3  Methoden

Die hier angewandte Methode basiert auf der von Rodbell 1963 beschriebenen Isolierung von Adipocyten aus Fettgewebe der Ratte.  112 Die Grundlagen dieser Methode sind die enzymatische Auflösung der Gewebestruktur mittels Kollagenase und die Trennung von Adipocyten und Stromavaskularzellen (Präadipocyten, Fibroblasten, Blutzellen) durch Zentrifugation. Diese Methode wurde soweit modifiziert, daß sie sich gut zur Isolierung humaner Adipocyten (aber auch Präadipocyten) aus größeren Gewebemengen (bis 400 g) eignete. Auf die gleichzeitig mögliche Isolierung von Präadipocyten wird im folgenden Protokoll jedoch nicht genauer eingegangen, da dieser Teil der Methode für die hier vorgestellten Untersuchungen nicht benötigt wurde.

Vor allem für die Stimulationsversuche wurden große Gewebemengen benötigt, da der Anteil ausdifferenzierter Adipocyten pro Gramm Fettgewebe aufgrund ihrer ungewöhlichen Größe (40 - 180 µm) relativ gering ist (verglichen mit anderen Geweben). Außerdem können sich ausdifferenzierte Adipocyten nicht mehr vermehren und sind daher nur eine begrenzte Zeit (ca. zwei Wochen) in Kultur zu halten. Dies machte es notwendig, für die einzelnen Teilversuche jeweils neue Primärkulturen anzulegen.

Die ausdifferenzierten Adipocyten wurden aus subkutanem Fettgewebe der Brust oder des Bauches weiblicher Patientinnen isoliert, die sich aus kosmetischen Gründen entweder einer Mammareduktion oder einer Bauchplastik unterzogen haben.

Protokoll

1. Fettgewebe entweder direkt nach der Entnahme im OP auf einer sterilen Unterlage in kleinere Stücke schneiden und in Flaschen mit gekühltem HBSS-Puffer (s. 2.7) oder Adipocytenmedium ins Labor überführen, oder das gesamte Explantat unzerkleinert und leicht gekühlt (nicht direkt auf Eis) in einem sauberen Autoklavierbeutel transportieren.
2. Entnommenes Fettgewebe in möglichst kleine Stücke schneiden und dabei von großen Bindegewebsstücken und Blutgefäßen befreien.
3. 200 bis 400 g des kleingeschnittenen Gewebes auf mehrere 50 ml-Zentrifugengefäße mit vorgelegtem HBSS-Puffer verteilen und darin leicht schütteln, da Fettgewebestücke aufgrund des hohen Fettgehaltes an der Oberfläche schwimmen.
4. Dann die Röhrchen 5 min bei 200 x g zentrifugieren (Eppendorf Zentrifuge 5810 R mit Ausschwingrotor).
5. Unterstand (HBSS-Puffer) mit den zu Boden gesunkenen festen Bestandteilen (z. B. geronnenes Blut) absaugen.
6. Jeweils ca. 100 bis 200 g der kleinen Stücke in eine 900 ml-Gewebekulturflasche mit 250 ml Kollagenaselösung (ca. 0,2 U / ml, s. 2.7) überführen.
   Die Fettgewebemenge sollte nicht mehr als die Hälfte des Gesamtvolumens ausmachen, da sonst der Kollagenaseverdau ineffizient ist.
7. Gewebekulturflaschen waagerecht ins Wasserbad legen und 60 - 90 Minuten bei 37°C unter leichtem Schwenken (60 - 80 rpm) inkubieren, bis fast keine Fettgewebestücke mehr erkennbar sind.
8. Die durch den Kollagenaseverdau entstandene Zellsuspension durch einen sterilen Siebgewebetrichter aus Polypropylen (Maschenweite 250 µm) filtrieren, um noch vorhandene Bindegewebsreste und unverdaute Stücke abzutrennen.
9. Filtrat dann auf 50 ml-Zentrifugenröhrchen verteilen und 5 min mit 200 x g zentrifugieren (s. o.).
10. Die nach der Zentrifugation an der Oberfläche schwimmenden Adipocyten vorsichtig durch Dekantieren in frische Zentrifugenröhrchen überführen und in Aliquots von 20 - 25 ml Adipocyten aufteilen.
    Die Präadipocyten verbleiben im Unterstand und können ab hier separat weiterbearbeitet werden.
11. Aliquotierte Adipocyten mit etwa dem gleichen Volumen HBSS-Puffer auffüllen.
12. Adipocyten durch mehrfaches Schwenken des Röhrchens resuspendieren und erneut zentrifugieren (s.o.).
13. Zuerst die über der Zellschicht liegende Ölschicht und dann den Unterstand, einschließlich des eventuell noch vorhandenen Pellets, absaugen.
14. Adipocyten auf diese Weise noch zweimal mit HBSS-Puffer waschen und zentrifugieren (s. o.).
15. Nach dem dritten Mal jeweils ca. 30 – 40 ml der durch Zentrifugation separierten Adipocyten in 60 ml Adipocytenmedium mit 1 % FKS (s. 2.7) resuspendieren und in eine 600 ml-Gewebekulturflasche überführen.
16. Zellen über Nacht in einem befeuchteten Brutschrank mit 5 % CO₂ bei 37°C als 2 - 4 mm dünne, an der Oberfläche schwimmende Schicht inkubieren.
17. Adipocyten am folgenden Tag erneut zentrifugieren (s. o.) und das alte Medium durch frisches Adipocytenmedium ersetzen.
    (Andere eventuell noch vorhandene Zellen sinken über Nacht zu Boden und werden dort adherent. Durch den Wechsel der Flaschen und des Mediums lassen sich diese Zellen daher sehr einfach von den an der Oberfläche schwimmenden Adipocyten trennen.)

Die Kultivierung der isolierten Adipocyten basiert im wesentlichen auf den von Marshall et al.  113 für Rattenadipocyten und den von Moustaïd et al.  114 für humane Adipocyten beschriebenen Methoden. Ausdifferenzierte Adipocyten werden im Gegensatz zu Zellen anderer Gewebe aufgrund ihres hohen Fettgehaltes in der Kultur nicht adherent. Da sie außerdem mechanisch relativ empfindlich sind, eignen sie sich auch nicht für Suspensionskulturen. Aus diesem Grund werden die Zellen als dünne, an der Oberfläche des Nährmediums schwimmende Zellschicht kultiviert.

Die wichtigste Modifikation betrifft das verwendete Medium. Hier wird als Basis DMEM / HAMS´F12 verwendet, das auch bei der Kultivierung von Präadipocyten eingesetzt wird. Außerdem wird eine Kombination aus HEPES und Bicarbonat zum Abpuffern des Mediums verwendet, und N-Acetyl-L-Alanyl-Glutamin („stabiles“ Glutamin) als L-Glutamin-Quelle eingesetzt. Mit diesen Veränderungen ist es möglich sowohl „Kurzzeitversuche“ (bis 48 Stunden) in serumfreiem Medium als auch Versuche über einen längeren Zeitraum (bis zwei Wochen) in serumhaltigem Medium durchzuführen. Auf die Adipocytenkultivierung in serumfreiem Medium wird im folgenden Protokoll jedoch nicht näher eingegangen, da dieser Teil der Methode im Rahmen dieser Arbeit nicht verwendet wurde.

Protokoll

1. Adipocyten nach der Isolierung mindestens 12 Stunden in serumhaltigem Adipocytenmedium mit 1 % FKS (s. 2.7) als dünne an der Oberfläche schwimmende Schicht inkubieren (s. 3.1.1).
2. Durch leichtes Schwenken der Zellkulturflasche Adipocyten resuspendieren, dann in Zentrifugenröhrchen überführen und 5 min bei 200 x g zentrifugieren (Eppendorf Zentrifuge 5810 R mit Ausschwingrotor).
3. Ölschicht und Unterstand absaugen.
4. Zellen in frischem Adipocytenmedium (1 % FKS) resuspendieren und in eine frische Zellkulturflasche überführen.
5. ggf. Versuchsbeginn.
6. Kultivierung in einem befeuchteten Brutschrank mit 5 % CO₂ bei 37°C.
7. Medium täglich wechseln, ggf. Zellzahl- und Vitalitätsbestimmung durchführen (s. 3.1.3 bzw. 3.1.4).

