Material

2.1  Geräte

↓19

Analysenwaage BP 615

Fa. Sartorius

Biofuge 13

Fa. Heraeus

Brutschrank, Kupfer; Function Line

Fa. Heraeus

DNA Thermal Cycler

Fa. Perkin Elmer

Elektrorührer Compact HPI

Fa. Variomag

Fluoreszenz Kondensor CK 40 – RFA

Fa. Olympus

Fluoreszenzmodul Blau CX – DMB

Fa. Olympus

Fluoreszenzmodul Grün CX – DMG

Fa. Olympus

GeneAmp PCR System 9600

Fa. Perkin Elmer

Inversmikroskop CK 40 mit Fluoreszenzmodulen

Fa. Olympus

Inversmikroskop Diaphot 300

Fa. Nikon

Konfokalmikroskopapparatur

Fa. Biorad

Magnetrührer

Fa. IKA

MUPID-2 Mini-Gel Elektrophoresis Unit

Fa. Cosmo Bio Co., LTD.

Roto-Vette

Fa. Helma

Schüttelwasserbad SW 20

Fa. Julabo

Sequence Detection System 5700

Fa. PE Biosystems

Sterile Werkbank HERA Safe

Fa. Heraeus

Thermomixer 5436

Fa. Eppendorf

Tischzentrifuge 5415 C

Fa. Eppendorf

Ultraschallbad Ultrasonics

Fa. Astrason

Ultrazentrifuge L-70

Fa. Beckman

UV Imager TI 2

Fa. Biometra

UV Spectrometer UV 1202

Fa. Shimatzu

UV Spectrometer Ultra-Spec 2000

Fa. Pharmacia Biotec

UV Transluminator

Fa. UVP, Inc.

Vortex-Genie-2

Fa. Scientific Industries

Wasserbad

Fa. Kötterman

Zentrifuge 5810 R

Fa. Eppendorf

Zentrifuge RC2-B

Fa. Sorvall

2.2 Spezielle Materialien

Steritop-GP Filter (0,22 µm Porengröße, GP Express Membran) (# SCGPT 05 RE)

Fa. Millipore

MicroAmp Optical Caps (# N 80 10 935)

Fa. PE Biosystems

MicroAmp Optical 96 Well Reaction Plates
(# N 80 10 560)

Fa. PE Biosystems

Siebgewebe, Polypropylen, 250 µm Maschenweite

Fa. W. Kaldenbach

Sterikan Sonderkanülen 20-G, gelb (0,9 x 70 mm)
(# 466 57 91)

Fa. Braun

Zellkulturflaschen, 225 cm2 (900 ml) (# 3160-225)

Fa. Dunn Labortechnik

Zellkulturflaschen EasyFlask mit Filterkappen 25 cm2 (50 ml) (# 156367) bzw. 75 cm2 (260 ml) (# 156499)

Fa. Nunc

Zellkulturflaschen SoLo Flask 185 cm2 (600 ml)mit Filterkappen (# 144903)

Fa. Nunc

UZ-Röhrchen Ultra-Clear (# 344057)

Fa. Beckman

2.3 Chemikalien

Acridinorange (# 15931-0025)

Fa. Merck

Adenosin (# A 4036)

Fa. Sigma

Agarose (# A 9539)

Fa. Sigma

Angiotensin II, human (# A 9525)

Fa. Sigma

Aqua ad iniectabilia

Fa. Braun

Aqua Spüllösung

Fa. Delta Pharma

Aqua-Poly / Mount (# 18606)

Fa. Polysciences, Inc.

Bovine Serum Albumin (BSA) Fract. V (# 01400)

Fa. Biomol

Bovine Serum Albumin (BSA) Fract. V (# A 9418)

Fa. Sigma

Cäsiumchlorid (# C 4036)

Fa. Sigma

Chloroform (# 10 2445)

Fa. Merck

D-Biotin (# B 4639)

Fa. Sigma

DEPC (Diethylpyrocarbonat) (# 5758)

Fa. Sigma

DMEM / F12 (1:1), Dubecco´s Modified Eagles´Medium / Nutrient F12, (# 32 500-019)

Fa. Life Technologies

Eisessig (# 1.000.561.000)

Fa. Merck

17-β-Estradiol (# E 8875)

Fa. Sigma

Ethanol, unvergällt (# 1.009.831.000)

Fa. Merck

Ethanol, vergällt (# 1.009.741.011)

Fa. Merck

Fötales Kälberserum (FKS) (# S 0113)

Fa. Biochrom

N-Acetyl-L-Alanyl-L-Glutamin (# K 0202)

Fa. Biochrom

Guanidiniumthiocyanat (# G 9277)

Fa. Sigma

HBSS (Hank´s Balanced Salt Solution) (# L 2015)

Fa. Biochrom

HEPES (# L 1615)

Fa. Biochrom

Hydrocortison (# H 4001)

Fa. Sigma

Isopropanol (2-Propanol ) (# 1.096.341.000)

Fa. Merck

Insulin (# I 2767)

