Diskussion

5.1  Etablierung eines in vitro Systems zur Durchführung von Genexpressions-untersuchungen an primären humanen Adipocyten

5.1.1  Zellzahlbestimmung in Suspensionskulturen ausdifferenzierter Adipocyten

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Obwohl Methoden zur Isolierung und in vitro Kultivierung von ausdifferenzierten Adipocyten seit längerem bekannt sind,  112 - 114 werden zur Untersuchung der Vorgänge im Fettgewebe meistens in vitro differenzierte Präadipocyten bevorzugt. Der Hauptgrund dafür ist sicherlich, daß sich die Kultivierung ausdifferenzierter Adipocyten vor allem aufgrund ihrer Größe und des hohen Lipidgehaltes als technisch sehr schwierig erwiesen hat (s. 1.3). Insbesondere mit dem Problem der Zellzahlbestimmung haben sich bereits verschiedene Autoren beschäftigt, da zur Durchführung quantitativer Experimente oder zur Standardisierung der Kultivierungs- und Versuchsbedingungen die genaue Kenntnis der Zellzahl unerläßlich ist. Bei der Verwendung konventioneller Zellzählgeräte (z. B. Coulter Counter) besteht jedoch die Schwierigkeit, daß diese nicht zwischen Fettzellen und Fettropfen gleicher Größe unterscheiden können, was zeitaufwendige Fixierungsverfahren (z. B. mit TCA-Glutaraldehyd oder Osmiumtetroxid) notwendig macht.  124 Aber auch die von Fine und DiGirolamo  125 beschriebene Methode, bei der die Zelldichte einer Adipocytensuspension indirekt über den Lipocritgehalt und die mikroskopische Bestimmung des mittleren Zelldurchmessers und Zellvolumens erfolgt, ist nicht weniger aufwendig.

Mit dem R/S 1000, das ursprünglich zur Bestimmung von Urinsedimenten konzipiert wurde, steht nun ein einfaches Verfahren zur routinemäßigen Bestimmung der Zellzahl in Adipocytensuspensionskulturen zur Verfügung.  126 Der Apparat ist einfach zu bedienen und bedarf nur geringfügiger Modifikationen an der Durchflußzählkammer (Höhe, Gittergröße). Die Ergebnisse sind besonders im Hinblick auf die Problematik von Adipocytensuspensionskulturen (Größe, lipidbedingter Auftrieb etc.) gut reproduzierbar. So liegt die Intraassay-Variabilität in den hier gezeigten Versuchen bei 15 %. Mit zunehmender Routine in der Handhabung des Gerätes und insbesondere bei der Suspendierung der Adipocyten sank der Fehler auf etwa 10 % (Daten nicht gezeigt). Die Verteilung der Adipocyten innerhalb der Zählkammer variiert nur wenig. Auch hier wurde die Abweichung mit zunehmender Routine geringer (< 5 %). Im Gegensatz zur Entmischung der Suspension in der Pipette und der daraus resultierenden Ungleichverteilung in einer herkömmlichen Zählkammer (s. 1.3) zeigen diese Ergebnisse, daß beim R/S 1000 die Suspension auch während des Einsaugens in die Durchflußzählkammer erhalten bleibt. Ebenso wie bei der Intraassay-Variabilität hängt die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse paralleler Ansätze hauptsächlich von der Güte der Suspendierung beim Abnehmen des Zellaliquots und während des Ansaugens der Adipocyten in die Zählkammer ab. Die Verwendung von Magnetrührer und Gefäßen mit flachem Boden erwies sich hierzu als am Besten geeignet, so daß sich auch die Interassay-Variabilität von zunächst 16 % auf 10 % senken ließ.

Unter Verwendung des hier angegebenen Protokolls (s. 3.1.3) und einer Zelldichte von etwa 40 – 80 Zellen pro Gitter sind im Allgemeinen drei Wiederholung der Zellzahlbestimmung ausreichend, um die Zellzahl einer Adipocytensuspension verläßlich zu bestimmen. Dafür werden nicht mehr als ca. 10 Minuten benötigt, da das Ansaugen und Ausspülen der Zellsuspension in Sekunden erfolgt. Die für wiederholte Messungen benötigte Zeit ist somit, verglichen mit konventionellen Methoden, sehr gering. Inklusive der Vorbereitungen (suspendieren und aliquotieren der Proben) liegt der Zeitaufwand bei etwa 15 Minuten, so daß sich diese Technik sehr gut zur routinemäßigen Zellzahlbestimmung von Adipocytensuspensionskulturen eignet. Die automatische Bedienung der Durchflußzählkammer reduziert jedoch nicht nur die Dauer der Zellzahlbestimmung deutlich, auch die Reinigung des Apparates ist einfach und schnell, und wird durch das mitgelieferte Enzymgemisch zusätzlich unterstützt. Vorteilhaft ist auch die Sicherheitsschaltung, die verhindert, daß Zellen der vorangegangenen Messung mitgezählt werden, indem sie das Ansaugen einer zweiten Probe so lange blockiert, bis die Kammer mindestens einmal mit Reinigungslösung durchgespült worden ist.

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Prinzipiell kann das R/S 1000 auch bei anderen Zellarten zur Zellzahlbestimmung verwendet werden. Da die meisten Zellen (Hepatocyten, Fibroblasten usw.) jedoch wesentlich kleiner sind als Adipocyten, empfiehlt sich hierzu der Einsatz der kleineren Standarddurchflußkammer mit einer Höhe von 100 µm statt 250 µm (modifizierte Kammer). Beide Varianten der Durchflußkammer sind sowohl für die Phasen-Kontrast-Mikroskopie als auch für die Verwendung von polarisiertem Licht geeignet. In Kombination mit entsprechenden Färbetechniken ist es außerdem möglich, die Anzahl vitaler Zellen in einer Primärkultur oder die Häufigkeit eines Zelltyps in einer Mischkultur routinemäßig zu bestimmen. Somit steht mit dem R/S 1000 insgesamt ein einfaches, schnell zu bedienendes und vielseitig verwendbares System zur Verfügung.  126

5.1.2 Vitalitätsbestimmung in Suspensionskulturen ausdifferenzierter Adipocyten

Zur Standardisierung der Kultivierungs- und Versuchsbedingungen ist jedoch nicht nur die Kenntnis der genauen Zellzahl notwendig. Es muß auch sichergestellt werden können, daß die Vitalität der Kultur unter den gegebenen Bedingungen gleichbleibend hoch ist. In bezug auf Adipocytenkulturen finden sich dazu in der Literatur jedoch praktisch keine Angaben, und auch Arbeiten, die sich direkt mit der Vitalitätsbestimmung bei Adipocyten beschäftigen, sind nicht vorhanden. So wurde die von Lorch und Rensch beschriebene Acridinorangefärbung,  115 auf der die in dieser Arbeit vorgestellte Methode beruht, ursprünglich nur als Alternative zur Bestimmung des DNA-Gehaltes eingesetzt.

