| Grampp, Anne: Proliferation von Mikrogliazellen und Astrozyten im Gyrus dentatus der Ratte nach experimenteller Läsion des entorhinalen Kortex |
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Das Thema der vorliegenden Arbeit ist die Untersuchung der “Proliferation von Mikrogliazellen und Astrozyten im Gyrus dentatus der Ratte nach experimenteller Läsion des entorhinalen Kortex“. Zum Einstieg werden die anatomisch-physiologischen und pathophysiologischen Grundlagen der Hippokampusformation dargelegt. Auf die wichtigsten beteiligten glialen und anderen zellulären Strukturen und Mechanismen wird dabei besonders eingegangen.
Die Hippokampus-Formation setzt sich aus folgenden Regionen zusammen: Gyrus dentatus (DG=dentate gyrus), Hippocampus proper (unterteilt in die Felder CA3, CA2, CA1), Subikulum, Präsubikulum, Parasubikulum und entorhinaler Kortex (EC) [1]. Die Hippokampus-Formation ist ein phylogenetisch sehr alter Teil des Großhirnkortex, sie nimmt bei der Ratte einen großen Anteil am gesamten Kortex ein. Teile der Hippokampus-Formation, nämlich der Gyrus dentatus, der Hippocampus proper und das Subikulum, gehören zum dreischichtig aufgebauten Allokortex. Der Gyrus dentatus besteht aus der Molekularschicht (ML=molecular layer, unterteilt in äußere und innere Molekularschicht OML=outer molecular layer und IML=inner molecular layer) und der Körnerzellschicht (GCL=granule cell layer). Die Regionen der Hippokampus-Formation unterhalten mehrere afferente und efferente Faserverbindungen untereinander und mit anderen Kortexanteilen. Bei den Verbindungen innerhalb der Hippokampus-Formation herrschen charakteristischerweise unidirektionale Projektionen vor, was für kortiko-kortikale Verbindungen untypisch ist [1].
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Die wichtigste entorhinale Projektion zum Gyrus dentatus, der Tractus perforans (PP=perforant path), wurde erstmals 1901 durch Ramon y Cajal beschrieben [2]. Der glutamaterge Tractus perforans ist die wichtigste kortikale Afferenz des Gyrus dentatus und trägt auch zur Innervation des Hippocampus proper und des Subikulums bei. Die Fasern des Tractus perforans (s. Abb. 1) nehmen ihren Ursprung größtenteils von Neuronen in den Schichten II und III des entorhinalen Kortex, verlaufen über die darunterliegende weiße Substanz und das anguläre Bündel, durchqueren die Pyramidenzellschicht des Subikulums und kreuzen die Fissura hippocampi [1]. Die Faserqualität des Tractus perforans ist größtenteils exzitatorisch, da glutamaterg. Einige Terminalen des PP reagieren immunoreaktiv für Enkephalin bzw. CCK, und es gibt auch GABAerge Neurone, deren Fasern mit dem PP verlaufen [1].
Das Terminationsgebiet des Tractus perforans erstreckt sich auf die Körnerzelldendriten, welche sich in den äußeren zwei Dritteln der Molekularschicht des Gyrus dentatus verzweigen. Teile des Tractus perforans endigen außerdem an den distalen Anteilen der Pyramidenzelldendriten des Hippokampus (Stratum lacunosum moleculare von CA1 und CA3) und des Subikulums [15]. Dabei projizieren Neurone aus dem medialen entorhinalen Kortex in die mittlere Molekularschicht, laterale Anteile des entorhinalen Kortex innervieren die äußere Molekularschicht des Gyrus dentatus [57; 36]. Zum größten Teil verläuft der Tractus perforans ipsilateral, zu einem kleinen Teil aber als sogennanter “gekreuzter Tractus perforans“ auch zum kontralateral gelegenen Gyrus dentatus [1].
Diese Verbindung spielt eine wichtige Rolle bei der entorhinal-hippokampalen Prozessierung von Lernen und Gedächtnis [43]. Von pathophysiologischem Interesse ist, daß der entorhinale Kortex im Alterungsprozeß besonders frühe und ausgeprägte pathologische Veränderungen zeigt [27].
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Abb. 1: Anatomie der Hippokampusformation bei höheren Säugern. DG=Gyrus dentatus (1=äußere Molekularschicht, 2=innere Molekularschicht, 3=Körnerzellschicht, 4=Fissura hippocampi, 5=Hilus), CA1/2/3=Abschnitte des Hippocampus proper, Fi=Fimbria, S=Subikulum, aB=anguläres Bündel, EC=entorhinaler Kortex (I/II/III/IV/V/VI=Schichten des entorhinalen Kortex), ECL=entorhinale Kortexläsion. Die Abbildung zeigt den Verlauf des Tractus perforans.
