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Kapitel 5. DISKUSSION

5.1 Fragestellung und Ziel

Zu Beginn der Arbeit stellte sich die interessante Frage, ob und wann Gliazellen im Hippokampus als Reaktion auf eine Deafferenzierung proliferieren. Mittels BrdU-Methode und Doppelimmunhistochemie ließen sich proliferierende Zellen spezifisch und in Einzelzellzuordnung als Mikrogliazellen beziehungsweise Astrozyten identifizieren. Dabei zeigte sich, daß die Mikroglia aktiviert wird und drei Tage nach ECL proliferiert. Zehn Tage nach Läsion war ihre Proliferationsaktivität bereits wieder auf Kontrollwerte zurückgegangen. Die stark erhöhte Mikrogliazellzahl in der deafferenzierten Region blieb über längere Zeit bestehen und nahm bis 30 Tage nach Läsion nur langsam ab. Die beobachtete Astrozytenproliferation erreichte sieben Tage nach Läsion ihre höchsten Werte.

Im Modell der ECL wurde bereits von anderen Autoren Mikrogliaproliferation im Hippokampus mit einem Maximum zwei bis drei Tage nach Läsion beschrieben [14; 10]. Die in den Experimenten gewählten Zeiträume umfaßten bei Gall et al. (1979) 20, 30, 50 und 80 Stunden nach Läsion, bei Fagan und Gage (1994) 24 und 72 Stunden. Eine später als vier Tage nach Läsion stattfindende Gliazellproliferation, etwa die von Astrozyten, hätte man in diesen Studien nicht entdecken können, da dort nur die ersten vier Tage nach ECL untersucht wurden. Meist fand dabei die nachteiligere Methode der [³H]-Thymidin-Autoradiographie zur Erfassung proliferierender Zellen Verwendung. Autoren anderer Studien haben in dieser Fragestellung gar keinen Proliferationsmarker benutzt [26]. Lynch et al. (1975) haben die Vermutung einer Proliferation nur anhand von Zellzählungen belegt.

Ziel der vorliegenden Arbeit war deshalb eine exakte Quantifizierung der Zellzahlen und Proliferationsraten von Mikrogliazellen und Astrozyten in der Molekularschicht (ML) sowie der Körnerzellschicht (GCL) des hippokampalen Gyrus dentatus beider Hirnhemisphären mit Hilfe der etablierten BrdU-Methode, über einen Zeitraum von bis zu 100 Tagen nach einseitiger ECL.

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5.2 Interpretation der eigenen Ergebnisse

5.2.1 Rolle von Proliferation und Migration

Die regionsspezifische Zunahme von Gliazellzahlen kann Folge der beobachteten Proliferationsaktivität sein. Zusätzlich ist zelluläre Migration eine mögliche Ursache für Zellzahlerhöhungen. Die sehr rasche proliferative Reaktion der Mikroglia drei Tage nach Läsion paßt zu dem ebenfalls frühen Zeitpunkt der Mikrogliaaktivierung nach ECL. Analog dazu korreliert die Astrozytenproliferation im Gyrus dentatus nach ECL zeitlich mit der beschriebenen, im Vergleich zur Mikroglia später einsetzenden Astrogliaaktivierung. Der initiale Abfall der Astrozytenzahlen drei und sieben Tage nach Läsion und die Zunahme der Astrozytenproliferation in der GCL ohne wesentlichen begleitenden Zellzahlanstieg könnte dafür sprechen, daß in der GCL proliferierende Astrozyten in hiläre Regionen und in die benachbarte ML migrieren, wo sie zum signifikanten Zellzahlanstieg beitragen. Bei der Zunahme der Gliazellzahlen im deafferenzierten Areal spielt nach der Vermutung einiger Autoren Proliferation eine Rolle [14; 9; 10; 13]. Manche Autoren glauben jedoch, daß Astrozyten bei Läsionsgeschehen eher aus anderen Hirnregionen einwandern, als daß sie selbst proliferieren [8]. Migration von Mikrogliazellen und Astrozyten auf den Reiz der Deafferenzierung hin kann wie auch ortsständige Proliferation zur Zunahme der Zellzahl beitragen [9; 10; 26].

5.2.2 Astrozyten-Zellzahlenanstieg und GFAP-Reaktivität

Die Beobachtung, daß Astrozyten während ihrer Aktivierung stärker GFAP-reaktiv werden als im ruhenden Zustand [41], könnte eine relative Zellzahlerhöhung vortäuschen. Schwach GFAP-reaktive Astrozyten im Ruhestadium könnten bei der Zählung leicht übersehen werden, was zu falsch-niedrigen Werten in Ruhestadium führen kann. Allerdings ist die GFAP-Expression bei proliferiernder Astroglia verstärkt [28]. Neben dieser unechten Zellzahlerhöhung kann es durch die nachgewiesene Proliferation und durch Migration zu einer tatsächlichen Astrozytenzunahme kommen.

