Initial wurden 20 weibliche Läuferschweine (Sommerfeld, Berlin, Deutschland) mit einem Gewicht zwischen 28,4 kg und 34,2 kg verwendet. Das Protokoll wurde genehmigt von der zuständigen Behörde für Tierschutz (Bearbeitungsnummer G 0068/99). 5 Tiere wurden für Vorversuche verwendet, in denen die Praktikabilität der Versuche geprüft wurde. Anschließend wurden 15 Versuchstiere kontinuierlich beobachtet und die Ergebnisse systematisch erfasst und ausgewertet.

Das Schwein wird in speziellen Fragestellungen als Versuchstier zur Erforschung von Erkrankungen des Menschen häufig eingesetzt, da es in Physiologie und Anatomie der des Menschen sehr ähnlich ist.

Nach einer 12-stündigen Nahrungskarenz wurde die Narkose durch den Tierarzt in der tierexperimentellen Einrichtung eingeleitet. Dazu wurde Atropin und Azaperon in eine Ohrvene injiziert und anschließend mittels Perfusor Etomidat und Fentanyl sowie Pancuronium mit je 5ml/h intravenös appliziert. Während der gesamten Prozedur befanden sich die beatmeten Tiere in Vollnarkose. Den narkotisierten Tieren wurde der gesamte Ober- und Unterbauch rasiert und desinfiziert. Anschließend erfolgte der Transport der Tiere zum Computertomographen (Somatom Plus, Siemens, Erlangen, Deutschland). Die Tiere wurden in Rückenlage (n = 5) für die Darstellung des Pankreaskörpers, in Linksseitenlage (n = 5) für die Darstellung des Pankreaskopfes bzw. in Rechtsseitenlage (n = 5) für die Darstellung des Pankreasschwanzes, an den Vorder- und Hinterläufen mit Haltegurten auf der CT- bzw. MRT-Liege fixiert. Sämtliche operativen Eingriffe erfolgten unter aseptischen Bedingungen. Nach korrekter Lagerung der Tiere erfolgte die perkutane Einbringung der Applikatoren unter CT-Kontrolle. Die Tiere wurden nach der LITT täglich klinisch auf Krankheitsanzeichen durch einen Tierarzt untersucht. Über den gesamten Zeitraum wurden die Tiere mit einem Fentanylhautpflaster behandelt.

Die Tiere wurden je nach Laserleistung in 4 Gruppen eingeteilt. In der Gruppe 1 (n = 5) wurde die Laserkoagulation mit einem 5F-Applikator mit 5 Watt durchgeführt. In der Gruppe 2 (n = 3) erfolgte die Behandlung mit einem gekühlten 9F-Applikator mit 10 Watt. Die 3. Gruppe (n = 2) wurde mit einem 9F-Applikator bei einer Laserleistung von 20 Watt koaguliert und bei der Gruppe 4 (n = 5) wurden zwei 5F-Applikatoren simultan mit 5 Watt betrieben.

Um im zeitlichen Verlauf sowohl die magnetresonanztomographischen als auch die histologischen Unterschiede eruieren zu können, erfolgte eine weitere Unterteilung der Versuchsgruppen. Dabei fand die Kontrolluntersuchung und die Entnahme des Pankreas bei sechs Tieren unmittelbar nach LITT und bei 9 Tieren nach 7 Tagen statt.

Gruppen

Applikationsart

Laserleistung

Anzahl der Tiere (n)

1

5F

5W

5

2

9F

10W

3

3

9F

20W

2

4

2x 5F

je 5W

5

insgesamt

15

Tab. 4: Versuchsgruppen

Das Punktionsset besteht aus einer Chiba-Punktionsnadel (Somatex, Berlin, Germany), die nach der Inzision der Haut in die Zielregion eingebracht wurde (Abb. 1), dem steifen 0,035 inch Führungsdraht (Meditech/ Boston Scientific, Watertown, MA), der danach in den Punktionskanal eingeführt wurde und anschließend mit den 4-French, 6-French und 8-French-Dilatatoren aufbougiert wurde um das lichtdurchlässige Schleusensystem direkt der Zielregion anzupassen. Nachdem der Führungsdraht entfernt wurde, konnte ein spezieller, lichtdurchlässiger Hüllkatheter mit Führungsmandrin (Somatex®) in die gewünschte Region eingebracht werden. Der Hüllkatheter ist bis 400°C thermostabil. Mittels Seldingertechnik kann die Schleuse über den Führungsdraht eingeführt werden. Es wurden sowohl 5F-Katheter als auch gespülte 9F-Katheter (LITT-Sets; Somatex, Berlin, Deutschland) zur Thermoablation benutzt.

