismus die Expression in der Niere und anderen Geweben reduziert.55 , 58

1.2.3.2 Angiotensinogen

Angiotensinogen, das Substrat des Renins, ist ein im Plasma zirkulierendes α2-Globulin, das zur Superfamilie der Serpine (Akronym für Serin-Protease-Inhibitoren) gehört. Das humane AGT hat ein Molekulargewicht von 55-65 kD  59 und besteht aus 452 AS. Es wird als Präangiotensinogen mit einem aus 24 oder 33 Aminosäuren bestehenden Signalpeptid synthetisiert. Der Hauptbildungsort des zirkulierenden AGTs ist die Leber.  60 AGT-Transkripte konnten jedoch auch in anderen Geweben, wie Fettgewebe, Niere, Gehirn, Rückenmark, Aorta, Mesenterium, Vorhof, Lunge, Nebenniere, Dickdarm, Magen, Milz, Ovarien und Plazenta nachgewiesen werden.  47 , 61 , 63 Bei der Spaltung des Angiotensinogens durch Renin entstehen das Dekapeptid Angiotensin I und ein 442 AS großer Rest, dessen funktionelle Bedeutung bisher ungeklärt ist. Es wird jedoch über eine Beteiligung an Entzündungsreaktionen spekuliert.  60

Die AGT-Plasmakonzentration liegt nahe der Michaelis-Menten-Konstante der AGT-Spaltung durch Renin, daher führt bereits ein geringer Anstieg des AGT-Plasmaspiegels zu einer vermehrten Ang I-Bildung.  55 Die Angiotensinogensynthese in der Leber wird durch eine Reihe von Hormonen einschließlich Östrogen, Glucocorticoiden und Thyroidhormonen sowie durch Angiotensin II (positiver Rückkoppelungsmechanismus) stimuliert. 58 , 64 , 65

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Für das humane AGT-Gen ist ein einzelner Locus auf Chromosom 1q 42-43 bekannt, der sich über 12 kb erstreckt und aus 5 Exons und 4 Introns besteht.  59 Für die Promotorregion des AGT-Gens sind cis-wirkende Elemente beschrieben worden, die in der Leber eine Steigerung der AGT-Expression durch Corticosteroide, Östrogene und Schilddrüsenhormone vermitteln.  66

1.2.3.3 Angiotensin-Converting-Enzym

Das Angiotensin-Converting-Enzym (ACE)ist eine Dipeptidyl-Carboxypeptidase aus der Familie der Zink-Metalloproteasen. Es spaltet das inaktive Dekapeptid Angiotensin I zu Angiotensin II, einem Oktapeptid und potenten Vasopressor. Da ACE relativ unspezifisch wirkt, spaltet es Dipeptide von Substraten mit unterschiedlichen Sequenzen ab. So inaktiviert es Bradykinin und andere vasodilatatorische Peptide, wobei es sogar eine größere Affinität zu Bradykinin besitzt als zu Angiotensin I.  55

ACE besteht aus einer Peptidkette mit 1278 Aminosäuren und ist ubiquitär im Körper verbreitet. Die genaue zelluläre Lokalisation ist nicht überall bekannt, jedoch findet man neben zirkulierendem ACE  67 , 68 am häufigsten membranständiges ACE, das durch seinen C-terminalen Anteil an der luminalen Seite der Zellmembran von Endothel- und Epithelzellen sowie von Leukocyten verankert ist.  55

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Es sind zwei Isoformen des ACE bekannt, die sich sowohl in der Größe der mRNA  67 , 69 als auch in der Länge des Proteins unterscheiden. Das Molekulargewicht des testikulären ACE liegt zwischen 90-100 kD, das des ubiquitär verbreiteten endothelialen ACE dagegen zwischen 140-160 kD.  55

Beim Menschen ist bislang nur ein ACE-Locus auf Chromosom 17q 23 beschrieben worden. Dieser kodiert für beide Isoenzymformen. Das ACE-Gen des Menschen enthält 26 Exons und 25 Introns und erstreckt sich über 21 kb. Das Transkript des endothelialen ACE wird von Exon 1 bis Exon 26 unter Auslassung von Exon 13 abgelesen und ist 4,5-5 kb groß. Das 2,6 kb große testikuläre Transkript des ACE wird dagegen ausgehend von einem internen Promotor in Intron 12 von Exon 13 bis Exon 26 abgelesen.  55 , 67 , 69 Am 5´-Ende liegen mehrere Konsensus-Sequenzen für den Transkriptionsfaktor Sp1 und cis-wirkende Elemente, die die Expressionsverstärkung durch Glucocorticoide und cAMP vermitteln.  55