Für Adipocyten hatte sich die Zellzahlbestimmung mittels herkömmlicher Zählkammern als ungeeignet erwiesen. Im folgenden wird eine Methode vorgestellt, bei der die modifizierte Form eines Gerätes verwendet wird, das urspünglich zur halbautomatischen Bestimmung von Urinsediment konzipiert wurde.

Das R/S 1000 der Firma Diasys besteht aus einer optisch klaren Durchflußkammer mit aufgeprägten Zählgittern, die in einer Metallhalterung befestigt ist. Sie dient als Objektträger und bleibt während des gesamten Arbeitsvorganges auf dem Mikroskoptisch liegen. Die Kammer ist über Schläuche auf der einen Seite mit einer kleinen Pumpanlage verbunden und auf der anderen Seite mit einem Ansaugstift, der in die Urinprobe bzw. in diesem Fall in die Zellsuspension eingetaucht wird. Ein Aliquot (ca. 250 µl) der Probe wird mit Hilfe der Pumpe innerhalb von drei Sekunden in die Zählkammer eingesaugt und nach der Zählung wieder über den Ansaugstift ausgespült.

Da die serienmäßige Zählkammer für Adipocyten zu niedrig war, wurde uns vom Hersteller eine 250 µm hohe Zählkammer zur Verfügung gestellt. Sie enthält vier, an der Außenseite aufgeprägte Zählgitter, bestehend aus je 5 x 5 Kästchen. Das Volumen eines Kästchens beträgt 0,02 µl, das eines Gitters 0,5 µl und das Gesamtvolumen aller vier Gitter somit 2 µl.

Protokoll

1. Adipocytenkultur in einem sterilen Gefäß mit Hilfe eines Magnetrührers suspendieren.
2. Ein Aliquot der Zellsupension (500 bis 1000 µl) in ein 3 ml-Plastikröhrchen mit geradem Boden überführen, mit Adipocytenmedium auf ein Endvolumen von 2 ml auffüllen und auf dem Magnetrührer resuspendieren.
3. Durchflußzählkammer mit dem Zählgitter nach oben unter das Mikroskop legen und 40-fache Vergrößerung einstellen.
4. Ansaugstift in den mittleren Bereich der Adipocytensuspension halten und den „Sample“-Knopf drücken, um einen Teil der Probe (ca. 250 µl) in die unter dem Mikroskop liegende modifizierte Zählkammer einzusaugen.
5. Adipocyten treiben in der Zählkammer nach oben, sammeln sich dort unter dem außen aufgeprägten Zählgitter und können nun gezählt werden. Die Zellzahl eines Gitters entspricht der Anzahl an Adipocyten in 0,5 µl der verdünten Zellsuspension.
6. Nach Beendigung des Zählens Ansaugstift in den Abfallsammelbehälter halten und dann den „Purge“-Knopf drücken, um die Zellen mit isotonischer Kochsalzlösung aus der Durchflußkammer auszuspülen.
7. Ausspülvorgang wiederholen, bis keine Adipocyten mehr in der Durchflußkammer sind.
8. Zählvorgang noch mindestens zweimal wiederholen.

Die Zellzahl wird wie folgt berechnet :

Zellzahl pro Gitter x 2000 x Verdünnungsfaktor = Zellen / ml (der Kultur)

Anmerkung

Sollte das Spülen mit Kochsalzlösung nicht ausreichen, um die Zählkammer zu säubern, kann die vom Hersteller mitgelieferte „Urizym“-Lösung in die Zählkammer eingesaugt werden. Eine kurze Einwirkzeit (ca. 1 min) ist meist ausreichend, um letzte Zellen und Lipidreste gründlich aus der Kammer und dem Ansaugschlauch zu entfernen.

Zur besseren Unterscheidung von Adipocyten und Fettropfen können die Zellkerne der Fettzellen vor dem Einsaugen in die Zählkammer mit Methylenblau angefärbt werden. Dazu wird das aus der Zellsuspension abgenommene Aliquot mit 100 µl einer 1,4 %-igen Methylenblaulösung durch vorsichtiges Schütteln mit der Hand gemischt. Nach fünf Minuten erfolgt die Zählung (s. o.). Unter dem Mikroskop sind die diskusförmigen Zellkerne dunkelblau gefärbt, das umgebende Medium ist blaßblau und die Lipidtropfen ungefärbt, wodurch Adipocyten deutlich von Lipidtropfen ähnlicher Größe zu unterscheiden sind.

Eine häufig in der Zellkultur angewandte Methode zur Vitalitätsbestimmung ist das Anfärben des Cytoplasmas mit Trypanblau. Diese hatte sich jedoch für ausdifferenzierte Adipocyten als ungeeignet erwiesen (s. 1.3).

Im folgenden ist eine Methode zur Bestimmung der Vitalität beschrieben, bei der die DNA der Zellkerne mit Acridinorange angefärbt wird. Unter Blaulichtanregung färbt Acridinorange die Zellkerne lebender Zellen grün, die Kerne absterbender oder toter Zellen dagegen gelborange bis rot. Im Gegensatz zur Zellzahlbestimung ist in diesem Fall eine Gleichverteilung der Zellen in der Zählkammer nicht erforderlich, da hier nur das Verhältnis von vitalen Zellen zu toten Zellen bestimmt wird. Der prozentuale Anteil vitaler Zellen (grüner Kerne) in einer definierten Population entspricht dann der Vitalitätsrate. Diese Methode wurde erstmals von Lorch et al. 1969  115 zur Färbung von Adipocyten der Maus beschrieben und wurde als Alternative zur Bestimmung des DNA-Gehaltes eingesetzt. Nachfolgend ist eine modifizierte Form dieses Verfahren dargestellt.

Protokoll

1. Eine 0,5 %-ige (5 mg / ml) Acridinorangestammlösung in einer gepufferten Salzlösung ohne Phenolrot, mit 1 % BSA (HBSS oder PBS) ansetzen und vor Gebrauch ungelöste Kristalle abfiltrieren (Papierfilter oder Spritzenfilter mit 0,45 µm Porengröße).
2. Ein Aliquot der Zellsuspension (250 µl – 1 ml) im Verhältnis 1 : 2 mit der Acridinorangelösung mischen und 5 - 10 min einwirken lassen.
3. Zellen mehrfach mit der gepufferten Salzlösung waschen, d. h. kurz anzentrifugieren (Eppendorf Zentrifuge 5415 C) Unterstand absaugen und Zellen in frischem Puffer resuspendieren.
4. Bleibt der Puffer nach dem Resuspendieren farblos, ein Aliquot entnehmen und entweder in der Zählkammer des modifizierten R/S 1000 oder in einer Fuchs-Rosenthal-Zählkammer mikroskopieren.
5. Unter Blaulichtanregung bei 100-facher Vergrößerung mindestens 200 Adipocyten pro Durchgang auszählen und das Verhältnis von Zellen mit hellgrün leuchtendem Zellkern (vital) gegenüber Zellen mit orangerotem Zellkern (nicht mehr vital) bestimmen. Den oval bis diskusförmig Zellkern dabei genau fokussieren, da ein leicht rötliches Leuchten auch von außen anhaftenden Farbstoffpartikeln stammen kann, die nicht vollständig abgewaschen wurden.
6. Zählung 2 - 3 mal wiederholen.

Es wurde entweder das Zeiss Fluoreszenz-Auflichtmikroskop III RS mit dem Interferenz-Breitbandfilter 09 (BP 450 – 490, FT 510, LP 520) oder das Olympus Inverse Mikroskop CK 40 mit Fluoreszenzaufsatz verwendet.

Um zu kontrollieren, ob die verwendete Methode zur Isolierung von ausdifferenzierten Adipocyten reproduzierbare Ergebnisse erbringt, wurden die Zellen nach der Isolierung gezählt und die Zellzahl pro Gramm Fettgewebe ermittelt. Auf diese Weise ist es auch möglich, den Bedarf an Fettgewebe für einen geplanten Versuch abzuschätzen bzw. die Anzahl möglicher Teilversuche, die mit dem zur Verfügung stehenden Gewebe durchführbar sind, zu bestimmen.