Fa. Sigma

Kanamycin (# 15160-047)

Fa. Life Technologies

2-Mercaptoethanol (# M 6250)

Fa. Sigma

Methylen Blue Solution (# 66F-6109)

Fa. Sigma-Diagnostics

Natriumacetat (# 1.06268.1000)

Fa. Merck

Natriumbicarbonat, NaHCO3 (# S 5771)

Fa. Sigma

Natriumhydroxid, NaOH (#1.064.95.1000)

Fa. Merck

PBS (Phophat Buffered Saline) ohne Mg2+, Ca2+ (# 1825)

Fa. Biochrom

Penicillin /Streptomycin (# A 2212)

Fa. Biochrom

TNFα, human (# T 6674)

Fa. Sigma

Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Trizima-Base), (# T 1503)

Fa. Sigma

3,3´,5-Triiodo-L-Thyronin (# T 2752)

Fa. Sigma

Trypan Blau in PBS (# L 6323)

Fa. Biochrom

2.4 Primer und Sonden

↓20

Die nachfolgenden Primer wurden von der Fa. Life Technologies bezogen.

Alle verwendeten Sonden stammen von der Fa. BioTez, MDC Berlin-Buch und sind am 5´-Ende mit FAM (6-Carboxy-Fluoricein, Emission bei 518 nm) und am 3´-Ende mit TAMRA (6-Carboxy-tetramethyl-rhodamin, Emission bei 582 nm) markiert.

Pyruvat-Dehydrogenase ( PDH )-Gen

↓21

Vorwärtsprimer :

5’ GGT ATG GAT GAG GAG CTG GA 3’

20-mer

Rückwärtsprimer :

5’ CTT CCA CAG CCC TCG ACT AA 3’

20-mer

Renin ( REN )-Gen

Vorwärtsprimer :

5´ TTg gAg Agg TCA Cgg AgA TgC 3´

21-mer

Rückwärtsprimer :

5´ TgC CCA CAA CCC CAT CAA AC 3´

20-mer

Sonde :

5´CGC CTT ACC CTT CAT GCT GGC CG 3´

23-mer

↓22

Angiotensinogen ( AGT )-Gen

Vorwärtsprimer :

5´ CTT CAC TgA gAg CgC CTg C 3´

19-mer

Rückwärtsprimer :

5´ gAg ACC CTC CAC CTT gTC CA 3´

20-mer

Sonde :

5´ CTg ATC CAg CCT CaC TAT gCC TCT gAC C 3´

28-mer

Angiotensin-Converting-Enzym ( ACE )-Gen

↓23

Vorwärtsprimer :

5´ CAC CCA ggC CAg gAA gTT T 3´

19-mer

Rückwärtsprimer :

5´ TgC CCg TTC TAg gTC CTg AA 3´

20-mer

Sonde :

5´ CCA gTT gCA gAA CAC CAC TAT CAA gCg g 3´

28-mer

Angiotensin II-Rezeptor Typ 1 ( AGTR1 )-Gen

Vorwärtsprimer :

5´ ACC CAA TgA AgT CCC gCC T 3´

19-mer

Rückwärtsprimer :

5´ AgC AgC CAA ATg ATg ATg CAg 3´

21-mer

Sonde :

5´ CgA CgC ACA ATg CTT gTA GCC AAA gTC A 3´

28-mer

↓24

Angiotensin II-Rezeptor Typ 2 ( AGTR2 )-Gen

Vorwärtsprimer :

5´ CCA AgT CCT gAA gAT ggC AgC 3´

21-mer

Rückwärtsprimer :

5´ gga agg tca gaa cat gga agg g 3´

22-mer

Sonde :

5´ TTG TTC TGG CCT TCA TCA TTT GCT GGC T 3´

28-mer

Leptin (LEP)-Gen

↓25

Vorwärtsprimer :

5´ ACC AGG ATC AAT GAC ATT TCA CAC 3´

24-mer

Rückwärtsprimer :

5´ CCA GGA ATG AAG TCC AAA CCG 3´

21-mer

Sonde :

5´ CGC AGT CAG TCT CCT CCA AAC AGA AAG TCA T 3´

31-mer

Für das GAPDH -Gen wurde der „Human GAPDH“ Kit (huGAPDH, VIC-markiert, # 4310884 E) der Firma PE Biosystems verwendet. Die Sequenzen werden vom Hersteller nicht bekannt gegeben.