1.2.3.4 Angiotensinrezeptoren

Die Effekte von Angiotensin II werden über spezifische Rezeptoren an der Zelloberfläche vermittelt. Bisher sind zwei Subtypen des Angiotensin II-Rezeptors (AT1, AT2) beschrieben worden sowie ein Angiotensin IV-Rezeptor (AT4), an den Angiotensin IV, das 3-8 Fragment des Angiotensin II,  70 bindet und dessen funktionelle Bedeutung bisher noch unklar ist (s. Abb. 2). Die beiden Angiotensin II-Rezeptortypen (AT1, AT2) weisen untereinander nur geringe Homologien (32 % Aminosäurenidentität) auf. Die Affinität von Angiotensin II ist zu beiden gleich groß. Als spezifische Antagonisten werden u. a. Losartan für AT1 und PD 123177 oder PD 123319 für AT2 eingesetzt.  55

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Der Angiotensin II-Rezeptor Typ 1 (AT1) gehört zur Superfamilie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, besitzt sieben Transmembrandomänen, besteht aus 359 Aminosäuren und hat ein Molekulargewicht von 41 kD. Der singuläre Locus des humanen AGTR1-Gens des Menschen liegt auf Chromosom 3q 21-25 und ist etwa 60 kb lang.  71 Es besteht aus 5 Exons, von denen nur das fünfte die kodierende Sequenz enthält.  72 Das humane AGTR1-Transkript enthält sechs AUUUA-Motive, die kennzeichnend für labile mRNAs sind und eine posttranskriptionelle Regulation vermuten lassen.  55

Die Bindung von Angiotensin II an den AT1-Rezeptor führt hauptsächlich zur Aktivierung der Phospholipasen C und D, sowie zur Inhibierung der Adenylatcyclase.  55 Der cytoplasmatische C-Terminus des AT1-Rezeptors enthält mehrere Phosphorylierungsstellen für die Proteinkinase C sowie mehrere Tyrosinreste, die ebenfalls zur Regulation der Rezeptoraktivität durch Phosphorylierung geeignet sind.

Der Angiotensin II-Rezeptor Typ 2 (AT2) ist 363 Aminosäuren lang, besitzt wie der Angiotensin II-Rezeptor Typ 1 sieben Transmembrandomänen, ist jedoch nicht fest an G-Proteine gekoppelt. Die Funktion des AT2-Rezeptors ist weitgehend unklar, aber das weit verbreitete Vorkommen in fötalen und neonatalen Geweben läßt Funktionen im Bereich von Entwicklungs- und Differenzierungsprozessen vermuten.  73 , 74 So hemmt im Tiermodell z. B. die Aktivierung des AT2-Rezeptors die vom AT1-Rezeptor vermittelte proliferative Wirkung von Angiotensin II. Der antiproliferative Effekt des AT2-Rezeptors erfolgt dabei nicht durch die Hemmung von Transkriptionsfaktoren, sondern über eine durch den AT2-Rezeptoraktivierte Phosphotyrosinphosphatase, welche die wachstumsstimulierenden Phosphorylierungen am Angiotensin II-Rezeptor Typ 1 wieder aufheben kann.  75

↓12

Beim Menschen liegt der singuläre Genlocus des AT2-Rezeptors (AGTR2) auf Chromosom Xq 22-23. Wie beim Gen des AT1-Rezeptors (AGTR1) enthält auch hier nur eines der drei Exons die kodierende Sequenz des AGTR2-Gens.

1.2.4 Das lokale adipocytäre Renin-Angiotensin-System

1987 berichteten Campbell und Habener  61 erstmals, daß adventitielle und periaortale braune und weiße Fettzellen mehr AGT-mRNA enthalten als die Muskelzellen der Rattenaorta. Inzwischen wurde die AGT-Expression in mehreren braunen und weißen Fettgewebedepots der Ratte  76 sowie in verschiedenen Fettgewebedepots des Menschen  17 , 77 nachgewiesen.

