| ↓19 |
|
Analysenwaage BP 615 |
Fa. Sartorius |
|
Biofuge 13 |
Fa. Heraeus |
|
Brutschrank, Kupfer; Function Line |
Fa. Heraeus |
|
DNA Thermal Cycler |
Fa. Perkin Elmer |
|
Elektrorührer Compact HPI |
Fa. Variomag |
|
Fluoreszenz Kondensor CK 40 – RFA |
Fa. Olympus |
|
Fluoreszenzmodul Blau CX – DMB |
Fa. Olympus |
|
Fluoreszenzmodul Grün CX – DMG |
Fa. Olympus |
|
GeneAmp PCR System 9600 |
Fa. Perkin Elmer |
|
Inversmikroskop CK 40 mit Fluoreszenzmodulen |
Fa. Olympus |
|
Inversmikroskop Diaphot 300 |
Fa. Nikon |
|
Konfokalmikroskopapparatur |
Fa. Biorad |
|
Magnetrührer |
Fa. IKA |
|
MUPID-2 Mini-Gel Elektrophoresis Unit |
Fa. Cosmo Bio Co., LTD. |
|
Roto-Vette |
Fa. Helma |
|
Schüttelwasserbad SW 20 |
Fa. Julabo |
|
Sequence Detection System 5700 |
Fa. PE Biosystems |
|
Sterile Werkbank HERA Safe |
Fa. Heraeus |
|
Thermomixer 5436 |
Fa. Eppendorf |
|
Tischzentrifuge 5415 C |
Fa. Eppendorf |
|
Ultraschallbad Ultrasonics |
Fa. Astrason |
|
Ultrazentrifuge L-70 |
Fa. Beckman |
|
UV Imager TI 2 |
Fa. Biometra |
|
UV Spectrometer UV 1202 |
Fa. Shimatzu |
|
UV Spectrometer Ultra-Spec 2000 |
Fa. Pharmacia Biotec |
|
UV Transluminator |
Fa. UVP, Inc. |
|
Vortex-Genie-2 |
Fa. Scientific Industries |
|
Wasserbad |
Fa. Kötterman |
|
Zentrifuge 5810 R |
Fa. Eppendorf |
|
Zentrifuge RC2-B |
Fa. Sorvall |
|
Steritop-GP Filter (0,22 µm Porengröße, GP Express Membran) (# SCGPT 05 RE) |
Fa. Millipore |
|
MicroAmp Optical Caps (# N 80 10 935) |
Fa. PE Biosystems |
|
MicroAmp Optical 96 Well Reaction Plates |
Fa. PE Biosystems |
|
Siebgewebe, Polypropylen, 250 µm Maschenweite |
Fa. W. Kaldenbach |
|
Sterikan Sonderkanülen 20-G, gelb (0,9 x 70 mm) |
Fa. Braun |
|
Zellkulturflaschen, 225 cm2 (900 ml) (# 3160-225) |
Fa. Dunn Labortechnik |
|
Zellkulturflaschen EasyFlask mit Filterkappen 25 cm2 (50 ml) (# 156367) bzw. 75 cm2 (260 ml) (# 156499) |
Fa. Nunc |
|
Zellkulturflaschen SoLo Flask 185 cm2 (600 ml)mit Filterkappen (# 144903) |
Fa. Nunc |
|
UZ-Röhrchen Ultra-Clear (# 344057) |
Fa. Beckman |
| ↓20 |
Die nachfolgenden Primer wurden von der Fa. Life Technologies bezogen.
Alle verwendeten Sonden stammen von der Fa. BioTez, MDC Berlin-Buch und sind am 5´-Ende mit FAM (6-Carboxy-Fluoricein, Emission bei 518 nm) und am 3´-Ende mit TAMRA (6-Carboxy-tetramethyl-rhodamin, Emission bei 582 nm) markiert.
