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Kapitel 3. MATERIAL UND METHODEN

3.1 Versuchstiere und Versuchstierhaltung

In dieser Studie wurde mit 24 ausgewachsenen männlichen Wistar-Albinoratten (Gewicht: 250-350 g) gearbeitet, die unter Standard-Laborbedingungen gehalten wurden. Die Zucht und Haltung der Tiere sowie die Durchführung der entorhinalen Läsion und die Tötung der Tiere erfolgte im Tierstall des Institutes für Anatomie der Charité Berlin. Die Tiere waren prä- und postoperativ gruppenweise bei einer Raumtemperatur von etwa 20°C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 40-50% in Käfigen untergebracht. Als Nahrung erhielten die Tiere Preßfutter und Wasser.

3.2 Zusammensetzung des Anästhetikums

20,1 ml des verwendeten Betäubungsmittels enthalten:

- 10 ml KetanestR	Fa. Parke-Davis
(Ketamin-HCl 50 mg/ml)
- 1,2 ml RompunR	Fa. Bayer
(Xylazinhydrochlorid 20 mg/ml)
- 0,5 ml VetranquilR	Fa. Sanofi-Ceva
(Acepromazinmaleat 13,56 mg/ml, Chlorbutanol 5,00 mg/ml)
- 8,4 ml Aqua ad inj.	Fa. Braun

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3.3 Zusammensetzung der Fixativflüssigkeit

Ein Liter der für die transkardiale Perfusion und für die Nachfixierung der Gehirne verwendeten Fixativflüssigkeit enthalten:

- 40 g Paraformaldehyd	Fa. Merck
- 500 ml 0,2 M Phosphatpuffer	Fa. Merck
- 500 ml Aqua bidest

Diese Rezeptur ergab eine 4% Paraformaldehydlösung in 0,1 M PB mit einem pH-Wert von 7,4.

3.4 Zusammensetzung des verwendeten Puffers

3.4.1 PBS

Beim Schneiden der Gehirne am Vibratom sowie für die Immunhistochemie wurde PBS folgender Zusammensetzung verwendet:

- 2,925 g Na2HPO4 x 2 H2O	Fa. Merck
- 0,49 g KH2PO4	Fa. Merck
- 16,00 g NaCl	Fa. Merck

ad 2000 ml Aqua bidest.

3.4.2 Spülpuffer

Der Spülpuffer wurde folgendermaßen hergestellt:

- 900 ml PBS
- 1,8 ml Triton 0,1 %	Fa. Sigma
- 100 ml Tris-Puffer (C4H11NO3) 0,05 M, pH 7,6	Fa. Merck, Artikel-Nr. 8382

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3.5 Chemikalien für die morphologische Untersuchung

3.5.1 Darstellung von Mikroglia

- Isolektin B4 aus Griffonia Simplicifolia (biotinyliert)	Fa. Sigma, L 2140
- Avidin-Biotin-Komplex Elite (ABC)	Fa. Camon, PK-6100
- 3‘,3‘Diaminobenzidin (DAB)	Fa. Sigma, D 5637
- Triton 10%	Fa. Sigma, T 8787
- H2O2 30%	Fa. Merck
- PBS pH 6,8
- PBS

3.5.2 Darstellung von Astrozyten

Primärantikörper:

- Kaninchen-anti-GFAP, polyklonal

Fa. Biotrend, GA 1171

Sekundärantikörper (biotinyliert):

- Ziege-anti-Kaninchen	Fa. Vector, BA-1000
- Avidin-Biotin-Komplex Elite (ABC)	Fa. Camon, PK-6100
- 3‘,3‘Diaminobenzidin (DAB)	Fa. Sigma, D 5637
- Normales Ziegenserum	Fa. Vector, S-1000
- Natrium-Acid (NaN3 10%)	VEB Sprengstoffwerk Schönbeck
- Triton 10%	Fa. Sigma, T 8787
- H2O2 30%	Fa. Merck
- PBS

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3.6 Chemikalien für die proliferationskinetische Untersuchung

5‘-Bromo-2‘-deoxyuridin

Fa. Sigma, B 5002

Primärantikörper:

- Maus-anti-BrdU (IgG1), Klon Bu20a	Fa. Dako, M 744 (1:400)
- Maus-anti-BrdU (IgG1), Klon IIb5	Fa. Monosan, MON 8003 (1:100)
- Maus-anti-BrdU (IgG1), Klon 2B1	Fa. Immunotech, 1517 (1:900)