Das hier aufgeführte Protokoll (s. 3.1.4) der Vitalfärbung mittels Acridinorange ist einfach und mit geringem Zeitaufwand (ca. 30 min) durchzuführen. Es liefert gut reproduzierbare Ergebnisse (ca. 5 % Intraassay-Variabilität) und eignet sich gut zur kontinuierlichen Überwachung der Vitalität einer Adipocytenkultur. Trotz der großen Lipidvakuole ist die Färbung der Zellkerne auch dann zu erkennen, wenn diese in einer anderen Betrachtungsebene liegen. Allerdings setzt diese Technik das Vorhandensein eines Mikroskops mit Fluoreszenzeinrichtung voraus, was nicht unbedingt zur Grundausstattung eines Zellkulturlabors gehört. Zusammen mit der hier vorgestellten Methode zur Zellzahlbestimmung ermöglichte dieses Verfahren die kontinuierliche Überwachung der Versuchsbedingungen bei der Adipocytenisolierung und Kultivierung.

5.1.3 In vitro Kultur

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Unter den hier gegebenen Bedingungen konnten durchschnittlich etwa 3,8 x 105 Adipocyten pro Gramm Fettgewebe isoliert werden. Berücksichtigt man außerdem den Zellverlust der ersten 16 Stunden, so reichen für einen Versuch mit 12 parallelen Ansätzen und je 1 x 106 Adipocyten pro Ansatz ca. 100 g humanes Fettgewebe aus. In Verbindung mit dem verbesserten Protokoll zur RNA-Isolierung (s. 3.2.2) liefert die entsprechende Zellzahl ca. 6 µg Gesamt-RNA pro Ansatz. Mit der TaqMan-RT-PCR Technik erlaubt das die Quantifizierung von mindestens 25 verschiedenen Genen.

Der größte Zellverlust (ca. 30 %) ist in den ersten 16 Stunden nach der Isolierung zu beobachten, was höchstwahrscheinlich auf die starke Beanspruchung der Zellen durch die Einwirkung der Kollagenase und die zahlreichen Zentrifugationsschritte zurückzuführen ist. Im restlichen Beobachtungszeitraum ist die Verlustrate deutlich geringer. Es ist daher empfehlenswert, Versuche erst am Tag nach der Isolierung zu beginnen und bei Kurzzeitversuchen die Adipocyten nach dem Aliquotieren erst einige Zeit (ca. 2 h) zur Ruhe kommen zu lassen, bevor der Versuch z. B. durch Zugabe einer Substanz gestartet wird (s. 3.8 Protokoll). Die Vitalität unter den gegebenen Kulturbedingungen ist durchgehend hoch (> 90 %). Dennoch ist der Zellverlust mit durchschnittlich 15 % pro Tag höher als nach der Vitalitätsbestimmung zu erwarten wäre. Diese Diskrepanz ist wahrscheinlich dadurch zu erklären, daß sich tote Zellen während der Färbung z. T. bereits aufzulösen beginnen, wodurch sie nicht mehr in die Vitalitätsbestimmung eingehen. Dies wird durch die Beobachtung vereinzelter Kerne ohne Zellkörper, die überwiegend rot oder orange und nur ganz selten grün sind, bestätigt. Hier scheinen sich die Zellmembranen gerade erst aufgelöst zu haben, während die Kernhülle noch intakt ist.

Untersuchungen unter serumfreien Bedingungen sind innerhalb von 48 Stunden ebenfalls möglich. Zellzahl und Vitalität unterscheiden sich in diesem Zeitraum nicht wesentlich von denen FKS-haltiger Kulturen (Daten nicht gezeigt). Bei einer länger andauernden serumfreien Kultivierung scheint der Zellverlust jedoch höher zu sein. Ein Einfluß der für die Stimulationsversuche verwendeten Substanzen auf Zellzahl und Vitalität konnte weder in serumhaltigem noch in serumfreiem Medium beobachtet werden. Somit kann ausgeschlossen werden, daß die Wirkung der untersuchten Substanzen auf eine Veränderung der Vitalität zurückzuführen ist.

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Insgesamt liegt mit den hier aufgeführten Techniken ein gut geeignetes System zur in vitro Kultivierung humaner Adipocyten vor, das die Untersuchung der hormonellen Regulation der Genexpression unter standardisierten Bedingungen erlaubt.

5.1.4 RNA-Isolierung

Trotz des großen Interesses an Studien zur Genexpression in Fettgewebe gibt es in der Literatur bisher nur einen einzigen Report, der sich speziell mit einer Methode zur Isolierung von RNA aus diesem Gewebe  127 befaßt. Diese Methode ist jedoch aufgrund einer Reihe von Präzipitations- und Zentrifugationsschritten sehr zeit- und arbeitsaufwendig. Obwohl eine große Anzahl von einfachen und schnellen RNA-Isolierungskits kommerziell erhältlich sind, gibt es in den beigefügten Protokollen jedoch keinerlei Hinweise auf ihre Verwendbarkeit für Fettgewebe (s. 1.5). Wie die hier dargestellten Ergebnisse zeigen, benötigen die meisten Protokolle vor allem Veränderungen bezüglich der Zelllyse, der Homogenisation und der Abtrennung der Lipide. Ohne diese Veränderungen wurden kaum befriedigende Ergebnisse erzielt (s. 1.4). Mit den hier beschriebenen Modifikationen (s. 3.2.1) war es jedoch möglich, mit den hier getesteten kommerziell erhältlichen Kits eine akzeptable Menge an RNA guter Qualität aus Adipocyten zu isolieren. Besonders ein der Größe der Adipocyten angepaßtes Volumen des Lysepuffers (mindestens zweifaches Volumen des Zellpellets) und die Abtrennung der Lipidphase waren dabei von entscheidender Bedeutung. Bei gefrorenen Proben hat sich außerdem das Erwärmen des Lysepuffers während der Homogenisation als vorteilhaft erwiesen.