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5.2.3 Abnahme der Astrozytenzahlen in den frühen Stadien

In den Stadien drei und sieben Tage nach Läsion war eine Abnahme der Astrozytenzellzahlen sowohl in der ML (abgesehen von ipsilateral 3 dpl) als auch in der GCL auf beiden Seiten zu verzeichnen. Eine derartige Beobachtung wurde bisher nicht beschrieben, obwohl z.B. quantitative Untersuchungen über GFAP mRNA in der Zeit nach ECL existieren [56]. Ein Grund für diesen frühen Zellzahlenabfall kann eine Migration von Astrozyten aus der GCL in andere Areale sein. Eine andere mögliche Erklärung wäre, daß eine Subpopulation von Astrozyten kurz vor der proliferationsaktiven Phase, welche sich nach den vorliegenden Ergebnissen etwa 10-30 Tage nach Läsion hinzieht, nur schwach reaktiv für GFAP ist. Eine signifikante Proliferationsaktivität wurde aber nur in der ipsilateralen ML beobachtet.

5.2.4 Beteiligung humoraler Faktoren an der Gliareaktion

Die Mechanismen, die an der Proliferationsreaktion beteiligt sind, sind noch nicht vollständig bekannt. Man diskutiert Triggersubstanzen, die von degenerierenden Axonen und Terminalen freigesetzt werden und das Verhalten der Mikroglia beeinflussen [14]. Eine Proliferation dieser Zellen könnte von humoralen Faktoren oder metabolischen Substanzen in Gebieten mit Terminalendegeneration hervorgerufen werden.

Proliferierende, aktivierte Mikroglia könnte in der Lage sein, neuronalen Zellabfall zu phagozytieren [9; 3]. Es gibt die Hypothese, daß infolge entorhinaler Läsion die phagozytierende, aktivierte Mikroglia zur Sekretion von Interleukin-1 (IL-1) in der Lage ist, dessen Konzentration im deafferenzierten Hippokampus einen bis drei Tage nach Läsion ein Maximum erreicht [9]. Das würde gut zu der Beobachtung passen, daß zum Zeitpunkt von drei Tagen nach ECL die Proliferation von Mikrogliazellen maximal ist.

IL-1 ist ein astrozytenstimulierender Faktor und wird als einer der Effektoren für die nach ECL beobachtete Astrozytenaktivierung, also Hypertrophie und Anstieg der

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Aktivierte Astrozyten sezernieren in vivo neurotrophische Faktoren, die das Überleben und das axonale Wachstum von Neuronen unterstützen. Die Aktivität von NGF steigt nach Läsionen des Tractus perforans im DG an [13; 16]. Fagan et al. (1997) konnten hingegen keine Veränderung bei der NGF-mRNA nach ECL feststellen. Eine Hochregulation von CNTF auf Astrozyten der ipsilateralen OML beobachtete man etwa drei bis vierzehn Tage nach ECL, mit einem Maximum sieben Tage nach Läsion [31]. Auch wurde eine vermehrte Expression von bFGF auf Astrozyten und auf extrazellulärer Matrix sowie ein Anstieg der FGF-2-mRNA bei Astrozyten nach ECL beschrieben [19; 11]. Eine Veränderung beim BDNF konnte man bis zehn Tage nach Läsion nicht feststellen [29].

Besonders für den NGF wird eine wichtige Rolle beim cholinergen Sprouting postuliert. Proliferierende, aktivierte Astrozyten könnten über die Sekretion humoraler Faktoren das Aussprossen und Einwachsen cholinerger und katecholaminerger Nervenfasern bewirken, welche auf NGF ansprechen. Dies könnte den Beginn des cholinergen Sprouting als Antwort auf eine Deafferenzierung erklären [9; 13; 16].

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5.2.5 Unerwartet starke Reaktionen in der Körnerzellschicht

Die signifikanten Zellzahlanstiege 3-30 Tage nach Läsion und die signifikante Proliferationsaktivität ipsilateral drei Tage nach Läsion bei der Mikroglia in der Körnerzellschicht waren eine unerwartete Beobachtung. Eine signifikante Gliaaktivierung in nicht direkt deafferenzierten Regionen wurde bisher noch nicht beschrieben. Bei Körnerzellen führt eine Deafferenzierung zu beträchtlichen transneuronalen Veränderungen in ihrer Dendritenstruktur [7] und in ihren Efferenzen über das Moosfasersystem [38]. Transneuronale Veränderungen im Moosfasersystem könnten ein adäquater Stimulus für Gliazellaktivierung sein, welche schließlich eine proliferative Reaktion und Zellzahlerhöhng in einer nicht direkt denervierten Region induzieren könnte. Bei den Astrozyten kommt es in der GCL zu einer signifikant gesteigerten Proliferation ohne darauffolgende Zellzahlerhöhung. Das könnte bedeuten, daß Astrozyten aus der GCL in andere Regionen, etwa in den Hilus oder die ML, auswandern.