Die Kulturbedingungen wurden kontrolliert, indem die Adipocyten täglich gezählt und ihre Vitalität bestimmt wurde. Da ausdifferenzierte Adipocyten sich nicht mehr vermehren können, nimmt die Zellzahl im Laufe der Kultivierung z. B. durch Zelltod, mechanischen Streß und Verluste beim Medienwechsel ab. Daher werden Kulturbedingungen dann als günstig erachtet, wenn für die Dauer der Kultivierung der Zellverlust gleichbleibend gering ist und die Vitalitätsrate über 90 % liegt.

Darüber hinaus wurde untersucht, ob die Zugabe der Substanzen, die für die Stimulationsexperimente eingesetzt werden sollten, einen Einfluß auf die Vitalität der Adipocyten haben.

Da sich die RNA-Isolierung aus Adipocyten mit herkömmlichen Verfahren als problematisch erwiesen hatte, werden im ersten Teil zunächst vier verschiedene Methoden mit modifizierten Protokollen beschrieben, die auf ihre Eignung für Fettzellen untersucht werden sollten. Im zweiten Teil ist darauf aufbauend ein optimiertes Protokoll für ausdifferenzierte Adipocyten aufgeführt. Dieses bildet die Grundlage für alle folgenden Versuche, denen die Isolierung von Gesamt-RNA zugrunde lag.

3.2.1  RNA-Isolierungsmethoden

Auf der Suche nach einer effizienten Methode der RNA-Isolierung aus ausdifferenzierten Adipocyten wurden vier verschiedene Systeme in bezug auf Ausbeute, Reinheit (Kontaminationen mit DNA, Proteinen, Salzen, ggf. Phenol) und Zeitaufwand getestet. Wie unter Punkt 3.2.1.1 – 3.2.1.4 beschrieben, unterscheiden sich die ausgewählten Verfahren sowohl in der Art des Zellaufschlusses als auch in der Methode der Trennung von RNA, DNA und Proteinen.

Um die Methoden miteinander vergleichen zu können, wurden für alle Versuche jeweils in flüssigem Stickstoff schockgefrorene Aliquots mit 2 x 10⁶ Zellen (2 ml) der gleichen Adipocytenpräparation verwendet und für alle Verfahren folgende Modifikationen vorgenommen:

• Aufgrund der Größe der Zellen wurde das gefrorene Adipocytenpellet in der zehnfachen Menge des vom jeweiligen Kit vorgegebenen Volumens an Lysepuffer lysiert.
• Um das Lysat zu homogenisieren und die genomische DNA zu scheren, wird es kurz erwärmt, kräftig geschüttelt und dann mehrfach durch eine 20-G Kanüle gesaugt.
• Das bei der Lyse freigesetzte Lipid wird durch Zentrifugation abgetrennt.

Nach der RNA-Isolierung wurden die Konzentration und die Reinheit der Proben photometrisch bestimmt (s. 3.3). Die Integrität der RNA und das Auftreten von DNA-Kontaminationen wurden mittels Gelelektrophorese (s. 3.3) vor und nach der DNase I-Behandlung (s. 3.4), sowie durch RT-PCR der Pyruvat-Dehydrogenase-mRNA überprüft (s. u.).

Im folgenden ist der Versuchsablauf einschließlich der bereits erwähnten Modifikationen dargestellt.

Protokoll

Bei dieser Methode zur Isolierung von Gesamt-RNA erfolgt der Aufschluß der Zellen in einem SDS-haltigen Puffer. Daran anschließend werden die festen Bestandteile, die genomische DNA und die Proteine präzipitiert, während die RNA in Lösung bleibt. Um auch Salze aus der Lösung zu entfernen, wird die RNA danach ebenfalls gefällt, das RNA-Pellet gewaschen und wieder in Wasser aufgenommen.

Auf dieser Methode basiert der hier eingesetzte PUREscript-Kit der Fa. Biozym. Abgesehen von den unter 3.2.1 zusammengefaßten Modifikationen wurde entsprechend dem Protokoll des Herstellers verfahren, wobei die Menge der verwendeten Lösungen dem größeren Volumen des Lysates angepaßt wurden. Nachfolgend ist das Verfahren kurz zusammengefaßt:

Protokoll

Diese Methode zur Isolierung von Gesamt-RNA aus Gewebe oder Zellen basiert darauf, daß DNA und Proteine in saurem Phenol (pH-Wert 5 - 6) löslich sind, RNA jedoch nicht.  116 Durch Zugabe von saurem Phenol zum Zell- bzw. Gewebelysat läßt sich die RNA leicht abtrennen, da DNA und Proteine in die Phenolphase übergehen, während die RNA in der wäßrigen Phase gelöst bleibt. Unterstützt wird diese Trennung noch durch die Zugabe hydrophober Lösungsmittel wie z. B. Chloroform. Darüber hinaus werden RNasen durch den niedrigen pH-Wert inaktiviert.  117

Das hier verwendete TRIzol^®-Reagenz (Fa. Life Technologies) besteht aus einem Gemisch von Guanidiniumisothiocyanat und saurem Phenol. Guanidiniumisothiocyanat lysiert die Zellen und inhibiert darüber hinaus RNasen wirksam. Die Zugabe von Chloroform führt zur Trennung der hydrophoben Phenol-Chloroform-Phase (mit DNA und Proteinen) und der wäßrigen Phase mit der darin gelösten RNA.

Auch hier wurde von den unter 3.2.1 aufgeführten Modifikationen abgesehen entsprechend dem Protokoll des Herstellers verfahren, wobei die Menge der verwendeten Lösungen dem größeren Volumen des Lysates angepaßt wurden. Allerdings entfällt die unter 3.2.1 Punkt 8, angegebene Zentrifugation, da sich die freigesetzten Lipide ebenfalls im TRIzol-Reagenz lösen. Die Abtrennung der Lipide erfolgt dementsprechend gleichzeitig mit der Phasentrennung nach der Chloroform-Zugabe. Nachfolgend ist das Verfahren kurz zusammengefaßt:

Protokoll

Dieser Methode zur Präparation von Gesamt-RNA beruht auf dem unterschiedlichen Sedimentationsverhalten von RNA und DNA bei Ultrazentrifugation über einem Cäsiumchlorid-Gradienten (5,7 M) und wurde von Chirgwin et al. 1979 beschrieben.  118

Der Aufschluß der Zellen erfolgt auch bei dieser Methode in Guanidiniumisothiocyanat, das sowohl die Zellen lysiert als auch freigesetzte RNasen inhibiert. Das Lysat wird durch die Zentrifugation wie folgt aufgetrennt:

Die Proteine bleiben im wäßrigen Überstand, die festen Bestandteile liegen in der Zwischenschicht von wäßriger Phase und CsCl-Lösung. Die doppelsträngige DNA sammelt sich etwa in der Mitte des CsCl-Gradienten, die einzelsträngige RNA dagegen am Boden des Zentrifugenröhrchens. Allerdings sedimentieren sehr kurze RNA-Moleküle wie tRNAs (70 – 90 Nukleotide), 5,8S- oder 5S-rRNA (ca. 120 bzw. 160 Nukleotide) nicht vollständig, sodaß es zu einer Anreicherung längerer RNA-Moleküle kommt. Die Größenverteilung der isolierten RNA entspricht in etwa der, die man bei der RNA-Isolierung mittels RNA-selektiver Membran des Rneasy Mini Kits erhält (s. 3.2.1.4).

Protokoll

Diese Methode nutzt die Fähigkeit von Membranen auf Silikat-Gel-Basis, Nukleinsäuren unter hohen Konzentrationen chaotroper Salze reversibel zu binden. Je nach Art der Silikatmembran und den Ionenbedingungen des verwendeten Puffers erfolgt eine selektive Bindung von RNA bzw. DNA.

Bei dem hier verwendeten Rneasy Mini Kit erfolgt die Isolierung und Reinigung der RNA mittels Zentrifugation über eine RNA-selektive Silikatmembran. Die Zellen werden in einem Guanidiniumisothiocyanat-Puffer aufgeschlossen, dem anschließend Ethanol zugegeben wird, um die entsprechenden Bedingungen für die RNA-Bindung an die Silikatmatrix zu schaffen. Das Lysat wird dann mittels Zentrifugation über die in einer Säule befindlichen Silikatmembran filtriert. Während die RNA dabei an die Silikatmatrix bindet, gelangen alle übrigen Zellbestandteile ins Filtrat und werden in den folgenden Waschschritten vollständig ausgewaschen. Die RNA wird anschließend mit Wasser oder einem „Niedrig-Salz-Puffer“ eluiert.