Pyruvat-Dehydrogenase ( PDH )-Gen
| ↓21 |
|
Vorwärtsprimer : |
5’ GGT ATG GAT GAG GAG CTG GA 3’ |
20-mer |
|
Rückwärtsprimer : |
5’ CTT CCA CAG CCC TCG ACT AA 3’ |
20-mer |
Renin ( REN )-Gen
|
Vorwärtsprimer : |
5´ TTg gAg Agg TCA Cgg AgA TgC 3´ |
21-mer |
|
Rückwärtsprimer : |
5´ TgC CCA CAA CCC CAT CAA AC 3´ |
20-mer |
|
Sonde : |
5´CGC CTT ACC CTT CAT GCT GGC CG 3´ |
23-mer |
| ↓22 |
Angiotensinogen ( AGT )-Gen
|
Vorwärtsprimer : |
5´ CTT CAC TgA gAg CgC CTg C 3´ |
19-mer |
|
Rückwärtsprimer : |
5´ gAg ACC CTC CAC CTT gTC CA 3´ |
20-mer |
|
Sonde : |
5´ CTg ATC CAg CCT CaC TAT gCC TCT gAC C 3´ |
28-mer |
Angiotensin-Converting-Enzym ( ACE )-Gen
| ↓23 |
|
Vorwärtsprimer : |
5´ CAC CCA ggC CAg gAA gTT T 3´ |
19-mer |
|
Rückwärtsprimer : |
5´ TgC CCg TTC TAg gTC CTg AA 3´ |
20-mer |
|
Sonde : |
5´ CCA gTT gCA gAA CAC CAC TAT CAA gCg g 3´ |
28-mer |
Angiotensin II-Rezeptor Typ 1 ( AGTR1 )-Gen
|
Vorwärtsprimer : |
5´ ACC CAA TgA AgT CCC gCC T 3´ |
19-mer |
|
Rückwärtsprimer : |
5´ AgC AgC CAA ATg ATg ATg CAg 3´ |
21-mer |
|
Sonde : |
5´ CgA CgC ACA ATg CTT gTA GCC AAA gTC A 3´ |
28-mer |
| ↓24 |
Angiotensin II-Rezeptor Typ 2 ( AGTR2 )-Gen
|
Vorwärtsprimer : |
5´ CCA AgT CCT gAA gAT ggC AgC 3´ |
21-mer |
|
Rückwärtsprimer : |
5´ gga agg tca gaa cat gga agg g 3´ |
22-mer |
|
Sonde : |
5´ TTG TTC TGG CCT TCA TCA TTT GCT GGC T 3´ |
28-mer |
Leptin (LEP)-Gen
| ↓25 |
|
Vorwärtsprimer : |
5´ ACC AGG ATC AAT GAC ATT TCA CAC 3´ |
24-mer |
|
Rückwärtsprimer : |
5´ CCA GGA ATG AAG TCC AAA CCG 3´ |
21-mer |
|
Sonde : |
5´ CGC AGT CAG TCT CCT CCA AAC AGA AAG TCA T 3´ |
31-mer |
Für das GAPDH -Gen wurde der „Human GAPDH“ Kit (huGAPDH, VIC-markiert, # 4310884 E) der Firma PE Biosystems verwendet. Die Sequenzen werden vom Hersteller nicht bekannt gegeben.
|
Human GAPDH Kit (huGAPDH,vic-markiert) |
Fa. PE Biosystems |
|
Human Endogenous Control Plates (# 4309921) |
Fa. PE Biosystems |
|
PUREscript (# 210002) |
Fa. Biozym |
|
Rnase Free DNase Set (# 79254) |
Fa. Qiagen |
|
Rneasy Mini Kit (# 74 106) |
Fa. Qiagen |
|
RLT-Puffer für den Rneasy Mini Kit (# 79 216) |
Fa. Qiagen |
|
TaqMan Universal PCR Mastermix (4305719) |
Fa. PE Biosystems |
|
TRIzol Reagenz (# 15596-018) |
Fa. Life Technologies |
| ↓26 |
|
Kollagenase Typ I CLS (# C1-22) |
Fa. Biochrom |
|
Desoxyribonuclease I (DNase I), Amplification Grade |
Fa. Life Technologies |
|
dNTP-Mix, 10 mM each (#18427-013) |
Fa. Life Technologies |
|
Random Primer Mix (# 48190-011) |
Fa. Life Technologies |
|
Superscript RNase H- Reverse Transkriptase |
Fa. Life Technologies |
|
Taq-DNA-Polymerase (# 18038-026) |
Fa. Life Technologies |
|
Taq-DNA-Polymerase PCR-Buffer (# 18067-017) |
Fa. Life Technologies |
HBSS - Puffer :
|
HBSS, flüssig |
|
|
1x105 U / l |
Penicillin |
|
100 mg / l |
Streptomycin |
|
200 mg / l |
Kanamycin |
|
25 mmol / l |
HEPES |
|
3 % |
Rinder Serum Albumin (BSA) Fraktion V |
| ↓27 |
Alle Zusätze in HBSS lösen, den pH-Wert mit NaOH auf 7,5 einstellen und die Lösung steril filtrieren (0,22 µm Porengröße, GP Express Membran, Fa. Millipore).