5.2.6 Kontralaterale Aktivierung

Kontralateral zur ECL wurde bei den Mikrogliazellen eine Zellzahlerhöhung und bei den Astrozyten eine verstärkte Proliferationsaktivität festgestellt. Diese kontralaterale Aktivierung, die insgesamt meist geringer ausgeprägt war als ipsilateral, rührt wahrscheinlich von einer Läsion des gekreuzten Tractus perforans her (s. 1.1.2, bzw. [1]). Der über eine Kommissur gekreuzt verlaufende Anteil des Tractus perforans enthält weniger Fasern als der ipsilateral verlaufende Hauptanteil. Somit war im kontralateralen DG eine Gliaaktivierung von geringerem Ausprägungsgrad als ipsilateral zu erwarten.

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5.3 Beurteilung der BrdU-Methode für proliferationskinetische Untersuchungen

Die BrdU-Methode bietet mehrere Vorteile gegenüber der Methode der [³H]-Thymidin-Autoradiographie (s. 2.1). Das sind die geringeren Kosten, der geringere Zeitaufwand und die Vermeidung von Radioaktivität bei den Experimenten [54; 53]. Vor allem aber auch die weitaus einfachere Handhabung und dazu die Möglichkeit einer spezifischen, systematischen Einzelzellzuordnung bei der Auswertung der Ergebnisse.

Bei Negativkontrollen (s. 3.8.3 d) erwies sich die Spezifität der BrdU-Methode als sehr hoch. Unter Verzicht auf den Primärantikörpercocktail gegen BrdU war hier keinerlei unspezifische Farbreaktion nachweisbar. Die Anwendung der nach Hsu et al. (1981) modifizierten ABC-Methode bei der BrdU-Immunhistochemie macht diese zu einem gut durchführ- und reproduzierbaren quantitativen Nachweisverfahren für proliferierende Zellen im histologischen Hirnschnitt.

5.4 Ausblick

Mit dieser Arbeit wurde die Proliferation von Mikrogliazellen und Astrozyten im deafferenzierten Gyrus dentatus der Ratte nach Läsion des entorhinalen Kortex quantitativ untersucht und dokumentiert. Die Mikrogliaproliferation mit Maximum drei Tage nach Läsion und die Astrozytenproliferation mit ihrem Maximum sieben Tage nach Läsion können zum Verständnis der Vorgänge und Mechanismen bei anterograder Degeneration beitragen. Das führt zu der Frage, was die Bedeutung der Gliazellaktivierung und -proliferation in diesem Modell sein könnte.

Es gibt kontroverse Meinungen, ob durch eine Gliaaktivierung induzierte Veränderungen sich generell zuträglich oder nachteilig für eine Gewebsregeneration auswirken [8; 10; 17; 20; 41; 55]. Die Glianarbe (engl. “glial scar“) könnte durch Stabilisierung des Gewebes und durch Abgrenzen von nekrotischen Arealen zur Wundheilung beitragen [8; 12] und als Leitschiene für das axonale Wachstum dienen. Astrozyten sind in der Lage zur Sekretion von Proteasen, um Zellabfall zu

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Andererseits kann eine Glianarbe eine Barriere darstellen, die das Auswachsen von Neuriten behindert [8; 17; 37]. Die astrozytären Proteasen können regenerierendes Gewebe beeinträchtigen [8]. Und Astrozyten exprimieren Moleküle, die für die axonalen Regenerationsprozesse abträglich sind [50]. Mikrogliazellen setzen neuronotoxische Faktoren frei, welche die Gliazellen selbst nicht beeinträchtigen [17].

Es wäre interessant zu sehen, welche Auswirkungen eine Suppression von Gliaproliferation auf den Regenerationsprozeß hätte. Die Anwendung von antiproliferativem Cytosin-Arabinosid (Ara-C) verhinderte die Proliferation von Gliazellen in der deafferenzierten ML, hatte jedoch keinerlei Effekte auf das cholinerge Sprouting [10]. Das wirft die Frage auf, ob Gliaproliferation für das cholinerge Sprouting notwendig ist, und welche Vorgänge genau durch Gliaproliferation nach ECL beeinflußt werden. Insgesamt kann man sagen, daß Gliazellproliferation als Folge von Deafferenzierung ein Faktor sein kann, der das Ausmaß und die Qualität von neuronalen Reparaturmechanismen mitbestimmt, ob jetzt im Sinne einer für die Reparaturvorgänge zuträglichen oder hinderlichen Beeinflussung [10].

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