Ergebnisse

4.1  Bestimmung der Zellzahl in Adipocytensuspensionskulturen mit dem R/S 1000

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Mit der modifizierten Form des R/S 1000, welches urspünglich zur halbautomatischen Bestimmung von Urinsediment konzipiert wurde, gelang es, eine einfach reproduzierbare Methode zur Bestimmung der Zellzahl ausdifferenzierter Adipocyten in Suspensionskulturen zu entwickeln.

Abbildung 6: Zellsuspension humaner Adipocyten (1,1 x 105 Zellen / ml) verteilt über zwei Gitter der Durchflußzählkammer des R/S 1000. Methylenblau-Färbung, 40-fache Vergrößerung.

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Abbildung 6 zeigt einen Ausschnitt der Durchflußzählkammer mit zwei der vier Zählgitter während eines Zählvorganges, bei dem Adipocyten unterschiedlicher Größe gleichmäßig in der Kammer und über die Gitter verteilt sind. Anhand der Seitenlänge eines Kästchens (283 µm) läßt sich dabei auch die besondere Größe mancher Adipocyten abschätzen. Obwohl die mit Methylenblau gefärbten Zellkerne bei dieser Vergrößerung nicht genau zu erkennen sind, lassen sich Adipocyten eindeutig von Fetttropfen zu unterscheiden (z. B. rechtes Gitter, fünfte Reihe, viertes Kästchen). Die Zellzahl variiert zwischen den insgesamt vier Gittern nur gering. Der Fehler liegt bei etwa 7 %. Dies zeigt, daß die Zellen während des Einsaugens in die Durchflußkammer suspendiert bleiben, was bei Verwendung einer Pipette nicht der Fall war. Eine Zelldichte von 40 bis 80 Zellen pro Gitter ließ sich leicht und schnell auszählen. Insgesamt wurden pro Durchgang dazu nicht mehr als 3 Minuten benötigt. Eine geringere Zellzahl zeigte häufig größere Unterschiede in der Verteilung, sowohl über die Gitter (> 10 %), als auch bei wiederholten Zählungen (> 20 %). Dagegen ließen sich mehr als 200 Zellen pro Gitter schlecht zählen, da die Zellen dann sehr dicht und z. T. übereinander lagen.

Die Reinigung des Apparates mit isotonischer Kochsalzlösung zwischen den einzelnen Durchgängen ist einfach und schnell durchzuführen. Außerdem blockiert eine Sicherheitsschaltung das Ansaugen eines weiteren Aliquots aus der Zellsuspension solange, bis die Zählkammer mindestens einmal mit der Reinigungslösung durchgespült worden ist. Dies verhindert, daß Zellen des vorangegangenen Durchgangs mitgezählt werden. Das vom Hersteller mitgelieferte Reinigungsenzym (Urizym®) ist besonders wirksam bei der Entfernung von Lipidresten aus der Kammer und den Zuleitungsschläuchen, was mit der isotonischen Kochsalzlösung allein nicht immer gelang. An Stelle der Zellsuspension in die Zählkammer eingesaugt, ließen sich mit der „Urizym“-Lösung auch gelegentlich anhaftende Adipocyten ohne lange Einwirkzeit (max. 30 sec) entfernen, sodaß bei jedem Zähldurchgang stets eine saubere und zellfreie Durchflußkammer vorlag.