Dennoch besitzen einige der getesteten Methoden besondere Vorteile. So resultieren die selektiven Bindungseigenschaften der Zentrifugationssäulen mit Silikatgelmembran nicht nur in akzeptablen RNA-Mengen hoher Qualität. Zeit- und Arbeitsaufwand sind darüber hinaus gering und können in Verbindung mit einer Vakuumapparatur zum Laden der Säulen weiter reduziert werden. Eine weitere besonders vorteilhafte Ergänzung dieser Methode ist die DNase-Behandlung der RNA direkt auf der Säule, die es ermöglicht, innerhalb kürzester Zeit (ca. 75 min) sehr reine, Protein- und DNA-freie RNA zu isolieren. Dagegen erleichtern die lipophilen Eigenschaften des Phenols die Lyse der Adipocyten und die Homogenisation der Probe erheblich, insbesondere bei der Verwendung von Fettgewebe. Die größte Reinheit der isolierten RNA in bezug auf DNA-Kontaminationen wird bei der leider sehr zeitintensiven und geräteaufwendigen (Ultrazentrifuge) CsCl-Gradientenzentrifugation  118 , 128 erzielt. Im Gegensatz zu den anderen Verfahren ist hier der Einsatz einer DNase nicht erforderlich. Dagegen erwies sich das Entfernen von DNA und Proteinen durch differentielle Präzipitation als schwierig, was sowohl in einer geringeren Ausbeute an RNA als auch in einer schlechteren Qualität resultierte.

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Eine nachteilige Wirkung der DNase-Behandlung im Anschluß an die RNA-Isolierung im Vergleich zum DNase I-Verdau auf der Silikatgelsäule während der RNA-Präparation konnte nicht beobachtet werden. Offensichtlich stören die Komponenten der DNase-Behandlung (Puffer, inaktiviertes Enzym, EDTA; s. 3.4) weder die nachfolgende reverse Transkription noch die PCR, da die Amplifikationseffizienzen in beiden Fällen hoch waren (> 90 %) und sich nicht deutlich voneinander unterschieden (Daten nicht gezeigt).

Zusammenfassend kann gesagt werden, daß der Großteil der kommerziell erhältlichen RNA-Präparationskits mit entsprechenden Modifikationen zur Isolierung von RNA aus Adipocyten verwendet werden kann. Ausbeute, Reinheit, einfache Handhabung und der geringe Zeitaufwand machen die RNA-Isolierung mittels RNA-selektiver Membran insbesondere in Verbindung mit der DNase-Behandlung auf der Säule zur am besten geeigneten Methode für Adipocyten.  129 Die CsCl-Methode ist dann zu empfehlen, wenn ein DNase I-Verdau nicht möglich ist. Die Phenol-Chloroform-Extraktion ist dagegen am besten geeignet, um große Mengen an RNA aus Adipocyten und Fettgewebe zu isolieren.

5.1.5 TaqMan-PCR

Mit der verbesserten RNA-Isolierungsmethode war es nun möglich, akzeptable Mengen RNA aus kleinen Zell- und Gewebeproben (Zellfraktionen der Stimulationsexperimente, Biopsiematerial) zu gewinnen. Dennoch reichte, wie bereits angesprochen (s. 1.4), die Sensitivität konventioneller RT-PCRs in Verbindung mit Ethidiumbromid gefärbten Gelen nicht aus, um sehr schwach exprimierte Gene zu detektieren oder mit dem vorhandenen Material die Expression mehrerer Gene zu quantifizieren. Mit der TaqMan-PCR gelang es jedoch nicht nur, die Genexpression des Renins und des Angiotensin II-Rezeptors Typ 2 nachzuweisen, was zuvor nicht möglich gewesen war,  46 sondern auch diese zu quantifizieren.

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Wie unter 4.5.2 gezeigt, ist die mRNA-Menge des Leptins mehr als 27 000-fach größer als die des Angiotensin II-Rezeptors Typ 2. Bei der Amplifikation wesentlich stärker exprimierter Gene, wie z. B. der endogenen Kontrollen GAPDH oder 18S rRNA (s. 4.5.1), ist die Amplifikation sogar schon ab dem 10. - 12. Zyklus detektierbar (Daten nicht gezeigt). Im Verlauf der Untersuchungen zeigte sich, daß die Genexpression gut reproduzierbar zu quantifizieren ist, wenn die Detektion der Amplifikation zwischen dem 10. und 30. Zyklus beginnt. Die CT-Werte liegen dann etwa in einem Bereich zwischen 15 und 35. Das traf bei ausdifferenzierten Adipocyten auf fast alle RAS-Gene, das Leptingen und alle untersuchten endogenen Kontrollen zu. Damit umfaßt der Quantifizierungsbereich mehr als sechs Zehnerpotenzen. Bei sehr schwach exprimierten Genen, wie z. B. dem Angiotensin II-Rezeptor Typ 2, ist die Quantifizierung schwieriger, da die Einzelwerte mit abnehmender cDNA-Menge stärker streuen, was sich besonders auf die zur Quantifizierung benötigte Eichkurve auswirkt. Eine Erhöhung der Menge an Ausgangsmaterial vermindert zwar die Schwankungen, ist aber nur bis zu einer Konzentration von 2 ng / µl Gesamt-RNA (konvertiert in cDNA) möglich, da größere Mengen inhibitorisch auf die PCR wirken. Daher ist es in diesem Fall empfehlenswert, die höchstmögliche cDNA-Menge zu verwenden und die Anzahl der Wiederholungen zu erhöhen.

Obwohl die Amplifikationseffizienz für alle untersuchten Gene stets über 90 % lag (ermittelt anhand von Verdünnungsreihen während der Etablierungsphase), variiert sie zwischen den verschiedenen Genen (Abbildung 13), was abhängig von der cDNA-Konzentration zu unterschiedlichen ΔCT-Werten führt. Aus diesem Grund war es zur Quantifizierung der Genexpression bei den Stimulationsuntersuchungen notwendig, die CT-Werte von „Zielgen“ und endogener Kontrolle (GAPDH) zunächst auf eine co-amplifizierte Eichreihe abzugleichen, bevor die relative Genexpression des „Zielgens“ auf den GAPDH-Gehalt der Probe normalisiert werden konnte. Dies hat den Nachteil, daß die Anzahl der Proben, die parallel amplifiziert und miteinander verglichen werden können, trotz des „96-well“-Formates auf 7 - 10 Proben begrenzt ist. Durch den Einsatz einer Kalibratorprobe (z. B. cDNA einer unstimulierten Adipocytenfraktion), die bei jedem PCR-Durchgang mitamplifiziert wird und auf die alle Werte bezogen werden, ist es jedoch möglich, auch Proben aus verschiedenen Amplifikationsläufen miteinander zu vergleichen.

