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Kapitel 2. THEORETISCHE GRUNDLAGEN

2.1 Proliferationskinetische Untersuchungen

Proliferationskinetische Untersuchungen dienen zum quantitativen Nachweis sich replizierender Zellen. Zum besseren Verständnis der zugrundeliegenden Idee soll zunächst der Ablauf des Zellzyklus veranschaulicht werden.

Der Zellzyklus (s. Abb. 2) besteht aus einzelnen, verschieden lang dauernden Phasen. Man unterscheidet die eigentliche Phase der Zellteilung, die Mitose, von der Interphase, der zwischen zwei Mitosen liegenden Arbeitsphase. Innerhalb der Interphase werden mindestens drei Abschnitte unterschieden: Direkt im Anschluß an eine Mitose befindet sich die gewöhnliche, teilungsfähige Zelle in einer je nach Zellart unterschiedlich langen Wachstumsphase, der G₁-Phase (G=gap, engl. Lücke). Die Zelle bildet in dieser Phase zelleigene Proteine und bereitet die S-Phase (Synthesephase) vor [32]. Bei Astrozyten beläuft sich die Dauer der G₁-Phase einschließlich des Übergangs von der G₀- zur G₁-Phase nach Langan und Slater (1991) auf zwölf Stunden. Die darauf folgende S-Phase dauert im Durchschnitt etwa sieben Stunden [32], für Astrozyten laut Langan und Slater (1991) 20 Stunden. Sie dient der Verdopplung der DNS, eine wichtige Voraussetzung für die Mitose. Anschließend folgt die prämitotische G₂-Phase, die in jedem Fall zu einer Mitose überleitet. Langan und Slater (1991) veranschlagen bei Astrozyten zehn Stunden für G₂-Phase und Mitose zusammen. Nach der Mitose kann eine Zelle auch in die G₀-Phase eintreten. Diese ist als eine sehr lange Periode beschrieben, aus der Zellen nur auf bestimmten Reiz hin wieder in die G₁-Phase einmünden [32; 28]. So kann der zeitliche Abstand von einer Mitose bis zur nächsten zwischen Stunden und Monaten variieren. Sogenannte postmitotische Zellen (PMZ), wie z.B. die meisten Nervenzellen, haben die Fähigkeit zur Proliferation gänzlich verloren [32]. Mikrogliazellen und Astrozyten befinden sich beim adulten Säuger normalerweise in der G₀-Phase und besitzen im adulten ZNS nur ein begrenztes proliferatives Potential [8]. Doch können sie unter geeigneten Bedingungen auf bestimmte Reize hin wieder in den Zellzyklus eintreten und proliferieren [28].

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Abb. 2: Zellzyklus (nach Leonhardt, 1990, Histologie, Zytologie und Mikroanatomie des Menschen, S.54, Abb. 35). Phasen des Zellzyklus: Mitose, G1-Phase, S=Synthesephase, G2-Phase; G0-Phase. PMZ=postmitotische Zelle.

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Aufgrund dieser Nachteile entwickelte Gratzner (1982) eine vorteilhaftere alternative Methode zum Nachweis proliferierender Zellen: Die Inkorporation und den immunzytochemischen Nachweis von 5‘-Bromo-2‘-deoxyuridin (BrdU). BrdU ist ein synthetisches Thymidinanalogon (s. Abb. 3), das in gleicher Weise wie [³H]-Thymidin dem Thymidinstoffwechsel (Thymidinkinase) unterliegt und in der S-Phase des Zellzyklus kompetitiv anstelle von Thymidin in die Zell-DNS eingebaut wird (s. Abb. 4). Es leitet sich von Uridin ab, welches anstelle des Thymidins der DNS in der RNS vorkommt.

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Abb. 3: Strukturformeln von BrdU und Thymidin. Die analogen Moleküle bestehen beide aus einer Desoxyribose und unterscheiden sich lediglich in ihrem Basenrest. Thymidin setzt sich aus einer Desoxyribose und einem Thyminbasenrest zusammen. BrdU besteht aus Desoxyribose mit einem Uridinrest, der an Stelle 5 im Ring einen Bromrest besitzt.

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Abb. 4: Schematische Darstellung von Desoxyribonukleinsäure (DNS) ohne und mit Einbau von BrdU. BrdU nimmt kompetitiv den Platz von Thymidin in der DNS ein.

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Um bei der Immunhistochemie eine ausreichende Aufnahme von Antikörpern ins Gewebe zu gewährleisten, muß der histologische Schnitt möglichst dünn sein, da die Eindringtiefe der Antikörper begrenzt ist. Zweitens muß der Schnitt permeabilisiert und das Zytoskelett aufgelockert werden, damit Anti-BrdU in ausreichendem Maß in den Zellkern und in die DNS gelangen kann.

Bei der Methode mit [³H]-Thymidin besteht das Problem einer nur sehr schwachen Penetration von -Strahlung im Gewebe. Das erschwert die Detektion und Auswertung, da somit nur die an der Oberfläche der histologischen Schnitte gelegenen proliferationsaktiven Zellen registriert werden können. Bei übereinstimmenden Resultaten in vergleichenden Studien hat die BrdU-Methode gegenüber der Autoradiographie zahlreiche Vorteile (einfachere Handhabung, weniger Zeit- und Kostenaufwand, Vermeidung von Radioaktivität bei den Experimenten, s.o.) [54; 53].