Abbildung 7: Zellzahl in Abhängigkeit von der Verdünnung. Angegeben sind für drei unabhängige Experimente Mittelwerte ± Standardabweichung; n = 6 bzw. n = 3 (*); die Korrelationskoeffizienten (nach Pearson) sind R = 1,000 (a, b) bzw. R = 0,998 (c), das Bestimmtheitsmaß der Regressiongeraden R 2 = 0,999 (a), R 2 = 0,997 (b) bzw. R 2 = 0,996 (c) und die Signifikanzniveaus p < 0,001 (a, b) bzw. p = 0,002 (c)

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Abbildung 7 zeigt die Zellzahlbestimmung einer Adipocytensuspension in Abhängigkeit von ihrer Verdünnung für drei unabhängige Versuche mit unterschiedlicher Ausgangszellzahl, wobei jede Zählung sechsmal wiederholt wurde. Bei allen drei Versuchen sind die Abweichungen der Mittelwerte von den Regressionsgeraden sehr gering. So liegen die Korrelationskoeffizienten (berechnet nach Pearson) bei 0,998 bzw. 1,000 mit einem Signifikanzniveau von mindestens 0,002. Die Intraassay-Variabilität, ermittelt aus sechs aufeinanderfolgenden Zählungen einer Probe, liegt bei den hier dargestellten Versuchen durchschnittlich bei 15 %. Sie ist jedoch stark von der Verdünnungsstufe und der Homogenität der Adipocytensuspension abhängig und steigt mit zunehmender Verdünnung an. Die Interassay-Variabilität liegt mit 16 % in der gleichen Größenordnung und hängt ebenfalls entscheidend von der Homogenität der Adipocytensuspension ab. So wird durch kontinuierliches Rühren (Magnetrührer) in einem schmalen Gefäß mit ebenem Boden eine gleichmäßigere Suspension erreicht als durch Verwendung eines Vortexgerätes. Die Intraassay-Variabilität lag hier bei 11 % (Magnetrührer) gegenüber 18 % (Vortexer).

4.2 Bestimmung der Vitalität ausdifferenzierter Adipocyten in einer Suspensionskultur

Die Kernfärbung mittels Acridinorange ist eine gut geeignete Methode zur Bestimmung der Vitalität bei ausdifferenzierten Adipocyten, da sie einfach und mit geringem Zeitaufwand (ca. 30 min) durchzuführen ist. Wie die nachfolgende Abbildung zeigt, leuchten die diskusförmigen Zellkerne der mit Acridinorange gefärbten Adipocyten unter Blauanregung grün bis orangerot. Die Färbung der Kerne ist selbst dann gut zu erkennen, wenn die Kerne vom Betrachter aus gesehen, auf oder unter der großen Lipidvakuole liegen (z. B. Abb. 8: grüner Kern unten links [A]; oder orangefarbene Kerne obere Mitte [B] bzw. der beiden großen Zellen unten [C]).

Um den kontinuierlichen Farbübergang vom Grün vitaler Kerne über das Gelb und Orange absterbender Zellen bis zum Rot der Zellkerne toter Adipocyten zu demonstrieren, wurden die Zellen erst ca. 2 Stunden nach Entnahme aus dem Brutschrank und der Färbung fotografiert. Daher ist hier der Anteil der gelb bis orangefarbenen Zellkerne wesentlich höher als bei frisch entnommenen Zellen und nicht repräsentativ für die Vitalität der in den Experimenten eingesetzten Adipocytenkulturen.

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Abbildung 8: Vitalfärbung ausdifferenzierter Adipocyten mit Acridinorange. A: vitale Adipocyten mit grünen Zellkernen; B: Adipocyten mit nachlassender Vitalität (Zellkerne gelb-orange); C: Absterbende Adipocyten mit orange bis roten Zellkernen. 20-fache Vergrößerung.

Die Adipocyten in Abbildung 8 A sind vital, ihre Zellkerne leuchten hellgrün. Die Vitalität der Zellen im oberen Teil der Abbildung 8 B (oben) läßt dagegen bereits nach (gelb Kerne oben), während im unteren Teil bereits zwei absterbende Zellen mit orangefarbenen Zellkernen zu erkennen sind. In Abbildung 8 C ist die Vitalität dagegen nur noch sehr gering. Neben einer Zelle mit nachlassender Vitalität (gelber Kern, ganz unten) und zwei absterbenden Adipocyten (rechts und links darüber), ist hier auch der leuchtend rote Zellkern einer toten Zelle zu erkennen (oberste Zelle). Bemerkenswert ist auch die Beobachtung vereinzelter „zelloser“ Zellkerne (orangefarbener „Kern“ links oben [B] bzw. gelber „Kern“ Mitte links [C]). Die Ursache dafür ist wahrscheinlich eine starke mechanische Beanspruchung während des Mikroskopierens oder beim Auflegen des Deckglases, die zur Auflösung von Zellwand und Vakuole führt. Dafür spricht auch, daß die beobachten „zellosen“ Kerne nicht nur orange und rot, sondern gelegentlich auch grün waren.