Die Menge der zur Quantifizierung benötigten RNA ist wesentlich geringer als bei konventionellen Methoden. Während z. B. bei der TaqMan-Methode 30 ng Gesamt-RNA pro 25 µl-Ansatz zur Quantifizierung von REN und AGTR2 ausreichten, war es bei der konventionellen RT-PCR selbst mit der 3-fachen Menge an Ausgangsmaterial nicht möglich, ihre Genexpression nachzuweisen. Da für jede Probe Vierfachbestimmungen erfolgten, lag der RNA-Bedarf für REN und AGTR2 bei 120 ng pro Probe, während bei den anderen Genen sogar 40 – 80 ng ausreichten. Zusammen mit der endogenen Kontrolle lag bei einer Quantifizierung der Bedarf pro Probe bei maximal 160 ng Gesamt-RNA. Aber selbst wenn die höchstmögliche RNA-Menge von 50 ng / 25 µl - Ansatz zur Quantifizierung eines Gens benötigt wird, reichen die aus 1 x 106 Adipocyten (Stimulationsexperimente) isolierten 6 µg Gesamt-RNA aus, um mindestens 25 verschiedene Gene zu quantifizieren. Dies ist besonders bei Biopsieproben schlanker Patienten, bei denen die RNA-Ausbeute z. T. unter 2 µg liegt, von großem Vorteil.

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Die einzige Einschränkung der "TaqMan-Real-Time-PCR“ Technik ist, daß nur Unterschiede, die mindestens einer Vedopplung bzw. einer Halbierung der Expression entsprechen, sicher quantifizierbar sind. Diese Problematik wurde unter anderem bei der Bestimmung einer geeigneten endogenen Kontrolle deutlich. Erfahrungsgemäß beruhen bei der TaqMan-RT-PCR Methode CT-Wert Differenzen unter ± 0,5, wie sie z. B. bei GAPDH und TfR auftraten (Abbildung 11 und Abbildung 12) auftraten, auf methodisch bedingten Schwankungen. So liegen z. B. bei Mehrfachbestimmungen einer Probe nur selten größere CT-Wert Unterschiede vor (Daten nicht gezeigt). Dagegen zeigen andere Gene (z. B. 2m oder GUS) mit ΔCT-Werten über ± 1,0 deutliche Veränderungen der Genexpressionslevel gegenüber der jeweiligen Vergleichsprobe (Kalibrator). Für Gene, deren ΔCT-Werte jedoch zwischen ± 0,5 und ± 1,0 liegen, kann man mitdieser Methode keine eindeutige Aussage machen. Je näher der ΔCT Wert einer Probe jedoch bei ± 1 liegt, desto wahrscheinlicher ist es, daß ein Unterschied in der Genexpression zwischen Probe und Kalibrator besteht. Aus diesen Gründen wurde hier zur Bewertung der TaqMan Ergebnisse folgende Einteilung festgelegt:

ΔCT-Werte ≤ ± 0,5: keine Veränderung der Genexpression;

ΔCT-Werte zwischen ± 0,5 und ± 0,8: Genexpression wahrscheinlich nicht verändert;

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ΔCT-Werte zwischen ± 0,8 und ± 0,99: Genexpression wahrscheinlich verändert;

ΔCT-Werte ≥ 1: Genexpression verändert.

Insgesamt konnte gezeigt werden, daß die große Sensitivität der Detektion bei der „TaqMan-Real-Time PCR“ Technik die Quantifizierung in einem dynamischen Bereich von sechs Zehnerpotenzen ermöglicht und damit den Vergleich von Proben mit sehr unterschiedlichen Mengen an Ausgangsmaterial z. B. aufgrund unterschiedlicher Expressionslevel erlaubt. Die Methode ermöglicht auch die Expression von Genen, die mit konventioneller RT-PCR Technik nicht nachweisbar war, mit relativ geringen Mengen an Ausgangsmaterial zu quantifizieren. Expressionsunterschiede unter einer Verdopplung bzw. Halbierung sind jedoch nicht eindeutig quantifizierbar. Aufgrund unterschiedlicher Amplifikationseffizienzen war es notwendig, zur Quantifizierung der Expressionsunterschiede die „Standardkurvenmethode“ einzusetzen und für den Vergleich von Proben aus verschiedenen PCR-Läufen einen Kalibrator zu verwenden. Unter diesen Voraussetzungen ließ sich die Genexpression aller untersuchten Gene gut quantifizieren.

5.1.6 Endogene Kontrollen

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Auf der Basis der unter 5.1.5 aufgeführten Kriterien zeigte sich z. B., daß bei der Genexpression des Cytoskelettproteins β—Actin große Unterschiede zwischen Adipocyten und Präadipocyten bestehen, was aufgrund der starken morphologischen Veränderungen während der Adipocytendifferenzierung nicht überraschend ist. In anderen Fällen waren die Veränderungen dagegen unerwartet (z. B. GUS, 2m). Insgesamt ist die Verwendung von Genen wie PO, AC, 2m oder GUS unter den gegebenen Bedingungen nicht zu empfehlen, da transkriptionell regulierte endogene Kontrollen Expressionsunterschiede des „Zielgens“ überdecken können. Aber auch Gene wie 18S, HPRT und TBP sollten nach Möglichkeit nicht verwendet werden, ohne zuvor noch mit einer anderen Methode genau zu überprüfen, ob die hier beobachteten Veränderungen reproduzierbar sind.

Von den insgesamt 11 getesteten potentiellen „house-keeping“ Genen erwiesen sich somit für stimulierte Adipocyten und differenzierende Präadipocyten nur zwei (GAPDH und TfR ) als geeignete endogene Kontrollen.  130 Unter anderen Versuchsbedingungen ist es jedoch empfehlenswert, ihre Eignung erneut zu überprüfen. Für Versuche, die nur die hormonelle Stimulation ausdifferenzierter Adipocyten mit einer der hier untersuchten Substanzen umfassen, sind auch PO, Ac, PGK und 2m als endogene Kontrollen geeignet. Dagegen können für den Vergleich von Präadipocyten mit ausdifferenzierten Adipocyten und bei Untersuchungen an differenzierenden Präadipocyten neben GAPDH und TfR auch 18S, CYC, PGK, und TBP als „house-keeping“ Gene verwendet werden.