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Die experimentelle Läsion des entorhinalen Kortex ist ein weit verbreitetes und häufig angewandtes Modell zur Simulation und Erforschung von adaptiven Veränderungen im zentralen Nervensystem [56; 51; 52; 2; 6; 15; 43; 10] sowie von zellulären und molekularen Mechanismen während axonaler Degeneration und Reinnervation [36; 30; 10].
Entorhinale Läsionen bei der Ratte bewirken eine Deafferenzierung des ipsilateralen Gyrus dentatus. Es gibt hier auffallende Parallelen zur Reaktion des menschlichen zentralen Nervensystems auf eine Denervierung bei Alzheimerscher Erkrankung [15; 27]. Die Läsion des entorhinalen Kortex bei der Ratte kann als Modell für Aspekte neurodegenerativer Pathomechanismen bei Morbus Alzheimer [51; 6; 43; 2; 15; 52] und bei Temporallappenepilepsie [52] eingesetzt werden.
Die ECL unterbricht die Innervation des ipsilateralen hippokampalen Gyrus dentatus über den Tractus perforans. Im Tractus perforans kommt es zu einer anterograden Degeneration der Axone [34; 36; 10; 26], was in deren Terminationszone, der äußeren Molekularschicht des Gyrus dentatus, transneuronale Veränderungen hervorruft. In der Molekularschicht beobachtet man eine massive Degeneration von 80-90% der Synapsen [36; 10; 57], und das Gewebe der Molekularschicht schrumpft insgesamt [36]. Man beobachtet nach der Deafferenzierung bei den Dendriten GABAerger, Parvalbumin-positiver Neurone ein Anschwellen sowie eine Retraktion aus der Terminationszone des PP, und damit einen zahlenmäßigen Rückgang, der bestehen bleibt [39; 38]. Von der Denervierung betroffene Körnerzellen dagegen zeigten vorübergehende Veränderungen in ihrer Dendritenstruktur und entwickelten neue Synapsen mit aussprossensen unlädierten Afferenzen [39].
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Die Deafferenzierung der Molekularschicht des Gyrus dentatus bewirkt ein Aussprossen (sog. “Sprouting“) von Axonkollateralen unlädierter cholinerger septohippokampaler Afferenzen [4; 30; 35; 36; 58; 10; 27]. Daraufhin bilden sich neue Synapsen in der Körnerzellschicht des Gyrus dentatus [2; 39; 36; 61; 5; 10; 26; 33; 13; 30]. Jensen et al. (1994) haben dieses Phänomen des “Sprouting“ bereits drei Tage nach ECL beobachtet. Die reaktive Synaptogenese setzt ungefähr 10-14 Tage nach Läsion ein [57]. Es ist ein oft beobachtetes Phänomen, daß deafferenzierte Neurone durch überlebende afferente Systeme reinnerviert werden, die in der Nähe dieser deafferenzierten Gebiete terminieren [57].
Eine entorhinale Läsion ruft eine Vielzahl von Gliareaktionen im Hippokampus hervor, die ihren Teil zu den postläsionalen Veränderungen im deafferenzierten Gyrus dentatus beitragen [9; 13; 14; 16; 49; 10; 26; 51]. Diese Aktivierung ist durch eine Erhöhung der Zellzahlen und durch typische morphologische und funktionelle Veränderungen von Gliazellen gekennzeichnet.
Bereits innerhalb von 24 Stunden nach Läsion haben Fagan und Gage (1994) und Gehrmann et al. (1991) eine Mikrogliaaktivierung beobachtet. Die aktivierten Mikrogliazellen erscheinen dann durch Retraktion ihrer Fortsätze gerundet und entwickeln die Fähigkeit zu amöboider Bewegung, Phagozytose und Proliferation [9].
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Astrozyten reagieren im Vergleich zur Mikroglia erst später auf eine ECL [48; 14; 62; 63; 9; 16; 26]. Die Fortsätze der hypertrophischen Astrozyten werden dicker, und die Zellen weisen eine gesteigerte Immunreaktivität für glial fibrillary acidic protein (GFAP) [10], ein astrozytenspezifisches Intermediärfilamentprotein [44], auf. Diese sogenannte reaktive “Gliosis“ von Astrozyten [60; 49; 16; 13; 26; 45; 51] ist in der äußeren Molekularschicht ab Tag drei nach Läsion beobachtet worden, sie erreicht einen Höhepunkt vier bis sieben Tage nach Läsion und verschwindet ungefähr drei bis vier Wochen nach Läsion [13; 34; 49; 9; 10; 26].