Zur Bestimmung der Vitalitätsrate der in den Experimenten verwendeten Kulturen wurden jeweils dreimal 200 der gefärbten Zellen mit dem R/S 1000 gezählt und der Anteil vitaler Zellen berechnet. Der Mittelwert aus drei Zählungen reichte in der Regel aus, um die Vitalitätsrate einer Adipocytensuspension verläßlich zu ermitteln. Der Fehler lag dabei unter 5 %. Die Ergebnisse unterscheiden sich von den hier gezeigten Bildern insofern, als daß die Zellkerne fast ausschließlich grün und die Kerne der wenigen nicht vitalen Zellen orange oder rot waren. Gelbe oder gelborange Kerne wurden kaum beobachtet. Auch „zellose“ Kerne traten sehr selten auf, was auf eine insgesamt hohe Vitalität der Primärkulturen hinweist.

4.3 Überprüfung der Isolierungs- und Kultivierungsbedingungen

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Die Zellzahlbestimmung im Anschluß an die Adipocytenisolierung (s. 3.1) ergab, daß pro Gramm Fettgewebe durchschnittlich 3,8 ± 0,7 x 105 Zellen isoliert wurden. Die Ausbeute schwankte um etwa 20 %, wobei zu bedenken ist, daß das untersuchte Fettgewebe von Patientinnen unterschiedlichsten Alters und Körpergewichtes stammt. Insbesondere der Anteil und die Festigkeit des Bindegewebes beeinflußten das Ergebnis der Isolation deutlich. Eine direkte Beziehung der Zellzahl zu Alter und Gewicht konnte nicht beobachtet werden, aber in der Regel waren Anteil und Festigkeit des Bindegewebes bei älteren und adipösen Patientinnen verringert.

Im Verlauf der Kultivierung nahm die Zellzahl erwartungsgemäß ab (s. 3.1.5). In den ersten 12 – 16 Stunden nach der Isolierung war der Verlust an Adipocyten mit über 30 % am größten. In den folgenden fünf Tagen war der Zellverlust wesentlich geringer und lag bei ca. 15 % pro Tag. Daher wurden alle Versuche erst am Tag nach der Isolierung begonnen und bei den Stimulationsversuchen erfolgte die Zugabe der jeweiligen Substanz erst 2 Stunden nach dem Aliquotieren der Adipocyten (s. 3.8 Protokoll). Die Vitalitätsrate während der Kultivierung war gleichbleibend hoch und lag sowohl bei unstimulierten als auch bei stimulierten Adipocytenkulturen zwischen 92 % und 97 %. Auch wurde die Zellzahl durch keine der für die Stimulationsversuche (s. 3.8) verwendeten Substanzen beeinflußt.

4.4 RNA-Isolierung

Wie aus Tabelle 5 und Abbildung 9 hervorgeht, konnte unter Verwendung der hier beschriebenen Modifikationen (s. 3.2.1) mit allen vier Methoden Gesamt-RNA aus ausdifferenzierten Adipocyten isoliert werden. Alle RNAs waren intakt, aber nur die der CsCl-Methode war frei von DNA-Kontaminationen (s. a. Abb. 9). Für 2 x 106 Zellen lag die Ausbeute an RNA zwischen 12 µg und 20 µg. Gemessen am Quotienten aus OD260 nm / OD280 nm wurde die größte Reinheit in bezug auf Proteine, Salze und ggf. Phenol mit der RNA-selektiven Membran erreicht. In der reinen Arbeitszeit (45 - 65 min) unterschieden sich die vier Methoden kaum, jedoch war der Zeitaufwand insgesamt bei der CsCl-Methode durch die 20-stündige Ultrazentrifugation deutlich größer.