Abb. 1: Inzision der Haut nach Desinfektion und steriler Abdeckung

Die Thermoablation erfolgte mit dem Nd:YAG-Laser (Medilas Fibertom 5100, Dornier Med Tech, Wessling, Deutschland) über einen streuenden Lichtleiter, der das Licht gleichmäßig in alle Raumrichtungen verteilt. Der Laser mit einer Wellenlänge von 1064nm wurde mittels einer 400-µm-Siliciumfaser in das Gewebe eingebracht und emittierte kontinuierliches Laserlicht bei einer Leistung von 5 - 25 Watt (Abb. 2).

Abb. 2: Nd:YAG-Laser (medilas fibertom 5100, Dornier Med Tech, Wessling, Deutschland) in Betrieb, mit rot leuchtender Faserspitze (Pfeil)

Abb. 3: Perkutanes Einführen des Schleusensystems über einen ventralen Zugang unter aseptischen Bedingungen

Durch Weiterentwicklung des gespülten diffusen Applikationssystems wurde es möglich, laserinduzierte Nekrosen von größerem Durchmesser zu erzielen ohne eine Karbonisierung des Gewebes herbeizuführen. Der Aufbau des Lasers ist in folgendem Schema dargestellt.

Abb. 4: Schematische Darstellung des Laserapplikators mit interner Wasserspülung

Der Applikator besitzt eine 28 mm lange gefrostete Oberfläche am distalen Faserende mit einem schützenden Glasdom. Die Steuereinheit und das Lasergerät befanden sich im MRT-Kontrollraum. Der Laserapplikator ist über einen 10 m langen Lichtleiter (Faserkerndurchmesser 400 µm) durch eine spezielle Kabelschleuse mit dem Lasergerät im MRT-Kontrollraum verbunden.
Zur Quantifizierung der faserbedingten Energieverluste bei der Applikation wurde durch eine externe Messung vor jeder Laserapplikation die distale Applikationsleistung an der Faserspitze mittels eines Leistungsmessgerätes ermittelt. Um die Dislokation des Applikators während der LITT zu verhindern, wurde eine eigens zu diesem Zweck konstruierte Applikatorhalterung verwendet, um den Applikator an der Haut im korrekten Winkel zu fixieren.

Das perkutane Einbringen der Applikatoren erfolgte unter CT-Kontrolle (Somatom plus; Siemens, Erlangen, Germany). Der Pankreaskörper stellt sich in Höhe des 13./ 14. Brustwirbels zwischen der kleinen Magenkurvatur, Pars cranialis duodeni und ventral der V. portae als schmaler, bogenförmiger, hyperdenser Streifen dar. Der kurze rechte Pankreaslappen ist dem Anfangsabschnitt der Pars descendens duodeni medial angelagert. Der größere linke Pankreaslappen stellt sich in Höhe des 14. Brustwirbels/ 1. Lendenwirbels keulenförmig dar. Er hat lateral Kontakt mit der Facies visceralis der Milz und lagert sich ventral der linken Niere an. Aus dem rechten und linken Lappen gehen Äste des gabelförmigen Verbindungsstückes hervor und vereinigen sich median in Höhe des 1./2. Lendenwirbelkörpers. Ab diesem Bereich stellt sich der Pankreasanschnitt zunächst annähernd dreieckig, weiter kaudal queroval dar und endet in Höhe der Nierenhili. Daher ist es nötig den Pankreaskörper in ausreichender Schichtung über mindestens vier Wirbelkörper darzustellen [44, 45].

Abb. 5: CT in transversaler Schnittführung nach Applikation von Ultravist mit deutlich sichtbarem Pankreaskopf, -korpus und jetzt auch Pankreasschwanz (Pfeile)

Nachdem die Haut ca. 1 cm inzisiert wurde, konnte die Chiba Nadel perkutan in die Zielregion eingebracht werden, wobei darauf geachtet wurde, nicht die Leber oder das Colon transversum zu verletzen. Es erfolgte ein Kontrollscan zur Lagekontrolle der Punktionsnadel und gegebenenfalls eine Lagekorrektur mit erneuter Lagekontrolle.