5.2 Das adipocytäre Renin-Angiotensin-System

5.2.1  Expression eines vollständigen adipocytären RAS

Obwohl die bisher gängige Ansicht war, daß in Geweben mit lokalem Renin-Angiotensin-System (RAS) kein einzelner Zelltyp alle Gene exprimiert,  46 , 47 , 55 , 56 konnte hier gezeigt werden, daß in ausdifferenzierten humanen Adipocyten alle RAS-Gene aktiv sind. Damit ist die Grundvoraussetzung zur lokalen, von Plasmakomponenten unabhängigen Angiotensin II-Bildung im Fettgewebe gegeben.

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Während die Genexpressionslevel von AGT, REN, ACE und AGTR1 in der gleichen Größenordnung liegen, ist die Expression dieser Gene deutlich niedriger als die des Leptingens (30 – 60-fach geringer), aber dennoch ausreichend, daß bei kultivierten humanen Adipocyten AT1-Rezeptoren in der Zellmembran (Abb. 17 A) und AGT-Sekretion nachgewiesen werden kann.  81 Die insgesamt niedrigste Expression zeigte das AT2-Rezeptorgen (AGTR2; 27 000-fach geringer als Leptin). Möglicherweise wird eine höhere Leptinexpression benötigt, da das Fettgewebe der einzige Bildungsort für das gesamte im Plasma zirkulierende Leptin ist, was für die Komponenten des Renin-Angiotensin-Systems nicht zutrifft. Denkbar ist aber auch, daß für den überwiegend lokalen Bedarf die weitaus geringere Genexpression der RAS-Gene im Fettgewebe ausreicht. Zusammen mit dem Nachweis verschiedener RAS-Komponenten im Fettgewebe,  46 , 68 , 77 , 79 , 80 der Bildung von Angiotensin II durch humane Fettzellen  79 und der Wirkung von Angiotensin II auf Adipocyten  2 , 21 , 89 , 144 , 145 stimmen die Ergebnisse dieser Arbeit klar mit der Präsenz eines voll funktionsfähigen RAS in isolierten humanen Adipocyten überein.

Die Expression des Reningens ist deutlich niedriger als die der anderen drei RAS-Gene (AGT, ACE und AGTR1), deren Expressionsstärke nahezu gleich ist, sodaß der Genexpressionslevel des Renins dreimal geringer als die seines Substrates Angiotensinogen ist. Dies ist wahrscheinlich der Grund, weshalb es mit weniger sensitiven Methoden  46 als der hier eingesetzten Technik, bisher nicht gelungen war, die Reninexpression in Adipocyten nachzuweisen, obwohl die lokale Bildung von Angiotensin II im Fettgewebe gezeigt werden konnte.  17 Daher wurde bisher vermutet, daß entweder ein alternatives Angiotensin I-bildendes Enzym in Adipocyten gebildet wird oder daß es sich hier um ein extrinsisches System (s. 1.2.3) handelt, bei dem das von den Adipocyten freigesetzte Angiotensinogen durch Renin, welches von anderen Zellen (z. B. Präadipocyten) gebildet wird oder aus dem Blut stammt, umgesetzt wird. Auch wenn beide Möglichkeiten nicht ausgeschlossen werden können, zeigen die hier gewonnenen Ergebnisse, daß Adipocyten grundsätzlich über ein autonomes Renin-Angiotensin-System verfügen.

Besonders niedrig ist die Expression des Angiotensin II-Rezeptors Typ 2. Sie ist zwar mit der sehr sensitiven TaqMan-RT-PCR Methode gerade noch nachweisbar, die Bedeutung für das humane adipocytäre RAS ist jedoch fraglich, insbesondere da die Genexpression des anderen Rezeptorsubtyps (AT1-Rezeptor) fast 1000-fach höher ist. Dieses Ergebnis stimmt mit anderen Untersuchungen überein, die zeigen, daß z. B. Adipocyten adulter Ratten ebenfalls ausschließlich den AT1-Rezeptor exprimieren,  131 während der AT2-Rezeptor vorwiegend in embryonalen, neonatalen und jungen Geweben vertreten ist.  132 , 133 Daher wird auch vermutet, daß AT2-Rezeptoren an der Regulation der Differenzierung und des Wachstums beteiligt sein könnten.  134 Diese Annahme wird bestärkt durch Experimente an Koronarendothelzellen, bei denen die Inhibition der Proliferation über den AT2-Rezeptor vermittelt wird,  75 oder durch Untersuchungen an Ob1771-Zellen der Maus, bei denen der Typ 2-Rezeptor die Präadipocytendifferenzierung fördert. Darüber hinaus konnte in neueren Untersuchungen an 3T3-L1 Zellen mittels "Western Blots“ gezeigt werden, daß der Angiotensin II-Rezeptor Typ 2 im Verlauf der adipocytären Differenzierung verschwindet, während der Typ 1-Rezeptor unverändert exprimiert wird.  135 Dies läßt ebenfalls eine, wenn auch inverse Korrelation des AT2-Rezeptors mit der Adipocytendifferenzierung vermuten. Insofern würde die minimale Genexpression des Angiotensin II-Rezeptors Typ 2 in den ausdifferenzierten, teilungsunfähigen, humanen Adipocyten gut in dieses Bild passen.

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Inwieweit die hier beobachteten Unterschiede in der Expressionsstärke der einzelnen RAS-Gene zur Regulation des adipocytären RAS beitragen und ob es Unterschiede im Expressionsmuster z. B. zwischen Adipösen und Schlanken bestehen, ist bisher nicht bekannt.

5.2.2 Bedeutung des adipocytären Renin-Angiotensin-Systems

Aufgrund der großen Ausdehnung und starken Vaskularisierung des Fettgewebes und dem Vorkommen von Fettzellen in der Umgebung von Gefäßwänden (adventitielles Fettgewebe) stellt ein vollständiges adipocytäres RAS die größte potentielle Quelle für Angiotensin II im Körper dar. Daher ist das adipocytäre Renin-Angiotensin-System wahrscheinlich nicht nur lokal von Bedeutung, sondern womöglich auch an der Blutdruckregulation des Gesamtorganismus beteiligt.