In einer Reihe von Untersuchungen konnte inzwischen die Genexpression fast aller Komponenten des Renin-Angiotensin-Systems im Fettgewebe und in isolierten Adipocyten von Menschen und Nagetieren nachgewiesen werden.  17 , 46 , 68 , 78 , 79 Auch die AGT-Sekretion und Ang II-Bildung in vitro  17 , 80 sowie das Vorhandensein von AT1-Rezeptoren in der Adipocytenmembran  81 sind gezeigt worden. Kürzlich konnte außerdem an transgenen Mäusen demonstriert werden, daß adipocytär gebildetes AGT in den Blutkreislauf gelangt und dort an der Blutdruckregulation beteiligt ist.  82

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Über die funktionelle Bedeutung des adipocytären Renin-Angiotensin-Systems ist noch wenig bekannt, und die Ergebnisse sind z. T. widersprüchlich. In Tiermodellen der Adipositas (db / db und ob / ob Mäuse)  83 geht chronische Überernährung mit einer Überexpression von AGT im Fettgewebe einher, ohne daß dadurch die AGT-Expression der Leber beeinflußt wird. Bei Ratten führt eine gesteigerte Nahrungsaufnahme nach einer kurzzeitigen Phase des Fastens außerdem zu einer deutlichen Blutdruckerhöhung.  83 Die Beteiligung eines aktiven, lokalen RAS im Fettgewebe an der Pathophysiologie der Adipositas-assoziierten Hypertonie scheint daher naheliegend.

Inzwischen gibt es auch Hinweise darauf, daß im Fettgewebe gebildetes Angiotensin II nicht nur direkt zu einer gesteigerten Vasokonstriktion führen könnte, sondern auch indirekt durch die Beeinflussung des Noradrenalinumsatzes  84 zu einer Veränderung des Blutflusses und der Stoffwechselaktivität beitragen könnte, da beide Funktionen eng an die adrenerge Regulation gekoppelt sind.  85 , 86 So konnte zum einen gezeigt werden, daß Angiotensin II die β-adrenerg vermittelte Blutflußsteigerung verringert  87 und zum anderen das perivaskuläre Fettgewebe über die Freisetzung und Aufnahme von Noradrenalin die Kontraktionsfähigkeit von Gefäßen beeinflußt.  88 Andererseits steigert Angiotensin II jedoch die adipocytäre Bildung vasodilatatorischer Substanzen wie NO, Prostacyclin und Leptin in vitro und in vivo 2 , 19 - 21 , 89

In Ob 1771-Zellen, einer klonalen Zellinie der Maus, steigert adipocytär gebildetes Angiotensin II außerdem die adipogene Differenzierung von Präadipocyten, indem es die Prostacyclin-Bildung in reifen Adipocyten stimuliert.  90 Dagegen scheint Angiotensin II beim Menschen die adipogene Differenzierung zu hemmen.  91

1.2.5 Hormonelle Regulation der Genexpression des Renin-Angiotensin-Systems

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Aus den Promotorregionen einiger RAS-Gene sind cis-wirkende Elemente für Glucocorticoide (REN, AGT, ACE), Östrogen (AGT) und Thyroidhormone (AGT) bekannt (s.1.2.3.1 - 3), was darauf schließen läßt, daß die Regulation auf transkriptioneller Ebene erfolgt. Am besten untersucht ist bisher die Regulation des hepatischen Angiotensinogens. Es konnte gezeigt werden, daß bei Ratten neben Glucocorticoiden  90 - 93 auch Östrogene,  92 , 95 - 97 Triiodo-L-Thyronin (T3),  92 , 98 Testosteron  99 und Angiotensin II,  58 , 92 , 93 letzteres über eine positive Rückkopplungsschleife, die AGT-mRNA-Konzentration und die AGT-Sekretion in vivo und in vitro steigern. Dagegen wird die Genexpression des Renins in der Niere durch Angiotensin II-Infusion reduziert.