2.5 Kits

Human GAPDH Kit (huGAPDH,vic-markiert)
(# 4310884 E)

Fa. PE Biosystems

Human Endogenous Control Plates (# 4309921)

Fa. PE Biosystems

PUREscript (# 210002)

Fa. Biozym

Rnase Free DNase Set (# 79254)

Fa. Qiagen

Rneasy Mini Kit (# 74 106)

Fa. Qiagen

RLT-Puffer für den Rneasy Mini Kit (# 79 216)

Fa. Qiagen

TaqMan Universal PCR Mastermix (4305719)

Fa. PE Biosystems

TRIzol Reagenz (# 15596-018)

Fa. Life Technologies

2.6 Enzyme und PCR-Reagenzien

↓26

Kollagenase Typ I CLS (# C1-22)

Fa. Biochrom

Desoxyribonuclease I (DNase I), Amplification Grade
(# 18068-015)

Fa. Life Technologies

dNTP-Mix, 10 mM each (#18427-013)

Fa. Life Technologies

Random Primer Mix (# 48190-011)

Fa. Life Technologies

Superscript RNase H- Reverse Transkriptase
(# 18053-017)

Fa. Life Technologies

Taq-DNA-Polymerase (# 18038-026)

Fa. Life Technologies

Taq-DNA-Polymerase PCR-Buffer (# 18067-017)

Fa. Life Technologies

2.7 Lösungen, Medien, Puffer

HBSS - Puffer :

HBSS, flüssig

1x105 U / l

Penicillin

100 mg / l

Streptomycin

200 mg / l

Kanamycin

25 mmol / l

HEPES

3 %

Rinder Serum Albumin (BSA) Fraktion V

↓27

Alle Zusätze in HBSS lösen, den pH-Wert mit NaOH auf 7,5 einstellen und die Lösung steril filtrieren (0,22 µm Porengröße, GP Express Membran, Fa. Millipore).

Kollagenaselösung :

Die Konzentration der verwendeten Kollagenase (Typ 1 CLS) variierte von Charge zu Charge zwischen 175 U / mg und 277 U / mg. Für 200 bis 300 g Fettgewebe wurde eine Konzentration von ca. 0,2 U / ml HBSS-Puffer eingesetzt. Für größere Gewebemengen (400 g) wurden bis zu 0,5 U / ml HBSS-Puffer verwendet.

↓28

Zum Ansetzen der Kollagenaselösung wurde zunächst 1 g der lyophilisierten Kollagenase (dies entspricht der Verpackungseinheit) in 10 ml HBSS-Puffer gelöst. Diese Stammlösung ist bei - 20°C ca. 2 Wochen haltbar. Ein entsprechendes Aliquot der Stammlösung wurde in der Regel vor Gebrauch zum vorbereiteten HBSS-Puffer (ca. 500 ml) gegeben und mit diesem zusammen steril filtriert (0,22 µm Porengröße, GP Express Membran, Fa. Millipore). Die gebrauchsfertige Kollagenaselösung ist bei 4°C maximal 3 Tage haltbar, danach läßt die Aktivität der Kollagenase stark nach.

Adipocytenmedium :

DMEM / F12 (1:1), Trockenmedium

1 x 105 U / l

Penicillin

100 mg / l

Streptomycin

200 mg / l

Kanamycin

10 mg / l

HEPES

2,5 mmol / l

N-Acetyl-L-Alanyl-L-Glutamin

50 nmol / l

Adenosin

33 µmol / l

d-Biotin

0,85 g / l

Na-Bicarbonat, NaHCO3

1%

Rinder Serum Albumin (BSA) Fraktion V

1%

Fötales Kälberserum (FKS)

↓29

Trockenmedium und alle Zusätze, außer FKS, in pyrogenfreiem Wasser lösen, mit NaOH auf pH 7,4 einstellen, auf 990 ml auffüllen und steril filtrieren (0,22 µm Porengröße, GP Express Membran, Fa. Millipore). Lagerung bei 4°C. FKS oder entsprechende Menge H2O (bei serumfreier Kultivierung) vor Gebrauch zugeben.

CsCl – Lösung :

5,7 M

CsCl

12,5 mM

Na-Acetat, pH 6

↓30

in DEPC-H2O lösen, steril filtrieren, bei 4°C lagern.

GIT - Puffer :

4 M

Guanidiniumthiocyanat

25 mM

Na-Acetat, pH 6

0,1 M

2-Mercaptoethanol

↓31

in DEPC-H2O lösen, steril filtrieren, bei 4°C lagern.

50 x TAE-Elektrophoresepuffer:

242 g / l

Tris-Acetat

57,1 ml / l

Essigsäure

100 ml / l

EDTA (0,5 M, pH 8)

↓32

GLB-Puffer :

0,1 %

Bromphenolblau

50 %

Glycerol

in RNase-freiem Wasser lösen.

2.8 Antikörper

↓33

AT1 (N-10) : Kaninchen IgG, polyclonal, Bindung an die Aminosäuren 15 – 24 des aminoterminalen Endes des humanen Angiotensin II-Rezeptors Typ 1, keine Kreuzreaktivität mit dem Angiotensin II-Rezeptor Typ 2; Fa. Santa Cruz (# sc-1173)

Cy-2-konjugierter Sekundärantikörper : Esel anti Kaninchen IgG (H+L), polyclonal, Cy-2 (Carbocyanin) Fluoreszenzfarbstoff mit maximaler Anregung bei 490 nm und maximaler Emmission bei 508 nm; Fa. Dianova (# 711-225-152)


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
DiML DTD Version 4.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
31.10.2006