Bei dieser Methode werden allerdings nur RNA-Moleküle, die länger als 200 Basen lang sind, isoliert. Kleine RNAs wie tRNAs (70 – 90 Nukleotide), 5,8S- oder 5S-rRNA (ca. 120 bzw. 160 Nukleotide) binden unter den verwendeten Bedingungen nicht quantitativ. Da RNAs mit niedrigem Molekulargewicht etwa 15 - 20 % der Gesamt-RNA ausmachen, kommt es zu einer Anreicherung längerer RNA-Moleküle. Die Größenverteilung der isolierten RNA ist dabei mit der, die man durch Ultrazentrifugation über einen CsCl-Gradienten erhält, vergleichbar (s. 3.2.1.3).

Im folgenden ist das für den Vergleich der verschiedenen RNA-Isolierungstechniken (s.3.2.1) verwendete und dementsprechend modifizierte Protokoll für den RNeasy^® Mini Kit dargestellt.

Weitere Modifikationen dieses Verfahrens, die im Rahmen der Optimierung erarbeitet wurden, sind unter 3.2.2 dargestellt.

Protokoll

Aufbauend auf dem Vergleich der verschiedenen RNA-Isolierungsmethoden (s. 3.2.1) wurde das Protokoll des RNeasy-Mini-Kits, wie es unter 3.2.1.4aufgeführt ist, weiter verbessert. Bei allen anschließenden Versuchen erfolgte die RNA-Isolierung entsprechend diesem unten aufgeführten, optimierten Verfahren.

Die wichtigsten Änderungen betreffen die Menge des verwendeten Lysepuffers, das Abtrennen der freigesetzten Lipide und das Volumen, in dem die isolierte RNA eluiert wird. So hat es sich als günstig erwiesen, den RLT-Lyse-Puffer im Verhältnis 2 : 1 gegenüber dem Zellvolumen der Adipocyten einzusetzen (1 x 10⁶ Adipocyten entsprechen etwa 1 ml) und die dabei freigesetzten Lipide schon vor dem Scheren der DNA abzutrennen. Außerdem ist es vorteilhaft, die RNA nur in 30 µl RNase-freiem Wasser zu lösen, da die isolierte RNA dann in höherer Konzentration vorliegt. Dadurch kann auf das Eintrocknen der Proben vor der reversen Transkription (s. 3.5) bzw. auf die DNase-Behandlung (s. 3.4) verzichtet werden.

Eine weitere sehr günstige Modifikation ist die Verwendung des „RNase-free DNase-Kits“ (Fa. Qiagen). Er ermöglicht es, die DNase I-Behandlung zwischen den Waschschritten des Isolierungsprotokolls, während die RNA noch an die Membran der Säule gebunden ist, durchzuführen. Erfolgt die DNase I-Behandlung dagegen erst im Anschluß an die RNA-Isolierung, wird die DNase nur deaktiviert, verbleibt aber in der RNA-Lösung (s. dazu auch 3.4). Da dieser Kit jedoch anfangs nicht zur Verfügung stand, wurde nur bei einem Teil der Versuche (endogene Kontrollen (s.4.5.1), Vergleich der Expressionsstärke (s. 4.5.2), Dosis-Wirkungskurve (s. 4.6)) der „RNase-free DNase-Kit“ verwendet.

Nachfolgend ist das optimierte Verfahren der RNA-Isolierung kurz zusammengefaßt:

Protokoll

1. Adipocytenpellet (frisch oder gefroren) in RLT-Lyse-Puffer aufnehmen (doppelte Menge des Zellvolumens) und kurz vortexen.
2. Beides im 37°C-Wasserbad anwärmen und dabei immer wieder kräftig vortexen, bis sich das Zellpellet vollständig aufgelöst hat und eine Dispersion entstanden ist.
3. Lysat 5 min bei 2500 x g und 20°C zentrifugieren (Eppendorf Zentrifuge 5810 R mit Ausschwingrotor).
4. Den wäßrigen Unterstand mit Spritze und langer 20-G Kanüle (∅ 0,9 mm x 70 mm) abnehmen und in ein frisches Röhrchen überführen.
5. Lysat wiederholt (10 x) durch die Kanüle in die Spritze saugen, um die genomische DNA zu scheren.
6. Homogenat im Verhältnis 1 : 1 mit 70 %-igem Ethanol mischen und dann nach und nach auf die Säule auftragen (s. auch 3.2.1.4 Punkt 3 – 5).
7. Die an die Membran der Säule gebundene RNA entweder mit 700 µl RW 1-Puffer waschen oder in diesen Waschschritt die DNase I-Behandlung gemäß dem „RNase-free DNase-Kit“ (Fa. Qiagen) einschieben.
8. Anschließend 2 x mit 500 µl RPE Puffer waschen. Beim zweiten Mal jedoch die Probe nur kurz anzentrifugieren, den Unterstand abgießen und die Säule dann 4 min bei maximaler Geschwindigkeit zentrifugieren (Eppendorf Tischzentrifuge 5415 C), bis die Membran der Säule trocken ist.
9. 30 µl RNase-freies Wasser direkt auf die Membran geben und nach 1 - 2 min die gelöste RNA abzentrifugieren (20 - 30 sec bei 10 000 x g, Eppendorf Tischzentrifuge 5415 C).

Da die RNA die Grundlage für alle Untersuchungen zur Genexpression darstellt, sind Konzentration und Reinheit der RNA-Lösung sowie die Integrität der isolierten RNA von grundlegender Bedeutung.

Die Konzentrationsbestimmung der isolierten RNA erfolgt im UV-Spektrometer bei 260 nm, dem Absorptionsmaximum von Nukleinsäuren. Die optischen Dichte (OD) von 1 entspricht einer Konzentration von 50 µg / ml doppelsträngiger DNA bzw. einer Konzentration von 40 µg / ml einzelsträngiger DNA oder RNA. Unter Berücksichtigung einer eventuellen Verdünnung wurde die Konzentration der isolierten RNA wie folgt berechnet:

OD_260nm x 40 x Verdünnungsfaktor / 1000 = µg RNA / µl.

Zur Bestimmung der Reinheit wurde außerdem die optische Dichte (OD) bei 280 nm gemessen. Dort liegt das Absorptionsmaximum aromatischer Verbindungen (z. B. aromatische Aminosäuren, Phenol). Über den Quotienten der optischen Dichte von 260 nm und 280 nm (OD_260nm / OD_280nm) läßt sich eine Aussage über die Reinheit der RNA-Lösung machen. Optimal ist ein Quotient zwischen 1,9 und 2,0. Während kleinere Werte auf die Anwesenheit von Proteinen oder Kontaminationen mit Phenol hinweisen, zeigen Werte über 2,0 Salz- oder Nukleotidverunreinigungen aufgrund fortschreitender RNA-Degradierung durch RNasen an.

Aus diesem Grund erfolgt auch immer eine Überprüfung der Integrität der isolierten RNA mittels Gel-Elektrophorese. Dazu wurden 1 – 2  µl der RNA-Lösung mit 1 µl GLB-Puffer (10-fach, s. 2.7) gemischt, mit Wasser auf 10 µl aufgefüllt und auf einem nativen 1,5 %-igen TAE-Agarose-Gel (s. 2.7), (mit 0,07 µg / ml Ethidiumbromid) aufgetrennt. Die Qualität der RNA läßt sich unter UV-Licht-Bestrahlung (UV-Transluminator: 250 – 310 nm) an den zwei charakteristischen Banden der 28S und 18S rRNA abschätzen. Im Idealfall sollten Dicke und Intensität der 28S rRNA-Bande doppelt so groß sein wie die der 18S rRNA-Bande, andernfalls ist die RNA bereits teilweise degradiert. Eine Färbung im Bereich der Gelladetaschen weist darüber hinaus auf Kontaminationen mit genomischer DNA hin.