Dafür sprechen Untersuchungen an Tiermodellen, in denen nicht nur nachgewiesen werden konnte, daß das Fettgewebe nach der Leber den bedeutendsten Bildungsort für Angiotensinogen darstellt,  136 sondern daß adipocytär gebildetes AGT in den Blutkreislauf gelangt und dort zum Anstieg des Blutdrucks beitragen kann.  82 Ermöglicht werden könnte dies durch die niedrige adipocytäre Reninexpression. Angenommen, die in Adipocyten gemessenen transkriptionellen Expressionsunterschiede führen auch auf Proteinebene zu ähnlichen Verhältnissen, dann würde nur ein Teil des adipocytär gebildeten Angiotensinogens in Angiotensin I umgesetzt werden, während der AGT-Überschuß in die Zirkulation gelangen könnte. Dies könnte, trotz der Fähigkeit von Adipocyten selbst Angiotensinogen umzusetzen, die Korrelation von AGT-Plasmaspiegel und BMI  38 - 42 erklären.

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Darüber hinaus kann die lokale Bildung von Angiotensin II im adventitiellen Fettgewebe sowohl direkt als auch indirekt, in Verbindung mit der Förderung der Noradrenalinfreisetzung,  84 an der Erhöhung des Gefäßtonus und damit der Zunahme des Blutdrucks beteiligt sein. Langfristig könnte somit die Zunahme an Körperfettmasse durch beide hier dargestellten Mechanismen zur Entstehung von Hypertonie führen. Auch wäre es denkbar, daß die gleichen Mechanismen an der Reduktion des Blutdrucks bei Gewichtsabnahme beteiligt sind.  137

Eine weitere Hypothese ist, daß eine verminderte Perfusion des Fettgewebes aufgrund einer durch Angiotensin II vermittelten Vasokonstriktion den Abtransport freier Fettsäuren reduzieren könnte, was zu einer lokalen Akkumulation und verstärkten Reveresterung der freien Fettsäuren im Fettgewebe führen könnte.

Die vasokonstriktorische Wirkung auf benachbarte Gefäße ist sicherlich nicht die einzige Funktion des adipocytär gebildeten Angiotensin II. So scheint es bei 3T3-L1 Zellen und subkutanen, humanen Adipocyten die Lipogenese zu steigern, da in vitro sowohl die Genexpression als auch die Aktivität der Fettsäuresynthase (FAS) und der Glycerol-3-Phosphat-Dehydrogenase (GPDH) zunehmen.  89 Auch führt Angiotensin II bei kultivierten Adipocyten von Ratte oder Mensch zu einem Anstieg von Prostaglandinen im Medium,  138 von denen eines, das PGE2, ein potentes antilipolytisches Agens ist.  139 Auf diese Weise könnte nicht nur das systemische Renin-Angiotensin-System, sondern auch das adipocytäre RAS zur Entstehung oder Konsolidierung der Adipositas beitragen.  83

5.3 Hormonelle Regulation des RAS

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Aufgrund der potentiellen Rolle von Angiotensin II sowohl für die Entstehung der Adipositas-assoziierten Hypertonie  82 als auch die Entstehung bzw. Manifestation der Adipositas ist es wichtig, die Regulation des adipocytären RAS zu verstehen. Aus verschiedenen Untersuchungen war bekannt, daß die Regulation auf transkriptioneller Ebene erfolgt (s. 1.2.5) und das sich z. B. die Genexpression des AGTs trotz eines starken zwischenzeitlichen Anstiegs bereits nach 24 Stunden wieder normalisiert haben kann.  94 Aus diesem Grund wurde hier, anders als in vielen anderen Untersuchungen zur hormonellen Regulation der Genexpression, für alle RAS-Gene der zeitliche Verlauf der Expression über 24 Stunden quantifiziert.

Überraschenderweise führt bei isolierten humanen Adipocyten keiner der aus der Leber bekannten Regulatoren (Hydrocortison,  92 - 95 17-β-Estradiol,  92 , 95 - 97 Triiodo-L-Thyronin  92 , 98 oder Angiotensin II  58 , 92 , 93 ) zu einer Veränderung der AGT-Genexpression (s. 4.6), obwohl das Vorhandensein von „Response“-Elementen für Corticosteroide, Östrogen und Tyroidhormon in der 5´-Promotorregion des Angiotensinogengens gut untersucht ist.  66 Auch Insulin zeigt, im Gegensatz zu Untersuchungen an klonalen Präadipocytenzellinien  77 , 105 , keine Wirkung auf die Genexpression des adipocytären Angiotensinogens. Da die Expression der anderen RAS-Gene mit einer Ausnahme unter hormoneller Stimulation ebenfalls unverändert bleibt, scheinen diese Gene in Adipocyten anderen Regulationsfaktoren zu unterliegen als in der Leber oder in anderen Geweben.  66 , 95 , 140

Einzig das Gen des Angiotensin II-Rezeptors Typ 1 reagiert deutlich auf die Stimulation mit Hydrocortison. So steigt die Genexpression in Abhängigkeit von der Stimulationszeit und der Dosis auf etwa das Vierfache an (s. Abbildung 14 C und Abbildung 15), und die Rezeptordichte verdoppelt sich innerhalb von drei Tagen (s. Abbildung 19).

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Die Ergebnisse der Genexpressionsquantifizierung scheinen auch auf eine Stimulation des AT2-Rezeptor-Gens durch Hydrocortison und Triiodo-L-Thyronin hinzuweisen. Die Bedeutung einer Expressionsverdopplung ist dennoch aufgrund des insgesamt sehr niedrigen Expressionsniveaus (unter Stimulation ist die Expression immer noch ca. 500-fach geringer als die des unstimulierten AGTR1) eher fraglich. Hinzu kommt, daß die Messungen in diesem Expressionsbereich auch mit der sensitiven TaqMan-Technik stark schwanken, so daß es weiterer Wiederholungen dieser Versuche bedarf, um die Frage der Regulation des AT2-Rezeptors vollständig zu klären.