Abb. 6: CT-Kontrollscan in transversaler Schnittführung zur Lagekontrolle der Punktionsnadel im Pankreasschwanz nach transgastraler Punktion

Danach wurde an der Schleuse und am Hüllkatheter die geplante Eindringtiefe markiert. Der Führungsdraht wurde eingeführt und die Punktionsnadel entfernt. Der Punktionskanal wurde mittels der 4F, 6F und 8F-Dilatatoren bougiert um das Hüllsystem einführen zu können. Anschließend wurde die Schleuse eingelegt und der Führungsdraht wieder entfernt. Es folgte eine erneute Lagekontrolle der Schleuse und gegebenenfalls eine Lagekorrektur mit erneuter Lagekontrolle. Nun wurde der Hüllkatheter in das Pankreas eingebracht, über den der Laser in das Zielgebiet vorgeschoben werden konnte. Abschließend folgte die Fixierung des Führungsdrahtes und des Hüllkatheters. Außer dem Monoapplikator kamen auch Multiapplikatoren mit multifokalem Zugang zum Einsatz. Dabei wurden 2 Applikatoren aus verschiedenen Richtungen in das Pankreas eingebracht und später simultan betrieben. Danach wurde das Tier in den MRT-Raum umgelagert und dort eine erneute Lagekontrolle vorgenommen um eine Fehllage des Schleusensystems nach Umlagerung des Tieres auszuschließen.

Für die Online-Überwachung der laserinduzierten Thermotherapie stand für die Versuche ein 1,5 Tesla Magnetresonanztomograph (Magnetom SP 63, Siemens, Erlangen, Deutschland) zur Verfügung. Nach Neuplatzierung des Versuchstieres auf den MRT-Tisch wurde die Position von Schleuse und Hüllkatheter mit dem paramagnetischen Positionskontroller (Somatex®) überprüft und wenn notwendig neu platziert. Die Positionskontrolle erfolgte mittels Gradientenechosequenzen in zwei Ausdehnungen (FLASH, TR/TE 154/6, flip angle 75°, eine Aquisition, 5 mm Schichtdicke, FOV: 200 – 250 mm², Matrix 128 x 256.
Während des gesamten Prozesses wurden temperatursensitive T1-gewichtete fast low angle shot Gradientenechosequenzen (thermo-FLASH, TR/TE 102/8, flip angle 70°, 5 mm Schichtdicke, Aufnahmezeit 17s, FOV 200 x 250 mm, Matrix 128 x 256) angefertigt. Die folgende Tabelle gibt eine Übersicht über die Sequenzparameter.

T1-gewichtete
Gradientenechosequenz
FLASH

T1-gewichtete
thermo-FLASH-Sequenz

Repetitionszeit

154 msec

102 msec

Echozeit

6 msec

8 msec

Focus of view

200 – 250 mm²

200 x 250 mm²

Matrix (read x phase)

128 x 256

128 x 256

Akquisition

1

1

Schichtdicke

5 mm

5 mm

Akquisitionszeit

17 s

Flipwinkel α

75°

70°

Tab. 5: Bildparameter für T1-gewichtete Gradientenechosequenz (FLASH) zur Positionskontrolle und T1-gewichtete thermo-FLASH-Sequenz (FLASH: fast low angle shot) zur Prozesskontrolle

Während der Messungen wurde der Respirator abgeschaltet, um eine Atemanhaltetechnik zu simulieren. Bei allen Tieren betrug die Applikationsdauer 15 min mit einer Laserleistung von 5 - 20 Watt. Bei den Versuchstieren wurde während der LITT über eine fluorooptische Temperatursonde (Luxtron MPM, Mountain View, CA), die über einen eigenen Katheter eingebracht wurde, die erzielte Temperatur sowie der folgende Temperaturabfall unmittelbar am Applikationsort mit einem maximalen Abstand von 10 mm gemessen.

Abb. 7: Applikatorenanordnung im Pankreas bei der Multiapplikation mit multifokalem Zugang und Temperatursonde mit separatem Zugang