Es ist wichtig, sowohl für qualitative als auch für quantitative Untersuchungen der Genexpression mittels RT-PCR sicherzustellen, daß die verwendete RNA keine DNA-Kontaminationen enthält oder diese zumindest nicht amplifiziert werden können, da dies zu falsch-positiven Ergebnissen führt. Sofern es nicht möglich ist, Primer so zu wählen, daß sie auf einem Exon-Exon Übergang liegen und damit die Amplifikation genomischer DNA verhindern, wird in der Regel vor der reversen Transkription eine DNase I-Behandlung durchgeführt, wobei einzel- und doppelsträngige DNA in Oligo-Desoxyribonukleotide gespalten wird.

Dies hat jedoch zwei Nachteile: Zum einen bleiben der Puffer, die deaktivierte DNase und das EDTA in der Lösung und werden dadurch Teil der nachfolgenden Reaktionen (Reverse Transkription, PCR), was unter Umständen nachteilig sein kann. Zwar wäre es möglich, die RNA-Lösung durch eine anschließende Fällung zu reinigen, der Verlust bei geringen RNA-Mengen ist jedoch sehr hoch.

Zum anderen erfolgt die Konzentrationsbestimmung in diesem Fall vor der DNase-Behandlung, da dies hinterher aufgrund der geringen RNA-Menge mit den zur Verfügung stehenden Geräten nicht möglich ist. Dadurch fließt der DNA-Gehalt, der von Probe zu Probe unterschiedlich ist, in das Ergebnis mit ein, wodurch der RNA-Gehalt nach der DNase-Behandlung von Probe zu Probe etwas variiert.

Die hier verwendete DNase  I (Desoxiribonuclease I, Ampl. Grade) ist geeignet, um im Anschluß an die RNA-Isolierung Kontaminationen genomischer DNA aus der RNA-Lösung zu entfernen. Sie ist auf die Abwesenheit von RNase-Aktivität getestet und weist eine spezifische Aktivität von 10 000 U / mg auf.

Für die DNase I-Behandlung einer Probe wurden im allgemeinen 2 µg Gesamt-RNA verwendet. Das Volumen des Gesamtansatzes betrug 20 µl. War das benötigte Volumen der RNA-Lösung für 2 µg RNA größer als 16 µl, wurde das Volumen des Gesamtansatzes auf 25 µl erhöht und der Anteil an Puffer und DNase I entsprechend angepaßt. Wenn die RNA-Lösung jedoch sehr stark verdünnt war, wurde sie vorher im Vakuum getrocknet und die RNA in einem geringeren Volumen RNase-freiem Wassers gelöst, bevor die Reagenzien der DNase-Behandlung zugegeben wurden.

Protokoll

Die reverse Transkription (RT) ist der erste Schritt bei der Untersuchung der Genexpression mittels RT-PCR Technik. Dabei wird die isolierte RNA mit einer „Reversen Transkriptase“ in ihre komplementäre DNA-Sequenz (cDNA) konvertiert.

„Reverse Transkriptasen“ wie die MMLV-RT (für: Moloney Murine Leukaemia Virus) oder die AMV-RT (für: Avian Myeloblastosis Virus) sind DNA-Polymerasen, die RNA als Matrize verwenden. Das 3´-Ende eines Primers (Random Hexamer, Poly-(T)-Primer) liefert dabei den Startpunkt für die Synthese des cDNA-Stranges, wobei ein RNA-DNA-Hybrid entsteht. Dieser Schritt wird auch als Einzelstrang-Synthese bezeichnet, und in der anschließenden PCR-Amplifikation dient nur der cDNA-Strang als Matrize.

Verwendet wurde die Superskript RNase H, die ihre RNase H-Aktivität durch eine Punktmutation verloren hat und sich durch besondere Syntheseleistung auszeichnet. Für die reverse Transkription einer Probe wurden im allgemeinen 2 µg Gesamt-RNA eingesetzt. Das Volumen des Gesamtansatzes betrug 20 µl. War das Volumen der RNA-Lösung größer als 10 µl, z. B. durch eine vorangegangenen DNase I-Behandlung, wurde die RNA vor der reversen Transkription im Vakuum getrocknet und dann in einem geringeren Volumen RNase-freiem Wasser gelöst.

Protokoll

3.6.1  Prinzip der TaqMan-PCR

Diese von Lee et al.  119 1993 bei Applied Biosystems entwickelte Technik basiert auf der Anwendung der Polymerase Kettenreaktion (PCR) und auf dem Einsatz der 5´-3´-Exonuklease-Aktivität der Taq-Polymerase in Verbindung mit einer fluoreszenz-markierten Sonde. Bei der Sonde handelt es sich um ein sequenzspezifisches Oligonukleotid, das zwischen den beiden Primern an die Zielsequenz bindet und am 5´-Ende einen fluoreszierenden „Reporter“-Farbstoff (Fluoreszein-Derivat) trägt. Am 3´-Ende ist die Sonde mit einen „Quencher“-Farbstoff (Rhodamin-Derivat) markiert und darüber hinaus mit einem Phosphatrest blockiert, der eine Verlängerung des Sondenstrangs während der Extensionsphase verhindert.

Wird die intakte Sonde bei einer spezifischen Wellenlänge (488 nm) zur Fluoreszenz angeregt, so wird die Fluoreszenz des „Reporter“-Farbstoffs aufgrund der räumlichen Nähe zum „Quencher“ durch einen Fluoreszenz-Energietransfer unterdrückt, sodaß nur die Emission des „Quenchers“ meßbar ist. Während der PCR hybridisieren Primer und Sonde zunächst an den Matrizenstrang. In der Extensionsphase (Abb. 2 A) trifft die Taq-Polymerase dann auf die Sonde und beginnt sie vom Strang zu verdrängen. Dabei entsteht eine Y-förmige Sekundärstruktur (Abb. 2 B), wodurch die 5´ 3´-Exonuklease-Aktivität der Taq-Polymerase aktiviert und die Sonde geschnitten wird (Abb. 3 C). Freie, nicht-hybridisierte Sondenmoleküle bleiben dagegen intakt.

	Abbildung 3: Prinzip der TaqMan-PCR. A: Primer-Extension (R = Reporter, Q = Quencher), B: Ausbildung der Y-förmigen Sekundärstruktur, C: Sondenhydrolyse, D: Abschluß der Polymerisation.

Durch die Sondenhydrolyse wird die räumliche Nähe und damit auch der Fluoreszenz-Energietransfer zwischen „Reporter“ und „Quencher“ unterbrochen. „Reporter“ und „Quencher“ fluoreszieren nun in zwei getrennten Wellenlängenbereichen. Entsprechend der Akkumulation des PCR-Produktes steigt auch die Fluoreszenz des freigesetzten „Reporters“ mit jedem Amplifikationszyklus an. Dabei führt weder die unspezifische Bindung der Primer noch die der Sonde zu einem Anstieg der „Reporter“-Fluoreszenz, da die Sondenhydrolyse nur dann erfolgt, wenn zwischen den Primern auch die Sonde bindet bzw. die Sequenz an den die Sonde bindet, während der PCR amplifiziert wird.

Mit Hilfe des GenAmp^® 5700 Sequence Detection Systems von PE Biosystems wird der Anstieg des „Reporter“-Fluoreszensignals gemessen. Dadurch ist es möglich, den gesamten Verlauf der PCR-Reaktion darzustellen. Auf diese Weise kann die Quantifizierung des Fluoreszenzsignals verschiedener Proben unabhängig von ihrer Ausgangskonzentration zu einem Zeitpunkt erfolgen, an dem sie sich alle in der exponentiellen Phase der Amplifikation befinden.

Für die TaqMan-PCR wurde der „TaqMan^® Universal PCR Master Mix“ von PE Biosystems verwendet. Dieser bereits optimierter Puffer enthält alle notwendigen Substanzen außer den Primern, der Sonde und der zu untersuchenden cDNA. An Stelle von dTTP wird dUTP eingesetzt. Außerdem sind noch das Enzym AmpErase UNG und der Referenzfarbstoff ROX (6-Carboxy-X-rhodamin) enthalten. Das Enzym verhindert die Reamplifikation von Kontaminationen aus vorangegangenen PCRs, indem es die Uracil-Reste aus doppelsträngiger DNA entfernt. ROX dient als interne, passive Referenz zur Normalisierung des „Reporter“-Signals während der Datenaufnahme. Dadurch können Fluoreszenzschwankungen aufgrund von Konzentrations- oder Volumenunterschieden korrigiert werden.