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2.2 Grundlagen der Immunhistochemie

Die Immunhistochemie macht sich die spezifische Bindung von Antikörpern, die gegen bestimmte Gewebs- bzw. Zellantigene gerichtet sind, zunutze. Dabei werden meist mehrere Antikörper nacheinander verwendet: Der primäre Antikörper ist gegen das dazustellende Antigen (z. B. BrdU) gerichtet. Der Sekundärantikörper richtet sich gegen das F_c-Fragment von Immunglobulinen der Tierspezies, in welcher der Primärantikörper hergestellt worden war. In Abb. 5 ist das Schema der Immunhistochemie dargestellt.

2.2.1.1 Histochemische Darstellung von Mikrogliazellen

Mikrogliazellen können mit Griffonia simplicifolia Isolektin B₄ (IB₄) markiert werden, einem Zellmembranprotein aus der Familie der Lektine, das aus der Pflanzenart Griffonia simplicifolia gewonnen wird. Es weist eine hohe Bindungsaffinität zu Zellen des mononukleären Phagozytensystems (MPS), also auch zu Mikrogliazellen, auf. Das in der vorliegenden Studie verwendete IB₄ ist mit Biotinmolekülen konjugiert und kann wie ein biotinylierter Sekundärantikörper mit der ABC-Methode nach Hsu et al. (1981) weiterentwickelt werden (s.u.).

2.2.1.2 Immunhistochemische Darstellung von Astrozyten

Der hierfür verwendete Primärantikörper richtet sich gegen glial fibrillary acidic protein (GFAP), ein astrozytenspezifisches Zytoplasmaprotein und Bestandteil des Zytoskeletts. Dieser Antikörper stammt aus dem Kaninchen, deshalb verwendet man einen Sekundärantikörper, der gegen das F_c-Fragment von Kaninchen-Immunglobulinen gerichtet ist.

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2.2.1.3 Immunhistochemische Darstellung BrdU-positiver Zellen

In dieser Arbeit wurde eine Mischung von drei verschiedenen in der Maus synthetisierten Primärantikörpern gegen BrdU verwendet. Der biotinylierte Sekundärantikörper ist in diesem Fall gegen Maus-Immunglobulin gerichtet.

2.2.1.4 Die nach Hsu et al. modifizierte ABC-Methode

Bei der von Hsu et al. (1981) entwickelten sogenannten IBRAB-Technik (indirect bridged avidin-biotin technique) wird nach der Inkubation mit einem biotinylierten sekundären Antikörper nacheinander Avidin und Biotin-assoziierte Peroxidase zugegeben oder zeitsparend als vorgefertigter Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex (ABC) zugefügt.

Avidin ist ein im Hühnereiweiß enthaltenes Glykoprotein (MG 68.000) mit einer sehr hohen Affinität zu dem sehr kleinen Molekül Biotin (=Vitamin H) (Dissoziationskonstante 10-15 M). Avidin hat vier Bindungsstellen für Biotin und bildet im Experiment eine Brücke zwischen einem biotinylierten Antikörper und einem Peroxidase-assoziierten Biotinmolekül (sogenannte BRAB-Technik nach Guesdon et al., 1979: Bridged avidin-biotin technique) beziehungsweise zwischen biotinyliertem Griffonia simplicifolia Isolektin B₄ und enzymassoziiertem Biotin. Man entwickelt die Präparate schließlich mit einem Substrat des Enzyms Peroxidase, z.B. mit Diaminobenzidin (DAB). Bei der Darstellung der Mikroglia und der Astrozyten wird DAB verwendet, das an den peroxidaseaktiven Stellen des Gewebes mit Wasserstoffperoxid zu einem wasserunlöslichen braunen Produkt reagiert. Bei der BrdU-Immunhistochemie wird die DAB-Lösung mit Nickelammoniumchlorid und Kobaltchlorid angesetzt, was eine blauschwarze Farbreaktion hervorruft. Also ergeben sich im doppelt positiven Fall bei der Doppel-Immunhistochemie braun angefärbte Mikrogliazellen bzw. Astrozyten mit blauschwarzen Zellkernen.

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Abb. 5: Modell der Immunhistochemie. Der Primärantikörper (z.B. Rabbit-anti-GFAP) bindet mit seinem F_ab- Anteil spezifisch an ein Gewebsantigen (z.B. GFAP). Der biotinylierte Zweitantikörper (z.B. goat-anti-rabbit-biot.) bindet an das F_c-Fragment des aus dem Kaninchen (rabbit) stammenden Erstantikörpers. Zusammen mit dem Biotinrest am F_c-Fragment des Sekundärantikörpers kann sich nun ein Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex (ABC) ausbilden, der mit Diaminobenzidin zu einem farbigen Produkt reagieren kann. Auf diese Weise kann man Gewebsantigene (z.B. GFAP) farbig sichtbar machen.

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