In der denervierten Region wurde sowohl bei Mikrogliazellen [16; 10] als auch bei Astrozyten [30; 47; 5] eine Phagozytosetätigkeit beschrieben. Die aktivierten Gliazellen phagozytieren Nervenzellabfall, wie z.B. degenerierende Axonterminalen [3; 26].
An Gliazellen beobachtet man im Gyrus dentatus eine Expression von Adhäsionsmolekülen. Diese dienen wahrscheinlich dazu, immunkompetente Zellen zu rekrutieren und Zell-Matrix- und Zell-Zell-Interaktionen aufzubauen, und sind so in die Phagozytosevorgänge involviert [23]. Die Expression von Molekülen des major histocompatibility complex (MHC) auf Gliazellen als Zeichen einer Antigenpräsentation kann zu Aktivierung von immunkompetenten Zellen wie T- und B-Lymphozyten führen. Laut Fagan und Gage (1994) kommt es nach Läsion des Tractus perforans jedoch nicht zu einer vermehrten Expression von MHC II auf Mikrogliazellen im denervierten Gebiet.
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Humorale Faktoren scheinen die auf eine ECL folgende Gliareaktion sowie das cholinerge Sprouting zu beeinflussen. Es gibt z.B. Untersuchungen zum nerve growth factor (NGF), ciliary neurotrophic factor (CNTF), basic fibroblast growth factor (bFGF) und brain-derived neurotrophic factor (BDNF) [11; 31; 19; 29]. Gall et al. (1979) vermuteten, daß von degenerierenden Axonen und Terminalen Triggersubstanzen freigesetzt werden, die das Verhalten der Mikroglia beeinflussen. Man nimmt auch an, daß Interleukin-1, produziert von Mikrogliazellen, eine Signal- und Reaktionskaskade unter den Gliazellen auslösen kann. Diese könnte zum cholinergen Sprouting führen [9; 13; 16].
Es gibt unterschiedliche Meinungen darüber, ob nach ECL die Gliazellzahl im Gyrus dentatus überhaupt zunimmt [49; 14], und weiterhin, ob Gliazellen dann von außerhalb einwandern oder lokal proliferieren, oder ob beides zutrifft [49; 10]. Die von einigen Autoren beobachtete deutliche zahlenmäßige Zunahme der Gliazellen in der deafferenzierten Molekularschicht nach ECL [9; 13; 14; 34; 45] kann durch Migration von Gliazellen in das denervierte Areal hinein, durch erhöhte Detektierbarkeit oder durch ortsständige Gliazellproliferation [14; 10; 34; 16; 26; 45] begründet sein. Autoren haben eine Mikrogliaproliferation beschrieben, die 24 Stunden nach ECL einsetzt, zwei bis drei Tage nach Läsion ein Maximum erreicht und drei [14] bzw. acht Tage nach Läsion [16] auf Kontrollwerte zurückgeht. Fagan und Gage (1994) haben von einer Mikrogliaproliferation einen und drei Tage nach Läsion und von einer weniger ausgeprägten Astrozytenproliferation drei Tage nach Läsion berichtet.
Die beobachtete Zellzahlerhöhung und die Frage nach einer Gliazellproliferation ergaben den Anlaß zu einer genaueren experimentellen Untersuchung dieser Fragestellung.
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Das Ziel der vorliegenden Untersuchung war die präzise Quantifizierung der Zellzahlen und Proliferationsraten von Mikrogliazellen und Astrozyten in der inneren und äußeren Molekularschicht sowie in der Körnerzellschicht des ipsi- und kontralateralen Hippokampus der Ratte zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach einseitiger ECL. Hierbei sollte der Zeitraum von 3-100 Tagen nach ECL untersucht werden. Mit Hilfe der Immunhistochemie und der Methode mit Bromodeoxyuridin (BrdU) wurden morphologische und proliferatioskinetische Untersuchungen durchgeführt. Bei der Auswertung sollten die Daten der verschiedenen Überlebensstadien in Relation zu den Daten scheinoperierter Kontrolltiere gesetzt werden, um eine Aussage über die jeweiligen Veränderungen in den einzelnen postläsionalen Stadien machen zu können.
Zusammenfassend sollte zu folgenden Fragen Stellung genommen werden:
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