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Tabelle 5: Vergleich der verschiedenen Methoden zur Isolierung von Gesamt-RNA aus ausdifferenzierten Adipocyten.

Methode

Differentielle Präzipitation

Saure Phenol-Chloroform
Extraktion

CsCl Gradienten-Zentrifugation

RNA-selektive Membran

RNA Gesamtmenge in µg 1

12,6 ± 7,9

19,6 ± 3,9

12,4 ± 0,9

13,7 ± 4,8

DNA Kontamination

++

++

+

Quotient aus OD 260 nm / OD 280 nm 1

1,50 ± 0,08

1,58 ± 0,04

1,62 ± 0,04

1,98 ± 0,09

Zeitaufwand insgesamt 2

2 h

2 h

21 h

55 min

Arbeitszeit 2

65 min

45 min

60 min

45 min

Anzahl der Proben 3

3

6

6

9

1) Daten entsprechen den Mittelwerten ± Standardabweichung. Die Messung der UV-Absorption erfolgte vor der DNase I Behandlung. 2) Zeitaufwand insgesamt und Arbeitszeit beziehen sich auf jeweils drei parallel bearbeitete Proben. 3) Die Anzahl der Proben war durch die von den Herstellern zur Verfügung gestellten Lösungen limitiert.

Die etwas geringeren RNA-Mengen (s. Tab. 5) beruhen bei der Verwendung der RNA-selektiven Membran und der CsCl-Methode wahrscheinlich darauf, daß bei beiden Methoden sehr kleine RNA-Moleküle (unter 200 bp wie tRNAs, 5.8S oder 5S rRNA) verloren gehen (s. 3.2.1.3 bzw. 3.2.1.4), was bei der Phenol-Chloroform-Methode nicht der Fall ist. Dagegen ist bei der differenziellen Präzipitation die geringere Ausbeute möglicherweise darauf zurückzuführen, daß sich das RNA-Pellet am Ende nur sehr schlecht lösen ließ.

In der RT-PCR (s. Abb. 10), die an den DNase-Verdau anschloß, wurde bei allen vier RNA-Präparationsmethoden das 102 bp lange RT-PCR Produkt der PDH-mRNA amplifiziert. Amplifikationsprodukte genomischer DNA (185 bp) entstanden jedoch weder bei den DNase behandelten RNAs noch bei den unbehandelten RNAs, die mit der CsCl-Methode isoliert wurden.

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Abbildung 9: Gelelektrophorese der isolierten RNA. Es wurden jeweils 3 µg Gesamt-RNA (a) vor bzw. (b) nach der DNase I-Behandlung aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Zu sehen sind die 18S- und 28S-rRNA-Banden und die DNA-Kontaminationen (Pfeile).

Zur Quantifizierung der Genexpression in isolierten Adipocyten sind somit alle hier getesteten Methoden prinzipiell geeignet. Mit Ausnahme der in bezug auf Zeit und Geräte leider sehr aufwendigen CsCl-Methode ist allerdings zusätzlich eine DNase I-Behandlung der isolierten RNA erforderlich. In der unter 3.2.2 beschriebenen, optimierten RNA-Isolierungsmethode erfolgt diese bereits während der Isolierung, sodaß man bei einem geringfügig höheren Zeitaufwand (75 min statt 55 min) sehr reine, DNA-freie RNA erhält.