Unter Punkt 2.4 sind die Sequenzen der für die TaqMan Real Time PCR verwendeten Primer und Sonden angegeben. Sie wurden mit der ABIPRISM^® Primer Express™ Software für die TaqMan-PCR unter Verwendung der voreingestellten Parameter ausgewählt.

Tabelle 2: Endkonzentration der für die TaqMan-Real-Time-PCR verwendeten Primer und Sonden, sowie die jeweilige Länge der amplifizierten Sequenz.

Primer und Sonde (Sequenzen s. 2.4) sind dabei dicht hintereinander, mit nur wenigen Basen Zwischenraum, angeordnet, wodurch sehr kurze Amplifikate (60 – 100 bp) entstehen. Dadurch wird eine hohe Amplifikationseffizienz erzielt. Zur Optimierung der PCR wurden verschiedene Primer- (50 – 900 nM) und Sondenkonzentrationen (50 – 300 nM) getestet. Die optimalen Endkonzentrationen, bei denen ein möglichst niedriger C_T-Wert und gleichzeitig ein möglichst hoher Rn-Wert erreicht wird, sind in Tabelle 2 aufgeführt.

Als endogene Kontrolle wurde die GAPDH des „Human-GAPDH-Kits“ (huGAPDH) der Firma PE Biosystems verwendet. Sie wurde den Herstellerangaben entsprechend eingesetzt. Für die GAPDH-Amplifikation wurden pro Probe 10 ng RNA (konvertiert in cDNA) eingesetzt.

Die PCR erfolgte in 25 µl-Ansätzen, wobei für die unbekannten Proben Vierfach- und für die Eichreihe jeweils Dreifachansätze amplifiziert wurden. Da die relative Quantifizierung über Eichkurven erfolgte, wird für beide Gene (Zielgen und endogene Kontrolle) je eine Eichreihe angelegt.

Es wurde eine 2-Schritt-PCR nach folgendem Temperaturprofil durchgeführt:

Eine Extensionstemperatur unter 72°C begünstigt die Bindung der Sonde, sodaß ihre Hydrolyse durch die 5´-3´-Exonuklease-Aktivität der AmpliTaq Gold^® DNA-Polymerase effizienter verläuft.

In der frühen Phase der PCR ändert sich das Fluoreszenzsignal kaum. In diesem Bereich wird das Hintergrundsignal ermittelt. Als Maß für die Fluoreszenz dient der ΔR_n-Wert, der aus dem normalisierten „Reporter“-Signal (R_n) abzüglich des Hintergrundsignals berechnet wird. Der R_n-Wert entspricht dabei dem Quotienten der Emissionsintensität des „Reporter“-Farbstoffs dividiert durch die Emissionsintensität des Referenzfarbstoffes ROX. Die Normalisierung durch den Referenzfarbstoff dient dem Ausgleich unspezifischer Schwankungen, wie z.B. Konzentrationsschwankungen aufgrund von Volumenänderungen (z. B. Pipettierfehler).

	Abbildung 4: Schema eines TaqMan-Amplifikationsplot.

Die Quantifizierung der Genexpression erfolgt über den C_T-Wert (threshold cycle), der die Zyklenzahl ausdrückt, an dem die „Reporter“-Fluoreszenz erstmals einen bestimmten Schwellenwert (engl. threshold) oberhalb der Basislinie erreicht. Der Schwellenwert wird so gewählt, daß er die Amplifikationskurven der zu vergleichenden Proben in der exponentiellen Phase schneidet. Je höher die Ausgangskonzentration der Zielsequenz zu Beginn der PCR ist, desto eher wird der Schwellenwert erreicht und desto niedriger ist der C_T-Wert. In der exponentiellen Phase der PCR und unter Annahme einer 100 %-igen Effizienz sollte bei einer Verdoppelung der Startkopienzahl der C_T-Wert ein Zyklus niedriger sein.

Im Gegensatz zur „absoluten Quantifizierung“, bei der die Startkopienzahl des Standards bekannt ist, wird bei dieser Form der Quantifizierung die Expression der Zielsequenz relativ zu einem Kalibrator (Standardprobenmaterial / -gewebe) bestimmt. Dazu wird für die zu vergleichenden Proben die Ausgangsmenge der Zielsequenz aus einer Eichkurve bestimmt und dann durch die Ausgangsmenge des Kalibrators dividiert. Der Kalibrator wird dadurch zur „1 x Probe“, und die Expression der unbekannten Proben kann als n-facher Unterschied relativ zum Kalibrator angegeben werden.

Bei einer Quantifizierung, die über eine endogene Kontrolle normalisiert werden soll, um z. B. Konzentrationsunterschiede aufgrund von Pipettier- und Verdünnungsfehlern (z. B. bei der vorangegangenen „Reversen Transkription“) zwischen den Proben auszugleichen, kann der Zielsequenzwert einer Probe direkt durch den entsprechenden Wert der endogenen Referenz geteilt werden, sofern die Effizienz beider Amplifikationsreaktionen gleich ist. Weichen die Amplifikationseffizienzen jedoch voneinander ab, führt dies dazu, daß der bei Normalisierung gebildete Quotient mit abnehmender bzw. zunehmender Gesamt-cDNA-Menge variiert, obwohl das Verhältnis beider Gene in einer Probe unabhängig von der jeweiligen Gesamtmenge immer gleich ist. Um diesen PCR-bedingten Fehler auszugleichen, werden sowohl für die Zielsequenz (z. B. GAPDH) als auch für die endogene Referenz Eichkurven erstellt. Über die Formel der Eichgeraden (1) wird dann für jede einzelne Probe die Ausgangskonzentration der Zielsequenz und der endogenen Kontrolle berechnet (2). Die Normalisierung erfolgt durch Division der Zielsequenzwerte durch die Werte der endogenen Referenz, wobei eine einheitslose Zahl entsteht (3).

Da die Einheit wegfällt, benötigt man für die Eichkurven nur die genauen Verdünnungsstufen, nicht jedoch die genau Startkopienzahl. Daher kann für eine relative Quantifizierung eine beliebige cDNA-Lösung, in der die Zielsequenz enthalten ist, als Standard verwendet werden. Wenn Proben verschiedener PCR-Läufe miteinander verglichen werden sollen, muß jedoch die gleiche cDNA-Stammlösung für alle Eichkurven eingesetzt werden, um vergleichbare Daten zu erhalten.

Nach der Normalisierung der Werte wird die Expression des Kalibrators mit 1 gleichgesetzt. Indem nun die normalisierten Werte der einzelnen Proben durch den normalisierten Wert des Kalibrators geteilt werden, erhält man das Expressionsmuster der Zielsequenz. Im folgenden sind die zur relativen Quantifizierung verwendeten Formeln dargestellt:

Zur Erstellung der Eichkurve wurde der C_T-Wert (y) über den Logarithmus der Ausgangskonzentration (x = log ng Gesamt-RNA) aufgetragen. Für die Eichkurve ergibt sich daher die folgende Formel:

wobei m die Steigung der Geraden und b der Schnittpunkt der Geraden mit der y-Achse ist.

Die Ausgangsmenge der Zielsequenz bzw. der endogenen Referenz wird für jede Probe wie folgt berechnet:

Der normalisierte Wert der Zielsequenz einer Probe ergibt sich aus dem Mittelwert der Zielsequenz dividiert durch den entsprechenden Mittelwert der endogenen Kontrolle :

Die Standardabweichung des normalisierten Wertes wird über folgende Formeln berechnet:

Die Quantifizierung relativ zum Kalibrator erfolgt durch Division der normalisierten Probenwerte durch den normalisierten Kalibratorwert:

Die Standardabweichung der relativen Werte wird berechnet nach:

Für jede Art der Quantifizierung wird eine Bezugsgröße benötigt, durch die sich Unterschiede zwischen den einzelnen Proben (z. B. unterschiedliche Materialmengen, schwankende RT-Effizienz usw.) ausgleichen lassen. Zur Untersuchung der Genexpression werden dazu häufig endogene Kontrollen eingesetzt. Das sind Gene, die mit dem Zielgen co-exprimiert werden, aber unter den gegebenen Versuchsbedingungen selbst nicht transkriptionell reguliert werden. In der Regel werden dazu sogenannte „house-keeping“-Gene verwendet.