Unmittelbar nach der LITT wurden wiederum magnetresonanztomographische Aufnahmen in transversaler Schnittführung angefertigt. Diese umfassten konventionelle T1-gewichtete Spinechosequenzen (TR/TE 600/15, 5 mm Schichtdicke, Akquisitionen: 2, FOV 200 - 300 mm², Matrix 256 x 256) sowie T2-gewichtete SE-Sequenzen (TR/TE 2000/90, Akquisitionen 1, FOV 200 - 300 mm², Matrix 128 x 256. Die FLASH-Aufnahmen wurden mit den gleichen Parametern wiederholt.
Nach der intravenösen Injektion von 0,2 mmol/ kg Gadopentetat Dimeglumin (Magnevist®, Schering, Berlin, Deutschland) wurden die T1-gewichteten Spinechosequenzen und die FLASH-Aufnahmen wiederholt.
Nach Beendigung der LITT wurde die Faser zurückgezogen und nach erneuter Wunddesinfektion die Hautinzision mit Einzelknopfnähten bzw. einem Klammerpflaster verschlossen.
Die Kontrollaufnahmen unmittelbar nach LITT (n = 15) und 7 Tage (n = 9) nach LITT wurden im gleichen Tomographen durchgeführt. Nachdem die Tiere erneut in Vollnarkose versetzt und auf dem MRT-Tisch gelagert wurden, konnten die Sequenzen wiederholt werden, die unmittelbar nach der Thermoablation erstellt wurden. Alle Tiere erhielten zur Kontrolluntersuchung 200 ml Ferumoxil (Lumirem®, Guerbet, Aulnay- Sous- Bois, Frankreich) oral über eine Magensonde. Die folgende Tabelle gibt die genauen Messparameter der durchgeführten Sequenzen in einer Übersicht wieder.

T1-gewichtete
Spinechosequenz

T2-gewichtete
Spinechosequenz

Repetitionszeit

600 msec

2000 msec

Echozeit

15 msec

90 msec

Focus of view

200 x 300 mm²

200 - 300 mm²

Matrix (read x phase)

256 x 256

128 x 256

Tab. 6: Bildparameter für T1-gewichtete Spinechosequenz und T2-gewichtete SE-Sequenz zur Kontrolle nach Thermoablation

Nach der jeweils definierten Überlebenszeit der Tiere: unmittelbar nach den Kontrollaufnahmen und 7 Tage nach Laserapplikation, wurden die Tiere in Vollnarkose mittels intravenöser Überdosis Phenobarbital und Kaliumchlorid getötet.
Über eine Medianlaparotomie wurde die Abdominalhöhle eröffnet. Das Abdomen wurde hinsichtlich Blutungen, Perforationen, Ulzerationen des Darmes und des Magens und anderer pathologischer Auffälligkeiten untersucht. Zur Entnahme des Pankreas wurden der Magen und die Leber ausgelagert sowie alle versorgenden Gefäße und bindegewebigen Strukturen durchtrennt. Es wurde überprüft, ob es zu einer Schädigung von Milz, Nebennieren oder Nieren gekommen war. Wenn der makroskopische Eindruck dies nicht ausschließen konnte, wurden diese Organe mitentnommen und histologisch untersucht. Unmittelbar nach Entnahme des Pankreas wurde dies im frischen, unfixierten Zustand vermessen und fotographisch dokumentiert.
Bei 5 Präparaten wurde ein Schnitt durch das frische Pankreas vorgenommen, um den Schrumpfungsgradienten des Gewebes durch die Formalinfixation zu ermitteln. Dazu wurde die makroskopisch sichtbare Läsion vor und nach Fixation in 10%igem Formalin ausgemessen.

Für die histologische Aufarbeitung wurde das gesamte Pankreas in einer 10%igen Formalinlösung für mindestens eine Woche fixiert.
Vor der histologischen Aufarbeitung wurde jedes Organ mittels eines Flächenschnittmessers in ca. 5 mm dicke Längsschnitte geteilt und makroskopisch die Nekrosen ausgemessen sowie das gesamte Organ in allen Schichten fotografiert. Hierbei wurde darauf geachtet, dass die Schnittführung möglichst der transversalen Bildgebung der Magnetresonanztomographie entspricht, um später eine Korrelation vornehmen zu können.

Abb. 8: Auszug der makroskopischen Längsschnitte durch das Pankreasgewebe mit deutlich abzugrenzender Nekrosezone

Um später alle Schichten zuordnen zu können, wurden von allen Gewebeschnitten Skizzen angefertigt und die makroskopisch sichtbare Nekrosezone eingezeichnet. Außerdem wurden auf den Skizzen die einzelnen Gewebeblöcke eingezeichnet, um bei der mikroskopischen Auswertung die Zugehörigkeit der einzelnen Abschnitte gewährleisten zu können.

Abb. 9: Skizze der pathologischen Schnittpräparate in 5 mm Schichtdicke mit roter Markierung der makroskopisch sichtbaren Nekrosezone (rote Flächen).

A₁-A₂₀ kennzeichnen die einzelnen Gewebeblöcke mit relevanter Nähe zur Nekrose. Die Blöcke B und C wurden als Referenzzone untersucht.