Kollagenaselösung :
Die Konzentration der verwendeten Kollagenase (Typ 1 CLS) variierte von Charge zu Charge zwischen 175 U / mg und 277 U / mg. Für 200 bis 300 g Fettgewebe wurde eine Konzentration von ca. 0,2 U / ml HBSS-Puffer eingesetzt. Für größere Gewebemengen (400 g) wurden bis zu 0,5 U / ml HBSS-Puffer verwendet.
| ↓28 |
Zum Ansetzen der Kollagenaselösung wurde zunächst 1 g der lyophilisierten Kollagenase (dies entspricht der Verpackungseinheit) in 10 ml HBSS-Puffer gelöst. Diese Stammlösung ist bei - 20°C ca. 2 Wochen haltbar. Ein entsprechendes Aliquot der Stammlösung wurde in der Regel vor Gebrauch zum vorbereiteten HBSS-Puffer (ca. 500 ml) gegeben und mit diesem zusammen steril filtriert (0,22 µm Porengröße, GP Express Membran, Fa. Millipore). Die gebrauchsfertige Kollagenaselösung ist bei 4°C maximal 3 Tage haltbar, danach läßt die Aktivität der Kollagenase stark nach.
Adipocytenmedium :
|
DMEM / F12 (1:1), Trockenmedium |
|
|
1 x 105 U / l |
Penicillin |
|
100 mg / l |
Streptomycin |
|
200 mg / l |
Kanamycin |
|
10 mg / l |
HEPES |
|
2,5 mmol / l |
N-Acetyl-L-Alanyl-L-Glutamin |
|
50 nmol / l |
Adenosin |
|
33 µmol / l |
d-Biotin |
|
0,85 g / l |
Na-Bicarbonat, NaHCO3 |
|
1% |
Rinder Serum Albumin (BSA) Fraktion V |
|
1% |
Fötales Kälberserum (FKS) |
| ↓29 |
Trockenmedium und alle Zusätze, außer FKS, in pyrogenfreiem Wasser lösen, mit NaOH auf pH 7,4 einstellen, auf 990 ml auffüllen und steril filtrieren (0,22 µm Porengröße, GP Express Membran, Fa. Millipore). Lagerung bei 4°C. FKS oder entsprechende Menge H2O (bei serumfreier Kultivierung) vor Gebrauch zugeben.
CsCl – Lösung :
|
5,7 M |
CsCl |
|
12,5 mM |
Na-Acetat, pH 6 |
| ↓30 |
in DEPC-H2O lösen, steril filtrieren, bei 4°C lagern.
GIT - Puffer :
|
4 M |
Guanidiniumthiocyanat |
|
25 mM |
Na-Acetat, pH 6 |
|
0,1 M |
2-Mercaptoethanol |
| ↓31 |
in DEPC-H2O lösen, steril filtrieren, bei 4°C lagern.
50 x TAE-Elektrophoresepuffer:
|
242 g / l |
Tris-Acetat |
|
57,1 ml / l |
Essigsäure |
|
100 ml / l |
EDTA (0,5 M, pH 8) |
| ↓32 |
GLB-Puffer :
|
0,1 % |
Bromphenolblau |
|
50 % |
Glycerol |
in RNase-freiem Wasser lösen.
| ↓33 |
AT1 (N-10) : Kaninchen IgG, polyclonal, Bindung an die Aminosäuren 15 – 24 des aminoterminalen Endes des humanen Angiotensin II-Rezeptors Typ 1, keine Kreuzreaktivität mit dem Angiotensin II-Rezeptor Typ 2; Fa. Santa Cruz (# sc-1173)
Cy-2-konjugierter Sekundärantikörper : Esel anti Kaninchen IgG (H+L), polyclonal, Cy-2 (Carbocyanin) Fluoreszenzfarbstoff mit maximaler Anregung bei 490 nm und maximaler Emmission bei 508 nm; Fa. Dianova (# 711-225-152)
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| DiML DTD Version 4.0 | Zertifizierter Dokumentenserver der Humboldt-Universität zu Berlin | HTML-Version erstellt am: 31.10.2006 |