Abbildung 10: RT-PCR-Produkte der Pyruvat-Dehydrogenase Amplifikation. PDH-mRNA (102 bp), genomische PDH-DNA (185 bp). 1-3: Amplifikation nach DNase I-Verdau; 1) Saure Phenol-Chloroform-Extraktion, 2) RNA-selektive Membran, 3) Differentielle Präzipitation, L: 100-bp-Leiter; 4-9: Amplifikation verschiedener Proben der CsCl-Gradienten-Zentrifugation ohne vorherigen DNase I-Verdau,
P: Positivkontrolle für DNA-Kontaminationen (genomische DNA humaner Leukozyten).

4.5 TaqMan-PCR

4.5.1  Auswahl der endogenen Kontrolle

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Nachfolgend sind die Einflüsse hormoneller Stimulation (Abb. 11 A+B) bzw. der in vitro Differenzierung (Abb. 11) auf die Genexpression potentieller endogener Kontrollen dargestellt. Zur Verdeutlichung der Veränderungen wurden hierzu die ΔCT-Werte (s. 3.7 und Abbildung 4) entsprechend der Formel in den relativen Unterschied der Probe (s. Tabelle 4) zu ihrem jeweiligen Kalibrator umgerechnet. Ein ΔCT-Wert von + 1 entspricht dabei einer Verdopplung der mRNA-Konzentration gegenüber dem Kalibrator, während bei einem ΔCT-Wert von - 1 nur die Hälfte der Ausgangskonzentration vorlag.

Die geringen Abweichungen bei den internen Positivkontrollen (ΔCT-Werte zwischen - 0,01 und - 0,3) zeigen, daß keine der Proben PCR-Inhibitoren enthielt (s. 3.7). Die detektierten Unterschiede zwischen Probe und Kalibrator sind daher nicht auf variierende Amplifikationseffizienzen sondern auf unterschiedliche Ausgangskonzen-trationen des jeweiligen Zielgens zurückzuführen. Da Pipettierfehler durch den Referenzfarbstoff schon während der Messung ausgeglichen werden, beruhen somit die Unterschiede in den Ausgangsmengen auf Veränderungen der Expression des jeweiligen Gens.

Abbildung 11: Relative Veränderungen der Genexpression ausdifferenzierter Adipocyten nach 12-stündiger hormoneller Stimulation bezogen auf unstimulierte Adipocyten (Kalibrator).

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Wie in Abbildungen 11 A+B dargestellt, führt bei ausdifferenzierten Adipocyten die Stimulation mit Insulin bzw. Angiotensin II bei GUS zu einer Transkriptionsverdopplung (ΔCT > 1). Unter Hydrocortison-, Triiodo-L-Thyronin-, TNFα- bzw. 17-β-Estradiol-Stimulation wird dagegen zwar bei TBP (ΔCT 0,82 - 0,95), 18S (ΔCT = - 0,92) bzw. GUS (ΔCT = 0,82) eine deutliche Veränderung der Genexpression gemessen, eine Verdoppelung (TBP, GUS) bzw. Halbierung (18S) wird jedoch nicht ganz erreicht. Ob dies auf eine Veränderung der Transkription zurückzuführen ist, kann jedoch mit der TaqMan-Methode nicht sicher bestimmt werden. Bei allen anderen potentiellen endogenen Kontrollen sind die gemessenen Veränderungen gering. Die ΔCT -Werte liegen unter ± 0,5 (PO, ßAc, GAPDH,ß2m, TfR) bzw. ± 0,75 (CYC, PGK, HPRT).

Im Verlauf der Differenzierung und im Vergleich von Präadipocyten und ausdifferenzierten Adipocyten sind vier Gene transkriptionell deutlich verändert (Abb. 12). Neben dem sehr starken Anstieg der Genexpression von GUS (ΔCT > 1,33) sinkt bei PO, Ac und 2m im Vergleich zu undifferenzierten Präadipocyten die Genexpression während der Differenzierung auf weniger als die Hälfte (ΔCT > -1,17) bzw. bei HPRT auf knapp die Hälfte (ΔC= -0,83) der Expression. Bei allen anderen Genen bleibt die Transkription während der Differenzierung unbeeinflußt (ΔCT <± 0,6).