Jedoch gibt es in der Literatur Hinweise darauf, daß auch die relativ häufig verwendeten Gene GAPDH, ß-Actin bzw. 18S rRNA unter bestimmten Umständen als endogene Kontrollen ungeeignet sind.  120 - 122

Um eine endogene Kontrolle zu finden, die bei Versuchen mit humanen Adipocyten für ein möglichst weites Spektrum an unterschiedlichen Versuchsbedingungen (z. B. hormonelle Stimulation, Adipocytendifferenzierung) geeignet ist, wurden mit Hilfe der „Human Endogenous Control Plates“ (Fa. PE Biosystems) die folgenden 11 gebräuchlichen „house-keeping“-Gene (s. u.) getestet.

Tabelle 3: Endogene Kontrollen der „Human Endogenous Control Plates“ (Fa. PE Biosystems)

Es wurde dazu die Wirkung von sechs verschiedenen Hormonen (100 µM Hydrocortison, 1 µM Insulin, 1 µM 17-β-Estradiol, 1 µM 3,3´-5-Triiodo-L-Thyronin (T₃;), 10 µM Angiotensin II und 100 µM TNFα sowie der Einfluß der Adipocytendifferenzierung auf die Expression der 11 verschiedenen endogenen Kontrollgene untersucht. Zusätzlich dazu wird eine interne Positivkontrolle (IPC), die der Detektion von eventuell vorhandenen PCR-Inhibitoren dient, amplifiziert. Es handelt sich dabei um ein bereits vorgelegtes künstliches „Template“ definierterKonzentration. In Anwesenheit von PCR-Inhibitoren weicht der C_T-Wert einer Probe deutlich von den übrigen Proben ab.

Da pro Platte nur vier verschiedene Proben aufgetragen werden können, wurden die zu untersuchenden Proben wie folgt aufgeteilt und die Expression untereinander verglichen:

Tabelle 4: Untersuchte Stimuli auf die Genexpression der verschiedenen endogenen Kontrollen.

Protokoll

1. Ausdifferenzierte humane Adipocyten isolieren (s. 3.1.1), kultivieren (s. 3.1.2) und mit den oben genannten Hormonen über 12 h behandeln (s. 3.9).
2. RNA isolieren (s. 3.2.2) und je 2 µg in cDNA umschreiben (s. 3.5).
3. Reaktionsansatz und PCR entsprechend dem Protokoll des Herstellers.

Die Amplifikation erfolgt in einer „96-well“-Platte, auf der Primer und Sonden für alle Amplifikationen (8 „wells“ pro Gen) bereits vorgelegt worden sind. Die „wells“ der Positivkontrolle (IPC) enthalten zusätzlich das entsprechende „Template“. Der Reaktionsmix mit der cDNA des Kalibrators bzw. einer der drei Proben wird auf je zwei Reihen (24 „wells“) aufgeteilt, so daß pro Gen und Probe Doppelansätze amplifiziert werden. Jeder Reaktionsansatz enthielt 2 µg Gesamt-RNA (konvertiert in cDNA), das sind ca. 75 ng pro „well“.

Der Vergleich der Genexpression zwischen Kalibrator und Probe erfolgt über die Berechnung des ΔC_T-Wertes (s. Abbildung 4) der Probe. Dieser wird durch Subtraktion wie folgt bestimmt:

ΔC_{T (Probe)} = Mittelwert-C_{T (Kalibrator)} - Mittelwert-C_{T (Probe)}

Das Ergebnis ist ein ΔC_T-Wert, der größer oder kleiner ist als der des Kalibrators. Proben mit einem positiven ΔC_T-Wert haben eine höhere Ausgangskonzentration als der Kalibrator, während Proben mit einem negativen ΔC_T-Wert eine niedrigere Ausgangskonzentration besitzen. Dabei entspricht eine C_T-Wert Differenz von einem Zyklus (ΔC_T = ± 1) einem zweifachen Unterschied in der Anfangskonzentration (siehe dazu auch 3.5.5). Die relative Veränderung der Genexpression (x_rel) gegenüber dem Kalibrator läßt sich aus folgender Formel bestimmen:

So entsprechen dann z. B. Werte von 2 oder 4 einer Verdopplung bzw. Vervierfachung der Expression gegenüber dem Kalibrator, während Werte um 0,5 eine Halbierung und um 0,25 eine Verringerung auf 25 % Genexpression bedeuten.

Zur Untersuchung des hormonellen Einflusses auf die Regulation der Genexpression ausdifferenzierter Adipocyten wurden die Zellen mit jeder der folgenden Substanzen behandelt: Hydrocortison (100 µM), Insulin (1 µM), 17-β-Estradiol (1 µM), 3,3´-5-Triiodo-L-Thyronin (T₃; 1 µM) und Angiotensin II (1 µM). Als Lösungsmittel diente Wasser oder 98 %-iger unvergällter Ethanol (Hydrocortison, 17-β-Estradiol)

Um den zeitlichen Verlauf im Falle einer Veränderung der Genexpression verfolgen zu können, wurden Zellen aus zwei parallelen Ansätzen nach 0, 4, 6, 8, 10, 12, 14 und 24 Stunden eingefroren. Die Adipocyten des einen Ansatzes blieben unbehandelt, die anderen erhielten eine der oben aufgeführten Substanzen bzw. Ethanol (Lösungsmittelkontrolle). Anschließend wurde die Gesamt-RNA (s. 3.2.2) isoliert und ihre Qualität überprüft (s. 3.3). Zur Quantifizierung der Genexpression wurden ein Teil der RNA in cDNA umgeschrieben (s. 3.5) und im GeneAmp 5700 mit der TaqMan-Real-Time-PCR Technik untersucht (s. 3.6).

Insgesamt wurde für jedes der drei ausgewählten Gene (AGT, ACE und AGTR1) die Genexpression unbehandelter Adipocyten nach 0, 4, 8, 10, 12 und 24 h quantifiziert und mit der Expression behandelter Zellen (jeweils eine der fünf oben aufgeführten Substanzen oder Ethanol) verglichen. Da nur sechs Proben parallel quantifiziert werden können, wurden die 6- und 14-Stunden-Proben nicht verwendet. Darüber hinaus wurde für die Gene REN und AGTR2 die Veränderung der Genexpression nach 24-stündiger Stimulation mit oben genannten Substanzen bestimmt.

Um die Veränderung der Genexpression in Abhängigkeit von der Dosis (Dosis-Wirkungskurve) verfolgen zu können, wurden Adipocyten mit verschiedenen Konzentrationen (1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 µM, 10 µM, 100 µM) der jeweiligen Substanz stimuliert und mit unstimulierten Zellen verglichen. Die Inkubationsdauer entsprach dabei dem Zeitraum, bei dem sich im Zeitverlauf die größte Änderung gezeigt hatte.