Zur hormonellen Regulation der Expression der Renin-Angiotensin-System-Gene im Fettgewebe liegen bisher nur wenige Daten aus Untersuchungen an verschiedenen Rattenstämmen und klonalen Mäusezellinien vor. So wird bei Sprague-Dawley Ratten die AGT-Expression durch Glucocorticoide,  61 , 100 Triiodo-L-Thyronin (T3),  61 17-β-Estradiol  61 und Testosteron  61 , 101 stimuliert. Auch Lipopolysaccharide  102 und Insulin  101 haben bei bestimmten Rattenstämmen eine positive Wirkung. Dagegen konnte bei klonalen Ob 1771-Zellen der Maus eine Stimulation der AGT-Expression durch Glucocorticoide, Fettsäuren und TNFα  100 , 104 beobachtet werden. Triiodo-L-Thyronin (T3), 17-β-Estradiol und Angiotensin II zeigten aber keinen Einfluß auf die AGT-Expression. Widersprüchlich sind auch die Ergebnisse zur Wirkung von Insulin, das die AGT-Expression in 3T3 F442A- und Ob 1771-Zellen hemmt, in 3T3-L1-Zellen jedoch steigert.  77 , 105 Daten zur Regulation der Expression der anderen RAS-Gene im Fettgewebe liegen nicht vor.

1.3 Problematik der Adipocytenforschung

Trotz des gestiegenen Interesses an der Fettzellbiologie ist die Zahl der in vitro Untersuchungen bislang verhältnismäßig gering. Dies liegt z. T. vermutlich auch an den besonderen physikalischen und biologischen Eigenschaften der Adipocyten, die stark von denen anderer Zellarten abweichen und die Übertragung herkömmlicher Methoden der Zell- und Molekularbiologie erschweren. Nachfolgend sind zunächst die Vor- und Nachteile der verschiedenen in vitro Untersuchungsmethoden des Fettgewebes und die sich dabei aus den Eigenschaften der Zellen ergebenden Probleme zusammengefaßt. Anschließend wird kurz auf die Unterschiede von Tiermodellen bzw. tierischen Zellinien gegenüber humanem Fettgewebe eingegangen.

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Neben der Kultivierung ganzer Fettgewebestücke werden in vitro Untersuchungen entweder an isolierten Adipocyten oder meistens an in vitro differenzierten Präadipocyten (Primärkulturen oder Zellinien) durchgeführt. Die Verwendung ganzer Fettgewebestücke kommt den körpereigenen Bedingungen zwar am nächsten, da alle Komponenten, die zur Bildung des Fettgewebes beitragen (Adipocyten, Stromavaskularzellen, Bindegewebe) in diesem Ansatz enthalten sind.; Die Funktionen der einzelnen Zellarten zu untersuchen, ist hier jedoch kaum möglich. Technisch bestehen bei diesem Untersuchungsansatz aufgrund des hohen Fettgehaltes des Gewebes die gleichen Probleme wie bei isolierten Adipocyten (s. u.). Hinzu kommt hier jedoch noch die Schwierigkeit, während der Kultivierung bzw. des Experimentes eine ausreichende Perfusion der Gewebestücke zu erhalten, um damit eine gleichmäßige Versorgung der Gewebebestandteile sicherzustellen.

Eine gute Alternative zu diesem Untersuchungsansatz ist die Verwendung isolierter Adipocyten, da sie den größten Teil des Fettgewebes ausmachen  106 und ihre Zahl und Größe während der Entstehung von Adipositas stark zunimmt. Im Verhältnis zur Größe anderer Zellarten, wie z. B. Hepatocyten, Fibroblasten oder Präadipocyten (20 - 30 µm  107 ) sind Adipocyten jedoch mit einem Durchmesser von 40 – 150 µm  108 - 110 ausgesprochen groß und mechanisch sehr empfindlich. Sie besitzen meistens eine einzige, große lipidgefüllte Vakuole, die ca. 95 % des Zellvolumens einnimmt und zusammen mit dem randständigen, diskusförmigen Zellkern von einem nur sehr dünnen Cytoplasmasaum umgeben ist. Auch können sie sich im Gegensatz zu ihren Vorläuferzellen, den Präadipocyten, nicht mehr teilen, wodurch die Anzahl der Experimente, die mit einer Primärkultur durchgeführt werden können, sehr begrenzt ist. Jedoch sind es insbesondere die Größe und der hohe Fettgehalt der Adipocyten, die bei der Untersuchung isolierter Zellen eine Reihe von Problemen hervorrufen. So sind Adipocyten für bestimmte Geräte (z. B. Neubauer-Zählkammern, Kapillaren, Zuleitungsschläuche etc.) zu groß. Die eingelagerten Lipide verleihen den Fettzellen darüber hinaus einen starken Auftrieb. Dies führt dazu, daß Adipocyten sich stets an der Oberfläche des Kulturmediums sammeln. Das erschwert die Handhabung der Kulturen, wie auch das Suspendieren der Zellen und behindert Versuche, bei denen die Zellen vollständig vom Medium umspült sein müssen (z. B. Rezeptorbindungsstudien). Auch macht der dünne Cytoplasmasaum der Adipocyten die mikroskopische Beobachtung angefärbter Zellbestandteile (z. B. cytoplasmatische Rezeptoren) schwierig. Bei molekularbiologischen Untersuchungen beeinträchtigen Fettgehalt und Größe besonders die Menge und die Qualität des verwendeten Materials. Da Zellkern und Cytoplasma bei Adipocyten zusammen nur ca. 5 % des Zellvolumens ausmachen, ist der Gehalt an Nukleinsäuren bzw. Proteinen im Verhältnis zum Volumen wesentlich geringer als bei anderen Zellarten. Hinzu kommt, daß Lipide bei den meisten Isolierungsmethoden für Proteine, RNA oder DNA die Qualität und Ausbeute zusätzlich verringern.