Das weitgehende Fehlen einer transkriptionellen Antwort auf die untersuchten hormonellen Stimuli ist insofern unerwartet, da für verschiedene Rattenstämme und Präadipocytenzellinien der Maus zumindest die Stimulation der adipocytären AGT-Genexpression durch einige, wenn auch nicht alle, der hier untersuchten Substanzen beschrieben worden ist.  58 , 77 , 92 - 98 , 105 Eine mögliche Ursache hierfür könnte der Rückgang oder Verlust der Hormonrezeptoren direkt nach der Isolierung sein.  141 , 142 Mittels indirekter Immunfluoreszenz konnte hier jedoch gezeigt werden, daß ausdifferenzierte humane Adipocyten unter den gegebenen Kultivierungsbedingungen den AT1-Rezeptor sowohl in der Zellmembran als auch im Kern aufweisen und die Rezeptordichte auch nach dreitägiger Kultivierung unverändert bleibt.Für die anderen Rezeptoren (Glucocorticoid-, Östrogen-, Insulin-, Thyroidhormonrezeptoren) weisen die Ergebnisse, die im Rahmen der Auswahl des endogenen Kontrollgens gewonnen wurden, indirekt auf ihr Vorhandensein in den Primärkulturen hin. Hier führte eine 12-stündige Stimulation ausdifferenzierter Adipocyten mit Insulin oder Angiotensin II zu einer Verdopplung der Genexpression der β-Glucuronidase (GUS), und unter 17-β-Estradiol- bzw. Triiodo-L-Thyronin- und Hydrocortisonstimulation wurde ebenfalls fast eine Verzweifachung der Genexpression von GUS bzw. TBP (Transkriptionsfaktor IID-TATA-Bindungsprotein) erreicht. Dies zeigt, daß in dem verwendeten experimentellen System die Voraussetzungen für eine Antwort auf die hier untersuchten hormonellen Stimuli gegeben sind.

5.3.1  Glucocorticoidstimulation der Genexpression des Angiotensin II-Rezeptors Typ 1 (AGTR1)

In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, daß die Inkubation ausdifferenzierter humaner Adipocyten mit Hydrocortison in einer zeit- und dosisabhängigen Hochregulation des AT1-Rezeptorgens und nach drei Tagen auch in einer Verdopplung der Rezeptordichte resultiert. Dieses Ergebnis entspricht den Beobachtungen einer Dexamethason-induzierten Stimulation der Genexpression des Angiotensin II-Rezeptors Typ 1 bei glatten Gefäßmuskelzellen.  140 Sato et al. konnten außerdem zeigen, daß dies zur Hypersensitivität der Gefäße gegenüber Angiotensin II führt  140 und damit womöglich zur Entstehung der Glucocorticoid-induzierten Hypertonie beiträgt.

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Die Funktion des Angiotensin II-Rezeptors Typ 1 in ausdifferenzierten Adipocyten ist dagegen weitgehend unklar. Durch die Expression des AT1-Rezeptors in der Adipocytenmembran werden Fettzellen selbst zu „Zielzellen“ des lokal gebildeten Angiotensin II, was zunächst einen regulativen Rückkopplungsmechanismus vermuten läßt. Dies ließ sich zumindest für die Regulation der adipocytären RAS-Gene jedoch nicht bestätigen.

Es konnte bisher gezeigt werden, daß Angiotensin II die adipocytäre Bildung von NO, Prostacyclin, Leptin und Plasminogen Aktivierungsinhibitor-1 (PAI-1) in vitro und in vivo stimuliert.  2 , 21 , 89 , 143 , 144 Wie diese Wirkung durch den AT1-Rezeptor vermittelt wird und welche Bedeutung diese Substanzen im Zusammenhang mit der Adipositas-assoziierten Hypertonie einnehmen, ist jedoch weitgehend unklar.

Auf eine enge Verbindung zwischen Glucocorticoidhaushalt und Fettgewebemasse deuten eine Reihe verschiedener Beobachtungen hin:Bei transgenen Mäusen wird z. B. der Anstieg von „Corticotrophin-releasing“ Faktor und Corticosteronlevel von einer Zunahme der Fettgewebemasse begleitet und führt bei Mäusen, die den „Corticotrophin-releasing“ Faktor überexprimieren, zur Entstehung des Cushing-Syndroms.  145 , 146 Björntorp und Rosmond  147 berichteten kürzlich auch über eine enge Korrelation zwischen dem BMI und Störungen der sog. „HPA-Achse“ (engl. „hypothalamic-pituitary-adrenal axis“), die auf eine direkte Verbindung zwischen erhöhter Cortisolsekretion und Übergewicht hindeutet. Hierfür sprechen auch die Untersuchungen von Bujalska et al.,  148 die zeigen, daß das Enzym 11-β-Hydroxysteroid-Dehydrogenase Typ 1 (11β-HSD1) im humanen Fettgewebe, und vor allem im visceralen Fettgewebe, inaktives Cortison in aktives Cortisol umsetzt. Die Autoren konnten außerdem nachweisen, daß in vitro die Cortison-induzierte Präadipocytendifferenzierung von der 11β-HSD1 abhängt,  149 was auch auf eine Beteiligung des lokalen Glucocorticoidmetabolismus an der Kontrolle der Fettgewebedifferenzierung hinweist.  150

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Aus Untersuchungen an Primärkulturen humaner Präadipocyten ist bekannt, daß Angiotensin II in vitro die Adipocytendifferenzierung auch in Anwesenheit von Hydrocortison  91 hemmt, wohingegen die Blockade des AT1-Rezeptors mit Irbesartan die Differenzierung noch über die Wirkung den Cortisols hinaus fördert.  91 Sofern Glucocorticoide auch bei Präadipocyten die AT1-Rezeptorexpression stimulieren, könnte es sich hierbei um einen Gegenregulationsmechanismus handeln, der über die Erhöhung der AT1-Rezeptorzahl bei erhöhten Glucocorticoidspiegeln (gestörte HPA-Achse, gesteigerte 11β-HSD1-Aktivität, Cushing-Syndrom) die Differenzierung zusätzlicher Adipocyten begrenzt. Allerdings gibt es Hinweise darauf, daß bei Präadipocyten der Anstieg der AT1-Rezeptorexpression im Verlauf der Differenzierung kein direkter Effekt der Hydrocortisonstimulation ist, da erst nach mehreren Tagen eine Expressionsverdopplung meßbar ist (J. Janke, persönliche Kommunikation).

Bei differenzierenden Adipocyten fördert Angiotensin II dagegen in vitro z. B. die Bildung des antilipolytisch wirksamen Prostaglandins PGE2  138 , 139 Crandall et al.  77 folgerte daraus, daß die Hemmung der lokalen Produktion von PGE2 durch die Blockade des adipocytären AT1-Rezeptors die basale Lipolyse erhöht und damit Größe und Metabolismus der Adipocyten beeinflussen kann. Im umgekehrten Fall könnte es durch die Zunahme der adipocytären AT1-Rezeptoren zu einer vermehrten Lipidakkumulation kommen, indem einerseits durch die Produktion von PGE2 die Lipolyse gehemmt und andererseits die Lipogeneseaktivität über die Stimulation von FAS und GPDH  89 (s. a. 5.2.2) gesteigert wird. Bei pathologisch erhöhten Glucocorticoidspiegeln, wie sie z. B. beim Cushing-Syndrom vorliegen, könnte dies zur Entstehung von Adipositas führen oder sie zumindest fördern.