Sekundärantikörper (biotinyliert):

- Pferd-anti-Maus	Fa. Vector, BA-2000
- Proteinase K	Fa. Sigma P 0390
- Avidin-Biotin-Komplex Elite (ABC)	Fa. Camon, PK-6100
- 3‘,3‘Diaminobenzidin (DAB)	Fa. Sigma, D 5637
- Normales Pferdeserum	Fa. Vector, S-2000
- 2N HCl	Fa. Merck
- PBS
- Nickelammoniumchlorid 1%	Fa. Aldrich, 33,485-5, Milwaukee
- Cobaltchlorid (CoCl2) 1%	Fa. Sigma, C 2644
- H2O2 30%	Fa. Merck
- PBS

3.7 Einteilung der Versuchstiergruppen

Aus 24 Versuchstieren wurden sechs Gruppen à vier Tieren gebildet:

Gruppe 1: Kontrollgruppe, d. h. Schein-Operation mit Tötung kurz danach

Gruppe 2: Entorhinale Läsion, Tötung nach 3 Tagen

Gruppe 3: Entorhinale Läsion, Tötung nach 7 Tagen

Gruppe 4: Entorhinale Läsion, Tötung nach 10 Tagen

Gruppe 5: Entorhinale Läsion, Tötung nach 30 Tagen

Gruppe 6: Entorhinale Läsion, Tötung nach 100 Tagen

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3.8 Versuchsablauf

Abgesehen von den Kontrolltieren wurde an allen Tieren eine einseitige elektrolytische Läsion des entorhinalen Kortex vorgenommen. Die Versuchstiere erhielten 3-100 Tage nach der Läsion Injektionen von BrdU und wurden eine Stunde später durch transkardiale Perfusion getötet. Danach wurden ihre Gehirne untersucht.

3.8.1 Entorhinale Läsion

Für die stereotaktische Operation wurden die Tiere mit 2 ml des oben angeführten ketaminhaltigen Anästhetikums betäubt. Nach dem Aufbohren der Schädelkalotte wurde mittels eines standardisierten Elektrokoagulators nach Kopf (Olympus OMK 1) eine elektrolytische Läsion des entorhinalen Kortex einer Hirnhemisphere vorgenommen (s. Abb. 6). In diesem Experiment wurde stets der linksseitige EC lädiert. Die Klinge des Koagulationsmessers wurde dabei vertikal bis an die Schädelbasis hinabgesenkt. Es wurden folgende von Lambda gemessene Koordinaten benutzt (nach Paxinos und Watson, 1986): anterior-posterior +1,2 / lateral +3. Ob die entorhinale Läsion vollständig war, konnte man makroskopisch beim Schneiden des Gehirns am Vibratom sowie mikroskopisch beim Vergleich des lädierten entorhinalen Kortex mit dem der unlädierten kontralateralen Hirnhemisphäre überprüfen. Bei den Kontrolltieren hingegen erfolgte keine elektrolytische Läsion, es wurde lediglich die Schädeldecke unter Anästhesie aufgebohrt.

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Abb. 6: Operationssitus. Kopf der Ratte mit eröffneter Schädelkalotte bei den ab Lambda gemessenen Koordinaten für den entorhinalen Kortex. =Lambda.

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3.8.2 Applikation von 5‘-Bromo-2‘-deoxyuridin und transkardiale Perfusion

Nach Ablauf der jeweiligen postoperativen Überlebenszeiträume der sechs Versuchstiergruppen bekam jedes Tier 100 mg Bromodeoxyuridin pro kg Körpergewicht intraperitoneal injiziert. Eine Stunde später erhielten die Tiere 2 ml des ketaminhaltigen Anästhetikums. Sie wurden thorakotomiert, und durch die linke Herzkammer wurde ein Perfusionssystem installiert, dessen Kanüle in der Aorta ascendens lag. Der rechte Herzvorhof wurde mit der Schere eröffnet, damit die Perfusionsflüssigkeit abfließen konnte. Durch Abklemmen der Bauchaorta konnte man die Perfusion auf die obere Körperhälfte beschränken. Jedes Tier wurde mit ca. 150 ml isotoner Kochsalzlösung (Fa. Fresenius) entblutet. So wurde das Gefäßsystem von für das Experiment hinderlichen Blutbestandteilen gereinigt. Anschließend wurden die Tiere mit ca. 400 ml der paraformaldehydhaltigen Fixativflüssigkeit perfundiert. Die Gehirne wurden aus den Schädeln entfernt und über Nacht in Paraformaldehydlösung nachfixiert. Darauf wurden sie mit einem Vibratom in 60 µm dicke horizontale Scheiben geschnitten.