Aufgrund dieser Probleme ist es für in vitro Untersuchungen isolierter Adipocyten erforderlich, einen Großteil der für andere Zelltypen etablierten Methoden speziell anzupassen oder sogar neue Verfahren zu entwickeln. Da dies u. U. sehr aufwendig ist, wurden bisher die meisten Untersuchungen an Primärkulturen von Präadipocyten durchgeführt, die mit Hilfe verschiedener Hormone zur Differenzierung angeregt werden. Solche Kulturen sind einfacher zu handhaben, weisen aber verschiedene Nachteile auf. So enthalten sie neben den teildifferenzierten Adipocyten auch immer undifferenzierte Präadipocyten, während ausdifferenzierte Adipocyten kaum vorhanden sind, da diese sich aufgrund des hohen Fettgehaltes vom Boden des Kulturgefäßes lösen und beim Medienwechsel größtenteils verloren gehen. Auch haben die teildifferenzierten Adipocyten noch relativ wenige Lipide akkumuliert, die in diesem Entwicklungsstadium noch multilokulär organisiert sind, wodurch sie sich deutlich von ausdifferenzierten Adipocyten mit ihren unilokulären Lipidvakuolen unterscheiden. Insofern entsprechen die Verhältnisse in differenzierenden Präadipocyten nicht zwangsläufig denen in ausdifferenzierten Zellen, welche doch den größten Teil des Fettgewebes ausmachen.  106 Auch zur Untersuchung der hormonellen Regulation ist dieses System durch die bereits erwähnte Notwendigkeit der hormonellen Stimulation der Differenzierung wenig geeignet. Eine weitere Einschränkung liegt darin, daß Primärkulturen isolierter Präadipocyten zunehmend ihre Differenzierungsfähigkeit verlieren und das mit Beginn der Differenzierung wiederum die Teilungsfähigkeit verloren geht. So ist es auch bei der Verwendung von Präadipocytenkulturen notwendig, immer wieder neue Primärkulturen anzulegen, wofür relativ große Mengen Fettgewebe benötigt werden, da der Präadipocytenanteil des Fettgewebes verhältnismäßig gering ist.  106

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Da menschliches Fettgewebe jedoch meist schlecht verfügbar ist, wurden bisher ein Großteil der Untersuchungen an Ratten, Mäusen oder an verschiedenen klonalen Zelllinien der Maus (z. B. 3T3, Ob 1771) durchgeführt.Einer der wichtigsten Unterschiede zwischen Menschen und Nagetieren ist jedoch das Fehlen brauner Fettgewebedepots beim erwachsenen Menschen. Adipocyten aus braunem Fettgewebe sind wesentlich kleiner (ca. 60 µm  107 , 109 ), enthalten viele kleine multilokulär organisierte Lipidvakuolen und eine große Anzahl von Mitochondrien. Braunes Fettgewebe ist speziell der Wärmeerzeugung angepaßt und bei vielen Nagetieren sowie den meisten Winterschläfern vorhanden. Beim Menschen ist es nur bei Neugeborenen zu finden. 106 Es wird jedoch diskutiert, daß das weiße Fettgewebe des Menschen vereinzelt braune Adipocyten enthält.  109 , 111 Davon abgesehen haben Untersuchungen an weißem Fettgewebe gezeigt, daß Befunde bei Ratten, Mäusen oder klonalen Zellinien z. T. deutlich voneinander abweichen oder sogar gegensätzlich sind.  77 , 105 Insofern ist die Übertragbarkeit der Ergebnisse von Nagetieren auf den Menschen nur bedingt möglich.