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Abbildung 12: Relative Veränderungen der Genexpression während der Adipocytendifferenzierung bezogen auf undifferenzierte Präadipocyten (Kalibrator).

Die geringsten Schwankungen über das gesamte Spektrum der untersuchten Einflüsse (hormonelle Stimulation und Differenzierungsgrad) treten bei GAPDH und TfR (s. a. Tabelle 3) auf. Die ΔCT-Werte liegen durchgehend unter ± 0,5 und damit noch im Bereich methodisch bedingter Schwankungen. Bei allen anderen untersuchten potentiellen endogenen Kontrollen traten dagegen z. T. deutliche Unterschiede im Vergleich zum jeweiligen Kalibrator auf, wenn auch wie z. B. bei CYC und PGK keine Verdopplung bzw. Halbierung erreicht wird (ΔCT  < 0,71).

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In weiteren Versuchen konnte bestätigt werden, daß die GAPDH zur Untersuchung der Genexpression hormonell stimulierter Adipocyten als endogene Kontrolle geeignet ist. So liegen die ΔCT-Werte der GAPDH auch nach 24-stündiger Stimulation mit Hydrocortison (100 µM), Insulin (1 µM), (1 µM), 3,3´-5-Triiodo-L-Thyronin, (T3; 1 µM) oder Angiotensin II (10 µM) zwischen - 0,24 und 0,12 und schwanken auch im Verlauf der Stimulation nur wenig (Ergebnisse nicht gezeigt).

4.5.2 Relative Expressionsstärke der Gene des Renin-Angiotensin-Systems in ausdifferenzierten Adipocyten

Mit der TaqMan-PCR gelang es, von den Genen des Renin-Angiotensin-Systems nicht nur die Genexpression des Angiotensinogens (AGT), des Angiotensin-Converting-Enzyms (ACE) und des Angiotensin II-Rezeptors Typ 1 (AGTR1) (s. 1.3) in ausdifferenzierten Adipocyten nachzuweisen, sondern jetzt auch die des Renins (REN) und des Angiotensin II-Rezeptors Typ 2 (AGTR2). Dabei zeigte sich, daß zwischen den einzelnen Genen z. T. große Unterschiede in der Stärke der Genexpression bestehen. Dies ist im folgenden exemplarisch dargestellt.

Abbildung 13: Exemplarischer TaqMan Plot der RAS-Gene in unstimulierten humanen Adipocyten.

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So zeigt Abbildung 13 die Amplifikationskurven der verschiedenen RAS-Gene und des ausschließlich in Fettzellen exprimierten Leptingens in ausdifferenzierten humanen Adipocyten. Die Amplifikation erfolgte gleichzeitig für alle Gene, mit gleichen Mengen einer cDNA-Probe, die aus Adipocyten dreier schlanker Patientinnen unterschiedlichen Alters gepoolt wurde.

Die Darstellung des Amplifikationsverlaufes gibt bereits einen Überblick über das Expressionsverhältnis der einzelnen untersuchten Gene zueinander. So beginnt die Amplifikation der fettzellspezifischen Leptin-cDNA deutlich früher als die aller RAS-Gene und die des Angiotensin II-Rezeptor Typ 2-Gens erheblich später als bei allen anderen. Dagegen liegen die Amplifikationskurven von AGT und AGTR1 sehr dicht beieinander. Über die CT-Wert-Differenzen lassen sich diese Unterschiede in relative Expressionsunterschiede der einzelnen Gene zueinander ausdrücken. Da die Steigungen der Amplifikationskurven (s. Abb. 13) bei den verschiedenen Genen jedoch aufgrund unterschiedlicher Amplifikationseffizienzen verschieden ist, variieren auch die ΔCT-Werte je nach Lage des „Threshold“ (siehe z. B. die sich überkreuzenden Kurven von AGTR1 und AGT in Abb. 13). Um diese Unterschiede auszugleichen, wurde hier die Expression der Gene bei verschiedenen cDNA-Konzentrationen gemessen und die mittlere CT-Wert-Differenz berechnet. Die sich daraus ergebenden relativen Expressionsunterschiede sind in Tabelle 6 exemplarisch für Adipocyten einer Gruppe schlanker Patientinnen dargestellt.