Die Untersuchung der Gesamtkörperlipolyse gesunder männlicher Probanden von Townsend  151 ergab allerdings keine signifikante Veränderung der lipolytischen Aktivität durch Angiotensin II-Infusion bzw. die Blockade des Renin-Angiotensin-Systems mit Enalapril. Daher folgerte er, daß das adipocytäre RAS des Menschen eher an der Regulation des regionalen Blutflusses im Fettgewebe und der Fettzellzahl beteiligt ist, als an der direkten Regulation des Lipidstoffwechsels.

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Dagegen stehen jedoch neuere Ergebnisse aus Mikrodialyseuntersuchungen in subkutanem Fettgewebe des Menschen von Jordan et al.,  152 bei denen Angiotensin II im Perfusat die Glycerolkonzentration, als Maß der lipolytischen Aktivität, im Dialysat ansteigen ließ, während der Blutfluß überraschenderweise unverändert blieb. Bestätigt wird dies durch Ergebnisse von Skurk et al.,  153 die zeigen konnten, daß Angiotensin II die Lipolyse bei in vitro differenzierten humanen Adipocyten subkutanen Ursprungs ebenfalls stimuliert. Sofern dieser Effekt auf subkutanes Fettgewebe beschränkt ist, könnte es bei pathologisch erhöhten Glucocorticoidspiegeln (gestörte HPA-Achsen Aktivität, Cushing-Syndrom) durch den Anstieg der AT1-Rezeptorexpression und der damit verbundenen Erhöhung der lipolytischen Aktivität des subkutanen Fettgewebes zu einer Umverteilung der Triglyceride im Körper hin zu anderen Depots (z. B. viscerales Fettgewebe) oder Geweben (z. B. Muskeln) kommen. Daher könnte dies einer der Mechanismen sein, die zur Entstehung bzw. Förderung der besonderen Fettgewebeverteilung des Cushing-Syndroms oder (bei gleichzeitiger Überernährung) der zentralen Adipositas beitragen.

Auch wenn diese Zusammenhänge z. Z. noch spekulativ sind, stellt die adipocytäre Expression des AT1-Rezeptors neben der lokalen Expression der RAS-Gene einen nicht zu vernachlässigenden Faktor bei der Aufklärung von Adipositas-assoziierten Störungen dar. Dabei sollte auch nicht außer Acht gelassen werden, daß selbst bei unveränderter Genexpression die Zunahme der Fettzellzahl zur Erhöhung des insgesamt verfügbaren Angiotensinogens und damit auch des Angiotensin II führt.

5.4 Schlußfolgerung und Ausblick

Über die Bedeutung des adipocytären Renin-Angiotensin-Systems für die Adipositas-assoziierte Hypertonie wurde bereits viel spekuliert.  154 Dennoch ist wenig in bezug auf seine Wirkung („Zielzellen“) und Regulation bekannt.  17 Auch sind die Ergebnisse oft verschieden und z. T. widersprüchlich. Dies mag teilweise auf Speziesunterschiede (Nagetier / Mensch) oder verschiedene Untersuchungsmodelle (in vivo Experimente, Primärkulturen, klonale Zellinien) zurückzuführen sein (s. 1.3), wird aber auch durch die ausgesprochen große Komplexität des Systems bedingt, die sich erst nach und nach offenbart. Es gibt im Prinzip vier Bereiche, auf die das adipocytäre Renin-Angiotensin-System potentiell Einfluß hat, und in denen seine Wirkung eventuell sehr unterschiedlich, wenn nicht sogar gegensätzlich, sein kann. Da wäre zunächst die endokrine Wirkung des adipocytär gebildeten Angiotensinogens im Blutkreislauf und sein Beitrag zur Regulation des Blutdrucks. Der zweite Bereich umfaßt das adipocytär gebildete Angiotensin II im adventitiellen Fettgewebe (parakrines System) und seinen Einfluß auf den Gefäßtonus. Im Bereich des Speicherfettgewebes stellt sich schließlich die Frage nach der Bedeutung des lokal gebildeten Angiotensin II und des AT1-Rezeptors für die ausdifferenzierten Adipocyten (autokrin-parakrin) einerseits und die Differenzierung der Präadipocyten (parakrine Wirkung) andererseits, sowie ihr gemeinsamer Beitrag an der Entstehung der Adipositas. Auch kommen noch mögliche Unterschiede zwischen den verschiedenen Fettgewebedepots (subkutan / visceral) hinzu.

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Bei derart vielfältigen Wirkungsmechanismen des adipocytären Renin-Angiotensin-Systems ist es nicht überraschend, wenn hier andere Regulationsmechanismen als im systemischen RAS wirken. Die enge örtliche Verbindung zum Lipidstoffwechsel legt eine Regulation durch ernährungsphysiologische Parameter nahe, auf die es durch die Experimente mit Ratten von Frederich et al. bereits Hinweise gibt.  83 Inwieweit dies auch auf den Menschen übertragbar ist, bleibt abzuwarten, da die wenigen Untersuchungen zur Beeinflussung der Lipolyse durch Angiotensin II beim Menschen nicht eindeutig sind.  151 , 152 , 153

Aufbauend auf den hier gewonnenen Ergebnissen wären die nächsten Schritte, auch die anderen RAS-Proteine sowie ihre Aktivität in den Adipocyten und / oder im Medium nachzuweisen und die Stimulationsexperimente an Adipocytenkulturen mit anderen potentiellen Regulatoren der RAS-Gene (z. B. freie Fettsäuren) fortzusetzen. Von großem Interesse ist sicherlich die Rolle des Angiotensin II-Rezeptors Typ 1 für den Stoffwechsel ausdifferenzierter Adipocyten (z. B. Beeinflussung der Leptinexpression) sowie seine Bedeutung für die Präadipocytendifferenzierung. Hier könnte die Untersuchung der Signaltransduktionswege wichtige Hinweise liefern. Ferner sollte auch die Frage, auf welche Weise sich Adipocyten und Präadipocyten gegenseitig beeinflussen, z. B. durch Co-Kultivierungsexperimente näher untersucht werden.

Zusammenfassend weist die vorliegende Arbeit auf das Vorhandensein eines vollständigen adipocytären Renin-Angiotensin-Systems hin. Seine Bedeutung bei der Entstehung Adipositas-assoziierter Erkrankungen, wie z. B. Hypertonie oder Diabetes bedarf weiterer Untersuchungen.


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31.10.2006