1.4 Vorarbeiten

Aufgrund der Einschränkungen, die Tiermodelle und halbdifferenzierte Adipocytenkulturen aufweisen, entschieden wir uns, ein System zu etablieren, daß es erlaubte, Experimente zur Genregulation an ausdifferenzierten humanen Adipocyten durchzuführen. Anfangs standen dazu nur geringe Mengen (10 - 50 g) Fettgewebe aus unterschiedlichen operativen Eingriffen zur Verfügung. Damit war es möglich, basierend auf den Methoden von Rodbell  112 und Marshall,  113 ein Verfahren zu entwickeln, mit dem sowohl Adipocyten als auch Präadipocyten aus verschiedenen humanen Fettgewebedepots (subkutan, intraperitoneal) isoliert werden konnten. Für Kultivierungs- und Stimulationsexperimente war die Gewebemenge jedoch zu gering. Ausreichend große Fettgewebemengen (bis 400 g) erhielten wir schließlich aus verschiedenen Kliniken, in denen sich gesunde, vorwiegend weibliche Patienten aus kosmetischen Gründen einer Bauchplastik oder einer Mammareduktion unterzogen. Dabei zeigte es sich, daß das Material während des Transportes nur leicht gekühlt werden darf und zwischen Entnahme und Beginn des Gewebeaufschlusses nicht mehr als zwei Stunden vergehen sollten, wodurch die Zahl der in Frage kommenden Kliniken stark limitiert wurde.

Für den Gewebeaufschluß wurden Kollagenasen verschiedener Hersteller und unterschiedliche Puffersysteme getestet, um ein System zu etablieren, mit dem in relativ kurzer Zeit sowohl große Mengen Fettgewebe als auch Biopsiematerial vollständig aufgeschlossen und eine hohe Ausbeute an intakten Zellen erzielt werden kann. Zur Kultivierung der Adipocyten wurden ebenfalls verschiedene in der Literatur beschriebene Medienkombinationen getestet. Um zukünftig auch Co-Kultivierungsexperimente mit Präadipocyten durchführen zu können, wurde eine dem Präadipocytenmedium sehr ähnliche Medienkombination gewählt. Durch den Verlust der Teilungsfähigkeit ist es jedoch bei ausdifferenzierten Adipocyten nicht möglich, die Wachstumsrate zur Qualitätskontrolle der Primärkulturen einzusetzen. Statt dessen können die Kulturbedingungen über die Veränderung der Zellzahl und die Vitalitätsrate kontrolliert werden. In den entsprechenden Experimenten zeigte sich jedoch, daß herkömmliche Methoden, wie die Zellzahlbestimmung in einer Neubauer-Zählkammer oder die Vitalitätsbestimmung mittels Trypanblau nicht auf Adipocyten anwendbar sind.

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Die RNA-Isolierung aus Adipocyten war ebenfalls problematisch, da konventionelle Protokolle zur RNA-Isolierung aus Zellen und Geweben nur schlecht oder gar nicht funktionierten. Mit einigen Modifikationen in der Versuchsdurchführung gelang es zwar, mit der Phenol-Chloroform-Methode RNA aus Adipocyten zu isolieren, die Qualität der isolierten RNA war jedoch nicht besonders gut und die Ausbeute vor allem bei Biopsiematerial zu gering, um damit Northern-Blot-Analysen durchführen zu können. Mittels konventioneller RT-PCR in Verbindung mit Ethidiumbromid gefärbten Gelen gelang es aber, die Genexpression von Angiotensinogen (AGT), Angiotensin-Converting-Enzym (ACE) und Angiotensin II-Rezeptor Typ 1 (AGTR1) in ausdifferenzierten humanen Adipocyten nachzuweisen.  46 Die Expression des Renin (REN)- und Angiotensin II-Rezeptor Typ 2 Gens(AGTR2) konnte jedoch mit dieser Methode weder an isolierten Adipocyten noch an Fettgewebe nachgewiesen werden.  46