3.8.3 Immunhistochemie

Um Zellkerne, die BrdU enthalten, darzustellen und diese mit Mikrogliazellen (IB₄) bzw. Astrozyten (GFAP) zu kolokalisieren, wurden immunhistochemische Doppelfärbungen durchgeführt.

Der für die Mikrogliauntersuchungen bestimmte Teil der Hirnschnitte wurde mit IB₄ und mit gegen BrdU gerichteten Antikörpern doppelgefärbt, der andere Teil mit Antikörpern gegen den Astrozytenmarker GFAP und Antikörpern gegen BrdU. Dazu wurde die nach Hsu et al. (1981) modifizierte ABC-Methode angewandt (s. 2.2). Die Darstellung der Mikrogliazellen bzw. der Astrozyten erfolgte zeitlich vor der BrdU-Immunhistochemie. Während der gesamten Histochemie flottierten die Hirnschnitte frei in mit Reagens gefüllten Schälchen.

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3.8.3.1 Darstellung von Mikroglia durch Griffonia simplicifolia Isolektin B₄

Die Hirnschnitte wurden für 24 Stunden in biotinyliertem IB₄ (1:20), Triton (1:200) und PBS (pH 6,8) bei 4°C inkubiert. Nach drei zehnminütigen Spülgängen mit dem unter 3.4.2 beschriebenen Spülpuffer erfolgte eine Inkubation in Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex (Reagens A 1:52 und Reagens B 1:52 in PBS) für zwei Stunden. Es folgten weitere Spülungen, bevor die markierten Mikrogliazellen bei fünf- bis zehnminütiger Inkubation in einer DAB-Lösung (0,05% 3’,3’Diaminobenzidin und 0,001% H₂O₂ in PBS) braun angefärbt wurden.

3.8.3.2 Immunhistochemische Darstellung von GFAP

Für die Darstellung von Astrozyten wurden die Hirnschnitte zunächst für 30 Minuten mit normalem Ziegenserum (NGS, 1:10 in PBS) behandelt, um unspezifische Reaktionen zu vermeiden. Dann wurden die Schnitte für 48 Stunden bei 4°C dem vom Kaninchen stammenden Primärantikörper gegen GFAP (1:1000), mit Natrium-Azid (1:100), NGS (1:100) und Triton (1:200) in PBS, ausgesetzt. Nach einem Spülvorgang wurden die Schnitte für zwei Stunden bei 4°C im biotinylierten Sekundärantikörper, der gegen Kaninchenantigene gerichtet war (1:250), Triton (1:200) und PBS inkubiert. Nach dem nächsten Spülgang folgte die Inkubation mit dem Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex und danach die Detektion der Astrozyten mittels DAB-Lösung.

3.8.3.3 Immunhistochemische Darstellung von BrdU

Nach der histochemischen Anfärbung der Mikrogliazellen bzw. der Astrozyten wurde die zweite Immunfärbung durchgeführt, um nachzuweisen, ob die DAB-markierten Gliazellen zur Proliferation angesetzt und somit BrdU inkorporiert hatten. Hierfür wurden die Schnitte in 2N Salzsäure für 20 Minuten bei 37°C inkubiert, dann gespült und für 25-30 Minuten bei 4°C einer 0,03% Proteinase K-Lösung in PBS ausgesetzt, ehe erneut gespült wurde. Im nächsten Schritt wurden die Schnitte mit normalem Pferdeserum (1:10) in PBS für 30 Minuten bei Raumtemperatur behandelt, und ohne

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3.8.3.4 Negativkontrolle ohne Primärantikörper gegen BrdU

Zum Ausschluß unspezifischer Reaktionen wurde eine Negativkontrolle durchgeführt, indem man bei der immunhistochemischen BrdU-Färbung auf den Primärantikörpercocktail verzichtete. Alle anderen Färbeschritte liefen dabei in analoger Weise ab. Dabei zeigte sich bei den Negativkontrollschnitten keine charakteristische Farbreaktion. Eine unspezifische Anfärbung von Gewebe durch die übrigen Reagenzien war somit ausgeschlossen.