Protokoll

1. Beginn des Experimentes 12 bis 16 Stunden nach der Isolierung (s. 3.1.2).
2. Adipocytenkultur 5 min bei 200 x g abzentrifugieren (Eppendorf 5810 R mit Ausschwingrotor).
3. Ölschicht auf den Zellen und Medienunterstand absaugen.
4. Adipocyten in frischem Adipocytenmedium (s. 2.7) durch gleichmäßiges, nicht zu starkes Rühren auf einem Magnetrührer resuspendieren (ca. 1,5 Vol. Zellen auf 1 Vol. Medium).
5. Aliquots abnehmen und Zellzahl bestimmen (s. 3.1.3)
6. Die Inkubation erfolgte in 50 ml-Gewebekulturflaschen mit mindestens 2 x 10⁶ Zellen (dies entspricht ca. 1 ml Adipocyten ohne Medium) und in einem Gesamtvolumen von 9 ml pro Ansatz.
7. Zellsuspension dementsprechend auf die Gewebekulturflaschen verteilen und mit Adipocytenmedium auf 8,5 ml auffüllen.
8. 2 Stunden Vorinkubation im Brutschrank (s. 3.1.2), damit sich die Adipocyten vom Streß des Rührens und Aliquotierens erholen können.
9. Anschließend pro Ansatz 0,5 ml Adipocytenmedium mit bzw. ohne stimulierende Substanz zugeben.
10. Nach Ablauf der Inkubationszeit Adipocyten abzentrifugieren (s. o.).
11. Medium unter der Zellschicht ggf. mit einer Spritze vorsichtig absaugen und in flüssigem Stickstoff schockfrieren, oder Medium verwerfen.
12. Adipocyten in 5 ml PBS-Puffer resuspendieren, um das Medium auszuwaschen (kann die RNA-Isolation stören) und nochmals zentrifugieren (s. o.).
13. Ölschicht auf den Zellen ggf. entfernen und Unterstand absaugen.
14. Adipocyten in flüssigem Stickstoff schockfrieren und bis zur RNA-Isolierung bei - 80°C lagern.
15. Qualitätskontrolle s. 3.3.
16. 2 µg der RNA-Lösung für den DNase-Verdau (s. 3.4) einsetzen und anschließend eine reverse Transkription (s. 3.5) durchführen.
17. TaqMan-Real-Time-PCR für die Gene AGT, ACE und AGTR1 (unbehandelte und behandelte Proben nach 0, 4, 8, 10, 12 und 24 h) bzw. REN und AGTR2 (nur 24 h-Proben) sowie für die Proben der Dosis-Wirkungsversuche.

Mittels indirekter Immunfluoreszenz in Verbindung mit der konfokalen Mikroskopie ist es u. a. möglich, an fixierten Zellen zu untersuchen, ob die hormonelle Stimulation der Genexpression auch zu einer Veränderung der Proteinexpression führt. Der immunologische Nachweis des Proteins erfolgt über zwei Antikörper. Der erste Antikörper bindet spezifisch an das antigene Epitop des nachzuweisenden Proteins. Der sekundäre Antikörper erkennt dagegen konstante Bereiche des ersten Antikörpers und ist mit einem Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt.

Die konfokale Mikroskopie  123 beruht auf dem von Marvin Minsky entwickelten und 1961 patentierten „zweifach fokussierendem Objekt-Raster-Mikroskop“. Im Gegensatz zur normalen Auflichtmikroskopie, bei der das gesamte Präparat gleichmäßig ausgeleuchtet wird, wird bei einem konfokalen Mikroskop nur ein winziger Fleck hell erleuchtet, um das Entstehen von Streulicht weitgehend zu vermindern. Da aber die Bereiche ober- und unterhalb der Zielebene ebenfalls Licht direkt zurückwerfen oder diffus streuen, wird das reflektierte Licht durch eine auf die Zielebene abgestimmte Lochblende auf den Detektor geleitet, wodurch die meisten der nicht aus der Schärfenebene kommenden Strahlen abgeschirmt werden und eine hohe Tiefenschärfe erzielt wird (s. Abb. 5). Das Abtasten des Objektes im Rasterverfahren ermöglicht schließlich die Wiedergabe einer kompletten Schnittebene.

Das hier verwendete Gerät MCR 1024 der Fa. Bio-Rad verfügt über einen Argon-Crypton-Laser, der Licht der Wellenlängen 488 nm, 568 nm und 643 nm emittiert. Zum Nachweis des Angiotensin II-Rezeptors Typ 1 wurde der Antikörper AT₁ (N-10) der Fa. Santa Cruz verwendet, der an die Aminosäuren 15 – 24 des aminoterminalen Endes des humanen Angiotensin II-Rezeptors Typ 1 bindet und keine Kreuzreaktivität mit dem Angiotensin II-Rezeptor Typ 2 aufweist. Die Anregung des hier eingesetzten Cy-2-konjugierte Sekundärantikörpers (Fa. Dianova) erfolgte bei einer Wellenlänge von 488 nm. Die Intensität des emittierten Lichts (522 nm) wird dann vom Bildverarbeitungssystem des Konfokalmikroskopes in eine Farbskala übertragen, die von schwarz (Intensität = 0), über blau (niedrige Intensität), grün, gelb bis rot (hohe Intensität) reicht. Zur Quantifizierung der Rezeptorexpression wurden mit Hilfe der Bildverarbeitungssoftware „MCR 1024 Laser Scanning Confocal Imaging Software“ (Fa. Bio-Rad) die Immunfluoreszenzintensitäten von jeweils 20 Adipocyten pro Gruppe bestimmt und miteinander verglichen.

	Abbildung 5: Prinzip der konfokalen Mikroskopie.

Protokoll

a) Fixierung:

1. Stimulation der Adipocyten wie unter 3.8 beschrieben über einen Zeitraum von 1 bzw. 3 Tagen.
2. Vor Entnahme der Zellen eine 4 %-ige Paraformaldehyd-Lösung frisch ansetzen. Dazu Paraformaldehyd mit PBS mischen, im Wasserbad auf ca. 90°C erhitzen, bis es sich löst und auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
3. Adipocytenkultur einmal in 5 ml PBS waschen (s. 3.8) und 300 µl-Aliquots der Suspension in die Deckglaskammern überführen (je Zeitwert zwei Aliquots der stimulierten bzw. unstimulierten Adipocyten sowie zusätzlich zwei Aliquots der unstimulierten Adipocyten (24 h) als Negativkontrolle)
4. In der Deckglaskammer den PBS-Unterstand vorsichtig entfernen und die Zellen in der frisch angesetzten 4 %-igen Paraformaldehyd-Lösung 10 min fixieren.
5. Anschließend den Paraformaldehyd-Unterstand wieder abpipettieren und die Adipocyten erneut in PBS waschen.
6. Nach dem Entfernen des PBS die Zellen in eiskaltem 80 %-igen Methanol resuspendieren und darin 20 min bei -20°C inkubieren.
7. Nachdem der Methanol-Unterstand wieder vorsichtig entfernt wurde, die Präparate kurze Zeit lufttrocknen und dann bei -20°C lagern.

b) Immunfluoreszenz

1. Fixierte Adipocyten 1 h mit einer 1,5 %-igen, frisch angesetzten BSA-Lösung bei Raumtemperatur inkubieren, um unspezifische Bindungsstellen zu blockieren und anschließend die Zellen mit PBS waschen.
2. Adipocyten über Nacht bei 4°C mit dem Primärantikörper (AT₁ (N-10), 1 µg / µl) inkubieren und erneut mit PBS waschen.
3. Zellen dann 1 ½ h bei Raumtemperatur mit dem Cy-2-konjugierten Sekundärantikörper (1 : 180 verdünnt) inkubieren und danach wieder mit PBS waschen.
4. Adipocyten mit „Aqua-Poly / Mount“ eindecken und die Präparate über Nacht aushärten lassen.
5. Auswertung der Präparate mittels konfokaler Mikroskopie und Speicherung der Bilder von 20 Zellen zur Bestimmung der Fluoreszenzintensitäten.
6. Zur Quantifizierung der Rezeptorexpression wird mit Hilfe der Bildverarbeitungssoftware die Fluoreszenzintensität pro Fläche von 20 Adipocyten pro Gruppe bestimmt.

Die Berechnungen der Ergebnisse von Zellzahlbestimmung und TaqMan-RT-PCR erfolgten in EXCEL 7.0 (Microsoft). Die statistische Auswertung erfolgte mit dem Softwarepaket SPSS für Windows, Version 9.0. Alle in die Auswertung einbezogenen Variablen waren normalverteilt (Kolmogorov-Smirnov-Test), sodaß die Angaben stets als Mittelwerte ± Standardabweichung erfolgen. Im Experiment zur Zellzahlbestimmung wurden die Ergebnisse der einzelnen Verdünnungen zur Berechnung des Korrelationskoeffizienten nach Pearson und zur Berechnung der Regressionsgeraden verwendet. Die Intergruppenvergleiche erfolgten mittels einfaktorieller ANOVA und anschließendem multiplem t-Test für mehr als zwei unabhängige Stichproben nach Bonferroni. Als signifikant wurde bei allen Tests ein p < 0,05 angesehen. Wenn keine p-Werte angegeben werden, bestehen keine Unterschiede zwischen den Gruppen.