1.5 Problemstellung und Zielsetzung

Bei dem Versuch, ein System zu etablieren, das es erlaubt, an humanen Adipocyten Experimente zur Genregulation durchzuführen, hatte sich gezeigt, daß insbesondere die Größe und der hohe Lipidgehalt der Adipocyten zu vielfältigen Problemen führen. So hatten sich z. B. herkömmliche Methoden zur Zellzahl- und Vitalitätsbestimmung als ungeeignet erwiesen. Die Neubauer-Zählkammer war für Adipocyten zu niedrig. Aber auch mit der größeren Fuchs-Rosenthal-Zählkammer war eine verläßliche Zellzahlbestimmung sehr schwierig, da es kaum möglich war, die Adipocyten gleichmäßig suspendiert in die Kammer zu pipettieren. Durch den starken Auftrieb der Zellen (s. 1.2.5) entmischte sich die Zellsuspension bereits vor dem Auftragen in die Zählkammer in der Pipette. Vitalitätsbestimmungen mittels Trypanblau waren ebenfalls nicht erfolgreich, da der Cytoplasmasaum der Adipocyten zu dünn ist. Unter dem Mikroskop ist die Blaufärbung des Cytoplasmas toter Zellen nicht deutlich zu erkennen.

Auch die gängigen Verfahren zur RNA-Isolierung ergaben bei Adipocyten keine befriedigenden Ergebnisse, da der RNA-Gehalt einer Fettzelle aufgrund ihres geringen Cytoplasmagehaltes (ca. 5 %) im Verhältnis zu ihrem Volumen sehr gering ist und konventionelle Protokolle zur RNA-Isolierung weder für Material mit hohem Lipidgehalt noch für derart große Zellen (bis 150 µm im Durchmesser) ausgelegt sind. Für die geplanten Expressionsanalysen reichte die Menge an isolierter RNA kaum aus und war bei kleineren Gewebemengen (Biopsien) gänzlich unzureichend. Neben einem verbesserten Verfahren zur RNA-Isolierung wurde daher auch für die Expressionsanalysen eine sensitive Methode benötigt. Unter Berücksichtigung der zu erwartenden RNA-Mengen schieden neben Northern-Blot-Analysen sowohl die „limited-dilution-PCR" als auch die „competitive PCR“ aus.

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Als problematisch erwies sich bei den Expressionsanalysen hormonell stimulierter Adipocyten und Präadipocyten auch die Auswahl einer geeigneten endogenen Kontrolle („house-keeping“ Gen), da es Hinweise auf die Regulation häufig verwendeter „house-keeping“ Gene wie z. B. GAPDH, β-Actin oder 18S rRNA gibt.  114 - 116

Die Ziele dieser Arbeit waren daher :

  1. Entwicklung einer für Adipocyten geeigneten Methode der Zellzahlbestimmung.
  2. Etablierung eines Verfahrens zur Bestimmung der Vitalitätsrate von Primärkulturen humaner Adipocyten.
  3. Vergleich verschiedener Methoden zur Isolierung von Gesamt-RNA aus Primärkulturen ausdifferenzierter Adipocyten.
  4. Auswahl und Optimierung der für Adipocyten geeignetsten Methode der RNA-Isolierung.
  5. Etablierung der TaqMan®-Real-Time-PCR Technik, einer sehr sensitiven RT-PCR Methode zur Quantifizierung der Genexpression.
  6. Auswahl einer endogenen Kontrolle, die es ermöglicht, die Genexpression sowohl bei Adipocyten unter hormoneller Stimulation als auch bei Präadipocyten während der Differenzierung zu quantifizieren.
  7. Demonstration der Funktionsweise der TaqMan®-Real-Time-PCR Technik zur relativen Quantifizierung der Genexpression am Beispiel von AGT, ACE, AGTR1 und eventuell auch REN und AGTR2 in hormonell stimulierten Adipocyten. Untersucht wird dabei der Einfluß von Hydrocortison, Insulin, 17-β-Estradiol, 3,3´-5-Triiodo-L-Thyronin (T3) bzw. Angiotensin II auf die Expression oben genannter Gene über einen Zeitraum von 24 h.


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31.10.2006