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3.9 Morphologische und proliferationskinetische Auswertung

3.9.1 Gesichtsfelder

Für die Auswertung wurde ein Mikroskop der Marke Olympus verwendet. Die Auszählung wurde bei 40-facher Vergrößerung durchgeführt. In jedem Hirnschnitt wurde der Gyrus dentatus sowohl der lädierten als auch der unlädierten Seite in sechs Gesichtsfelder unterteilt (s. Abb. 7), um nach der Auswertung von einer möglichst großen Anzahl an Einzelwerten auszugehen. Jedes Gesichtsfeld hatte einen Durchmesser von etwa 0,8 mm, wobei ein Ausschnitt aus dem gesamten Gyrus dentatus mit Molekularschicht und Körnerzellschicht zu überblicken war.

3.9.2 Auswertungskriterien und Auszählung der Gesichtsfelder

Zur Auswertung eigneten sich nur Präparate, bei denen beide Hippokampi intakt waren und sich auf beiden Seiten problemlos sechs Gesichtsfelder abgrenzen ließen. In die Zählungen wurden nur Zellen einbezogen, die in der Schnittebene in ihrem Zelleib getroffen waren, bei denen also ein potentiell BrdU-positiver Zellkern zu sehen gewesen wäre. Als BrdU-positiv galten alle Zellen, bei denen man eine deutliche blauschwarze Anfärbung ihres Zellkernes erkennen konnte (s. Abb. 8).

In jedem Gesichtsfeld wurden erstens alle Mikrogliazellen bzw. Astrozyten ausgezählt. Zweitens die Anzahl der doppelt positiv angefärbten Zellen, die braun als Gliazellen gekennzeichnet waren und zugleich einen blauschwarzen Zellkern als Nachweis einer Inkorporation von BrdU und somit eines stattgefundenen Eintritts in die S-Phase des Mitosezyklus aufwiesen. Die Auszählungen erfolgten dabei für die äußere und innere Molekularschicht sowie für die Körnerzellschicht der Gyrus dentatus getrennt. Bei unlädierten Kontrolltieren sowie auf der zur Läsion kontralateralen Hirnseite bei lädierten Tieren ließ sich die äußere von der inneren Molekularschicht meist nicht eindeutig abgrenzen, so daß in diesen Fällen lediglich Werte für die gesamte Molekularschicht ermittelt wurden.

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Abb. 7: Methode der Zellzählung. Unterteilung des Gyrus dentatus (DG), hier auf der lädierten Seite, in sechs Gesichtsfelder. Separate Auszählung der gesamten Gliazellen und der BrdU-positiven Gliazellen in der äußeren (OML) und inneren (IML) Molekularschicht sowie der Körnerzellschicht (GCL). ECL=entorhinale Kortexläsion. In der Vergrößerung sind BrdU-positive und BrdU-negative Gliazellen am Zellkern zu erkennen.

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Abb. 8: Beispiel für doppelt positiv angefärbte Gliazellen. a: IB₄- und BrdU-positive Mikrogliazellen in der äußeren Molekularschicht des ipsilateralen Gyrus dentatus drei Tage nach Läsion, b: GFAP- und BrdU-positive Astrozyten in der äußeren Molekularschicht des ipsilateralen Gyrus dentatus sieben Tage nach Läsion. Lange Pfeile: Zelleib; kurze Pfeile: Zellkern. Vergrößerung: x 100.

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3.10 Statistische Auswertung

Die gewonnenen Daten wurden mit Microsoft Excel bzw. Star Calc erfaßt. Die Zellzahl, die Anzahl doppelgefärbter Zellen und der Labeling Index (LI, Verhältnis der Anzahl doppelgefärbter Zellen zur Gesamtzellzahl, s. 4.1.2 c) der einzelnen Stadien wurden mit der Kontrolle verglichen. Außerdem erfolgte bei allen lädierten Stadien ipsilateral ein Vergleich der äußeren (OML) mit der inneren Molekularschicht (IML). Mit Hilfe des Statistikprogrammes Statview wurden die Daten zunächst per Kolmogoroff-Smirnoff-Normalverteilungstest untersucht. Da nicht alle Daten normalverteilt waren, erfolgte die statistische Auswertung durch den nichtparametrischen Mann-Whitney-U-Test.

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