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Tabelle 6: Relative Genexpression der RAS-Gene und des Leptingens in humanen Adipocyten.

Kalibrator-

Expressionsverhältnis zum Kalibratorgen

gen

AGT

REN

ACE

AGTR1

AGTR2

LEP

AGT

1

3 x weniger

1/3 x weniger

1/3 x mehr

720 x weniger

39 x mehr

REN

3 x mehr

1

2 x mehr

4 x mehr

235 x weniger

120 x mehr

ACE

1/3 x mehr

2 x weniger

1

2 x mehr

470 x weniger

60 x mehr

AGTR1

1/3 x weniger

4x weniger

2 x weniger

1

960 x weniger

29 x mehr

AGTR2

720 x mehr

235 x mehr

470 x mehr

960 x mehr

1

27 x mehr

LEP

39 x weniger

120 x weniger

60 x weniger

29 x weniger

27 000 x weniger

1

Insgesamt sind in ausdifferenzierten Adipocyten schlanker Patientinnen alle RAS-Gene wesentlich schwächer exprimiert als das fettzellspezifische Leptingen. So ist die Genexpression des Leptins ca. 40 mal höher als die des AGTs und sogar mehr als 27 000 mal stärker als die des Angiotensin II-Rezeptors Typ 2. Im Vergleich dazu sind die Unterschiede zwischen den RAS-Genen AGT, AGTR1 und ACE relativ gering. Rund 1000-fach geringer als die des Angiotensin II-Rezeptors Typ 1 ist jedoch die Genexpression des anderen Angiotensin II-Rezeptorsubtyps AGTR2.

4.6 Stimulationsexperimente

Die Inkubation ausdifferenzierter Adipocyten mit 100 µM Hydrocortison resultiert in einem zeitabhängigen Anstieg der Genexpression des AT1-Rezeptors (Abb. 14 C). Während die mRNA-Menge der stimulierten Zellen nach 8 Stunden bereits doppelt so hoch ist, wird nach 24 Stunden beinahe eine Vervierfachung der Genexpression im Vergleich zu den unstimulierten Adipocyten erreicht. Das zum Lösen des Hydrocortisons verwendete Ethanol hatte dagegen keinen Einfluß auf die Genexpression.

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Wie Abbildung 15 zeigt, ist die Wirkung des Hydrocortisons dabei von der eingesetzten Dosis abhängig. So wird bereits bei einer Konzentration von 1 µM Hydrocortison eine Genexpressionsverdopplung erzielt. Bei 10 µM Hydrocortison ist das Maximum nahezu erreicht, da die 10-fache Dosis nur noch eine geringe Genexpressionssteigerung bewirkt.

Auf die Expression der anderen RAS-Gene AGT, ACE und REN hat Hydrocortison keinen Effekt (s. Abbildung 14 und Abbildung 17). Auch keines der anderen Hormone (Insulin, 17-β-Estradiol, 3,3´,5-Triiodo-L-Thyronin oder Angiotensin II) beeinflußt bei ausdifferenzierten Adipocyten die Genexpression des Angiotensinogens (AGT), des Angiotensin-Converting-Enzyms (ACE), des Angiotensin II-Rezeptors Typ 1 (AGTR1) (Abb.14) oder des Renins (Abbildung 17).

Die Quantifizierung der Genexpression des Angiotensin II-Rezeptors Typ 2 erwies sich aufgrund des sehr geringen Expressionsniveaus (s. Tabelle 6 bzw. Abbildung 13) selbst mit der TaqMan-Methode als ausgesprochen schwierig. Die CT-Werte schwankten z. T. sehr stark, sodaß die Expressionsverdopplung durch Hydrocortison bzw. 3,3´,5-Triiodo-L-Thyronin nicht in allen Experimenten nachweisbar war.

