Zusammenfassung

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In den letzen Jahren hatte sich gezeigt, daß Fettgewebe nicht nur ein inerter Fettspeicher ist, sondern auch eine Vielzahl endokrin wirksamer Substanzen produziert. Hierzu gehören u. a. auch Komponenten, die an der Blutdruckregulation beteiligt sind, wie Angiotensinogen, NO-Synthase oder Endothelin-1. Da Adipositas bekanntermaßen ein wichtiger Risikofaktor für die Entwicklung der Hypertonie ist, ist der Beitrag adipocytär exprimierter Blutdruckregulationssysteme von großem Interesse.

Da Ergebnisse aus Tiermodellen nicht in allen Fällen auf den Menschen übertragbar sind, wurde im Rahmen dieser Arbeit ein System zur quantitativen Untersuchung der Genexpression in Primärkulturen humaner Adipocyten entwickelt und die Regulation der Renin-Angiotensin-System-Gene unter hormoneller Stimulation untersucht. Dies beinhaltete zum einen die Etablierung der Adipocytenisolierung, Kultivierung, und eines Stimulationsassays sowie die Entwicklung einer der besonderen Größe und dem hohen Fettgehalt der Zellen angepaßten Zellzahl- und Vitalitätsbestimmungsmethode. Darüber hinaus wurden vier verschiedene RNA-Extraktionsmethoden auf ihre Eignung für Adipocyten untersucht und schließlich ein besonders sensitives RT-PCR System zur Untersuchung der Genexpression mittels einer fluoreszenzmarkierten Sonde etabliert.

Es konnte gezeigt werden, daß sich das R/S 1000 und die Färbung mit Acridinorange gut zur schnellen und reproduzierbaren Bestimmung von Zellzahl bzw. Vitalität in Adipocytensuspensionskulturen eignen und das die Kulturbedingungen für die Stimulationsexperimenten geeignet waren. Unter bestimmten Modifikationen (Zellyse, Lipidabtrennung) eignete sich jede der hier untersuchten RNA-Extraktionen, wobei sich die Methode mit der RNA-selektiven Membran durch Reinheit, Schnelligkeit und die Kombinierbarkeit mit einem DNase-Verdau auszeichnete. Die besondere Sensitivität der hier verwendeten „TaqMan-Real-Time-PCR“ zeigte sich u. a. darin, daß zwei RAS-Gene, deren Nachweis mit herkömmlichen Methoden bisher nicht gelungen war, quantifiziert werden konnten, und daß Expressionsunterschiede in einem Bereich von mehr als sechs Zehnerpotenzen meßbar sind. Der Test von 11 verschiedenen potentiellen endogenen Kontrollen ergab, daß nur die Genexpression von zweien, darunter die GAPDH, weder während der Präadipocytendifferenzierung noch durch eines der verwendeten Hormone verändert wurde.

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Die Untersuchung des adipocytären Renin-Angiotensin-Systems ergab, daß ausdifferenzierte humane Adipocyten alle RAS-Gene exprimieren, wenngleich die Genexpression des Angiotensin II-Rezeptor Typ 2 sehr gering ist. Ein Einfluß von Hydrocortison, 17-β-Estradiol, Insulin, Triiodo-L-Thyronin oder Angiotensin II auf die Genexpression von AGT, ACE und REN konnte in humanen Adipocyten nicht nachgewiesen werden, was vermuten läßt, daß diese Gene hier anderen Regulationsfaktoren zu unterliegen als in der Leber oder in anderen Geweben. Beim Angiotensin II-Rezeptor Typ 1 kommt es dagegen unter Hydrocortisonstimulation zu einer zeit- und dosisabhängigen Steigerung der Genexpression auf ca. das 4-fache nach 24 Stunden. Darüber hinaus konnte mittels indirekter Immunfluoreszenz gezeigt werden, daß der Hydrocortison-induzierte Anstieg der Genexpression nach drei Tagen auch zu einer Verdopplung der AT1-Rezeptorzahl an humanen Adipocyten führt. Dieser Aspekt ist möglicherweise nicht nur bei der besonderen Adipositasform des Cushing-Syndroms von Bedeutung, sondern auch für die Entstehung der zentralen Adipositas.


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31.10.2006