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Abbildung 14: Relative AGT-, ACE- bzw. AGTR1-Genexpression ausdifferenzierter Adipocyten während 24-stündiger Stimulation bezogen auf die Genexpression unstimulierter Adipocyten des entsprechenden Zeitpunktes.

Abbildung 15: Dosis-Wirkungskurve der AGTR1-Expression ausdifferenzierter humaner Adipocyten nach 24-stündiger Stimulation mit Hydrocortison. Angegeben sind Mittelwerte ± Standardabweichung der normalisierten Genexpression relativ zur unstimulierten Kontrolle. n = 3. Der Vergleich zwischen den Dosisgruppen erfolgte mittels ANOVA und nachfolgendem multiplen t-Test nach Bonferroni. * p ‹ 0,05 vs. unstimulierte Adipocyten; # p ‹ 0,05 vs. 1 nM, 10 nM 100 nM, 100 µM Hydrocortison; + p ‹ 0,05 vs. alle anderen Hydrocortisonkonzentrationen.

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Abbildung 16: Relative REN - bzw. AGTR2 -Expression nach 24 Stunden bezogen auf unstimulierte Adipocyten (Kalibrator). Angegeben sind Mittelwerte ± Standardabweichung; n = 4; UN (unstimuliert), Hy (100 µM Hydrocortison), In (1 µM Insulin), E (1 µM 17-β -Estradiol), T3 (1 µM Triiodo-L-Thyronin ), Ang II (1 µM Angiotensin II).

4.7 Anstieg der AT1-Rezeptorzahl unter Hydrocortisonstimulation

Die indirekte Immunfluoreszenzmarkierung des Angiotensin II-Rezeptors Typ 1 an ausdifferenzierten humanen Adipocyten zeigt, daß die Zellen auch im unstimulierten Zustand eine deutlich erkennbare AT1-Rezeptorexpression in der Zellmembran und auch im Bereich des Zellkerns aufweisen (Abb. 17 A, Bild 1). Nach 24-stündiger Hydrocortisonstimulation ist die AT1-Rezeptorzahl noch unverändert (Abb. 17 A, Bild 1 + 2). Nach drei Tagen ist die Rezeptordichte in der Zellmembran und im Kern deutlich erhöht (Abb. 17 A, Bild 4). Die Immunfluoreszenzintensität, berechnet aus je 20 fixierten Adipocyten pro Gruppe, ist bei den unstimulierten Adipocyten (Tag 1 und 3) sowie bei den Hydrocortison (100 µM) stimulierten Adipocyten (Tag 1) nahezu gleich. Nach 3-tägiger Inkubation ist die Immunfluoreszenzintensität der stimulierten Adipocyten jedoch mehr als doppelt so hoch (Abb. 17 B).

Abbildung 17: Indirekte Immunfluoreszenzdetektion des AT1-Rezeptors in ausdifferenzierten humanen Adipocyten nach 1 bzw. 3-tägiger Stimulation mit Hydrocortison. A : Konfokalmikroskopische Bilder repräsentativer Zellen. B : Immunfluoreszenzintensitäten unstimulierter und stimulierter (100 µM Hydro-cortison) Adipocyten nach 1 bzw. 3 Tagen Inkubatuion. Angegeben sind Mittelwerte ± Standardabweichung der Immunfluoreszenzintensität von je 20 fixierten Zellen pro Gruppe. Der Vergleich zwischen den Dosisgruppen erfolgte mittels ANOVA und nachfolgendem multiplen t-Test nach Bonferroni. * p ‹ 0,001 vs. unstimulierte Adipocyten (Tag 1 und 3) und stimulierte Adipocyten (Tag 1).


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31.10.2006